质粒的提取和纯化

1、质粒的提取和纯化,内 容,一.质粒的概念和提取原理 二.碱裂解法的实验操作和原理 三.煮沸法快速提取质粒的实验操作和原理 四.实验室使用的方法 五.质粒纯化后的检测,一.质粒的概念和提取原理,质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子,大小从1-200kb不等,为双链、闭环的DNA分子,并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中,它具有自主复制和转录能力,能在子代细胞中保持恒定的拷贝数,并表达所携带的遗传信息。质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质,如离开宿主细胞则不能存活,而宿主即使没有它们也可以正常存活 .,一.质粒的概念和提取原理,质粒在

2、细胞内的复制一般有两种类型: 紧密控制型(Stringent control) 松驰控制型(Relaxed control),一.质粒的概念和提取原理,在pH 12.0 12.6碱性环境中，细菌的线性大分子量染色体DNA变性分开，而共价闭环的质粒DNA虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。将pH调至中性并有高盐存在及低温的条件下，大部分染色体DNA、大分子量的RNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍然为可溶状态。通过离心，可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，然后用酚、氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。,实验中使用的三个溶液,1,溶液： 葡萄糖使悬浮

3、后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部. Tris.Cl (pH8.0)提供反应的最佳环境. EDTA (pH8.0) Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂,抑制DNase(脱氧核糖核酸酶)的活性和抑制微生物生长.,实验中使用的三个溶液,2,溶液：NaOH (临用前用10mol/L NaOH 母液稀释) 1 SDS 注:要新从浓NaOH稀释制备NaOH，是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性. NaOH细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化,瞬间就溶解. 当然SDS也是碱性的,但是很弱,只能抽提得到少量质粒 .,实验中使用的三个溶液,3,

4、溶液： KAc 冰醋酸 ddH2O 注:冰醋酸的作用是为了中和过量的NaOH. KAc是提供K+和SDS反应,取代Na离子,形成十二烷基硫酸钾 (PDS),而PDS是难溶于水的. SDS易和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了 ,同时长长的基因组DNA也一起被共沉淀了.但是SDS并不与DNA分子结合 .,二，碱裂解法的操作步骤,1,取培养至对数生长后期的含质粒的细菌培养液,高速离心,弃上清,将离心管倒置使上清液全部流尽。 2, 加入溶液I,充分悬浮菌体细胞。 3,加入新配制的溶液II, 盖紧瓶盖,缓缓地颠倒离心管数次,以充分混

5、匀内容物,冰浴5分钟。 4,加用冰预冷的溶液III, 摇动离心管数次以混匀内容物,冰上放置15分钟,此时应形成白色絮状沉淀。5,4下离心15分钟。,二，碱裂解法的操作步骤,6,取上清液,加入 RNA酶A, 37水浴20分钟。 7,加入等体积的饱和酚/氯仿,振荡混匀,4下高速离心10分钟。 8,取上层水相, 加入等体积氯仿,振荡混匀,4下高速离心10分钟。9,取上层水相,加入2倍体积的无水乙醇 ,室温放置几分钟 ,离心。 10,4下高速离心15分钟, 沉淀用数ml 70%冰冷乙醇洗涤,4下高速离心5分钟。 11,吸除上清液,将管倒置于卫生纸上使液体流尽,真空干燥10分钟或室温干燥 。 12,得到

6、的质粒样品一般用TE缓冲液或者ddH2O进行溶解.,注意的事项,一,在加溶液后:.时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；.必须温柔混合,不然基因组DNA也会断裂。 二,加入的酚必须要用氯仿和乙醇洗涤干净,否则对后面的实验有影响. 三,沉淀DNA也可用异丙醇(一般使用等体积),且沉淀完全,速度快,但常把盐沉淀下来,所以多数还是用乙醇。 四,提取质粒DNA过程中除去蛋白很重要,采用酚/氯仿去除蛋白效果较单独用酚或氯仿好,要将蛋白尽量除干净需多次抽提 .,三，煮沸法快速提取质粒的操作步骤,（1） 将 2ml 含相应抗生素的 LB 培养基加入到容量为 15ml 的试管中，接种

7、一单菌落，用棉塞封口，在 37 剧烈震荡（ 250rpm ）培养过夜。 （2） 将 1.5ml 培养物转入离心管中，在 4 条件下离心 30 秒。 （3） 弃上清液，用滤纸吸干离心管中的液体培养基，将细菌沉淀物悬浮于 200 m l STET 缓冲液（ 8% 蔗糖， 0.5%Triton, 50mmol/L EDTA,10mmol/L Tris ） ，用涡旋混合器充分混匀。 （4） 加入 4 m l 新鲜配制的溶菌酶液，混匀，置室温下 5min 。 （5） 用漂子架住离心管，置于沸水浴中，精确记时 45 秒，取出后立刻离心 10min 。,三，煮沸法快速提取质粒的操作步骤,（6） 用无菌牙签挑

8、取离心管中的沉淀物弃去，离心管的上清液中加入 8 m l 5%CTAB(十六烷基三甲基溴化氨) ，用混合器混匀后，高速离心 5min ，弃上清液，用滤纸吸干离心管中的液体。 （7） 加入 1.2M 氯化钠 300 m l ，充分溶解沉淀物，再加入 750 m l 的冷乙醇，充分混匀后，离心 15min ，弃上清液。 （8） 取 1ml 70% 冷乙醇，缓慢淋洗离心管内壁，离心 5min 。弃上清液，用滤纸吸干管壁上的液体，置室温中使核酸沉淀自然干燥 5-10min 。 （ 9 ） 沉淀物溶于 50 m l TE 缓冲液中， 混合器混匀 。 （10） 即成质粒制备液，制备的质粒供下一步实验使用.,四，实验室使用的操作步骤,1,取1.5ml含细菌的培养液,离心,弃上清,将离心管倒置使上清液全部流尽。 2,加入溶液I,充分悬浮菌体细胞。 3,加入新配制的溶液II, 盖紧瓶盖,缓缓地颠倒离心管数次,以充分混匀内容物,冰浴5分钟。 4,加用冰预冷的溶液III, 摇动离心管数次以混匀内容物,冰上放置15分钟,此时应形成白色絮状沉淀。 5,4下离心15分钟。,四，实验室使用的操作步骤,6,取上清液加新的离心管中. 7,加入纯化树脂,混匀,放置10min. 8,将溶液转移到离心纯化柱中,高速离心. 9,倒掉下管中的溶液,再加80%异丙醇,洗涤两次,每次离心30s,再干甩一次,2