流式细胞术的原理及应用

1流式细胞术的原理及应用临床实验诊断教研室施琼2流式细胞术（FLOWCYTOMETRY,FC/MFACS）是一种可以快速、准确、客观，并且同时检测单个微粒（通常是细胞）的多项特性的技术，同时可以对特定群体加以分选研究对象为生物颗粒，如各种细胞、染色体、微生物、及人工合成微球等研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并加以定量流式细胞术的概念3流式细胞仪特点单细胞悬液或生物颗粒分析速度高多参数精度高当代最先进的细胞定量分析技术4FACSCALIBUR特点光路调节系统固定自动化程度高操作简便使用寿命长配备12根激光细胞分选速度慢，主要用于细胞分析临床型（台式机）5BDLSR6FACSVANTAGEDIVA科研型（大型机）特点多数字化适用于各类细胞分选4路分选7FACSARIA科研型特点分辨率高选配多种波长和类型激光器可把感兴趣细胞分选到特定培养孔或板上（4路和24孔板）适用于高速分选和多色分析8流式细胞仪检测范围细胞大小细胞粒度细胞表面面积核浆比例DNA含量与细胞周期RNA含量蛋白质含量细胞结构特异性抗原（细胞表面/胞浆/核）细胞内细胞因子细胞活性酶活性激素结合位点细胞受体细胞功能9流式细胞术发展简史1934年，MOLDAVAN开创流式细胞自动计数的基础。1950S，COULTER公司设计细胞自动计数器，初步解决了流动细胞的通路问题。1965年，在细胞分选中应用了超声震动器。1969年，STANFORD、CALIFORNIA大学的研究组发明了第一台较满意的流式细胞仪。1972年，FACS型仪器试制成功，并在美国建国200周年纪念会上与人造卫星并列展示。10流式细胞仪的工作原理11FCM的工作系统1液流系统细胞悬液被吸入检测室后，在鞘液SHEATH的约束下，通过喷嘴，使其形成单细胞悬液。122光学系统激光是较常用的光源,稳定性好、单色性好。散射光和荧光信号被收集、处理转化为数字信号。3数据处理系统对实验数据分析、存储、显示。具有智能化、自动化特点。13流式细胞仪仪器结构液流系统光学系统激光光源光收集系统电子系统光电转换数据处理系统细胞分选系统14液流系统流动室、液流驱动系统INJECTORTIPFLUORESCENCESIGNALSFOCUSEDLASERBEAMSHEATHFLUID15液流中心由单列匀速运动颗粒组成的液柱16光学系统入射光系统激光LASER是一种相干光源，它能提供单一波长、单一方向、同步的稳定光照。发射光系统散射光和荧光光收集系统是由若干组透镜、滤波片和小孔组成,将产生的光信号引导至检测器17入射光激光光源单波长、高强度、高稳定性多采用氩离子激光器或氦氖激光器一般选配24根激光，488NM、633NM、355NM和407NMUV激光最多检测13个荧光参数1819发射光散射光信号前向散射光（FOWORDSCATTER,FS）在激光束正前方的检测器，用于检测细胞或其他粒子物体的表面属性，如大小、形状等。侧向散射光（SIDESCATTER，SS）与激光束垂直方向的检测器为侧向检测器，主要用于检测细胞内部结构属性，可获得细胞内超微结构和颗粒性质的参数。荧光信号20散射光FSC（小角散射光它反应细胞的相对大小和截面积的大小SSC90度角散射光代表细胞的颗粒度和精细结构的变化全血细胞流式FSCSSC图它反应细胞的物理特性,根据前侧向散射光，可以把不同类型的细胞群加以区分21FORWARDANGLELIGHTSCATTERFALSSENSORLASER2290DEGREELIGHTSCATTERFALSSENSOR90LSSENSORLASER23LASERFLUORESCENCEDETECTORSFREQFLUORESCENCEFALSSENSORFLUORESCENCEDETECTORPMT3,PMT4ETCPURDUEUNIVERSITYCYTOMETRYLABORATORIES24LONGPASSSHORTPASSBANDPASS460500540460500540460500540SP500LP500BP500/50光收集系统滤光片25电子系统光电倍增管（PMT）26FACSCALIBUR光路图27细胞分选系统28当含细胞的液滴逐个通过激光束时，受到两种检测器的检测如果液滴中含有细胞就会激活干涉检测器INTERFERENCEDETECTOR，只有带有荧光标记细胞的液滴才会激活荧光检测器FLUORESCENCEDETECTOR。当带有荧光标记的液滴通过激光束时，将两种检测器同时激活，引起液滴充电信号使鞘液带上负电荷。由于液滴带有负电荷，移动时就会向正极移动，进入到荧光标记细胞收集器中。细胞分选的原理29FLUORESCENCEACTIVATEDCELLSORTING488NMLASERCHARGEDPLATESSINGLECELLSSORTEDINTOTESTTUBESFALSSENSORFLUORESCENCEDETECTOR30信号检测荧光信号自发荧光特异荧光特异荧光能量级激发激发态发射激光能量损失31FALSSENSORLASER前向散射光32前向散射光33FALSSENSOR90LSSENSORLASER侧向散射光34侧向散射光35光路荧光信号每种荧光染料都有特定的激发波长和发射波长，流式细胞仪利用不同波长的光学滤片来检测这些特定发射波长的光学信号。长通滤片允许长于设定波长的光通过短通滤片允许短于设定波长的光通过带通滤片允许一定带宽波长的光通过二向色性滤片当以45O角放置滤片时,该滤片可以通过一定波长的光,同时也可以阻断并折射该波长以下的光36荧光信号荧光素吸收激光能量荧光素将吸收能量释放，转换为振动能和热能释放较入射光波长更长的光量子荧光素与特异抗体结合荧光抗体与细胞抗原结合越多，产生的荧光信号越强37LASERFORWARDLIGHTSCATTERSIZE90OLIGHTSCATTERGRANULARITYGREENFLUORESCENCEREDFLUORESCENCEALIVEORFIXEDCELLSINSINGLECELLSSUSPENSIONVIBRATINGFLOWCELLSHEATHFLUIDCOLLECTIONTUBESCELLSORTINGPRINCIPLEOFFLOWCYTOMETRYCOMPUTERFORDATAANALYSISANDRESULTDISPLAYFSCSSC38PMTPMTPMTPMT4DICHROICFILTERSBANDPASSFILTERSFLOWCYTOMETRYPRINCIPLELASER1234FLOWCELL3940常用荧光染料的特性荧光染料激发波长NM发射波长NM用途颜色FITC488525免疫荧光绿色PERD1488575免疫荧光橙色ECD488620免疫荧光橙红PECY5488675免疫荧光红PI488620DNA染色橙红PECY7488755免疫荧光深红PERCP488670APC63367041流式细胞仪的电子系统进行信号检测和分析当细胞携带荧光素标记物,通过激光照射区时受到激发,产生不同波长的、代表细胞内不同物质的荧光信号荧光信号由光电接收器接收，转变为电信号，可分析电压脉冲的高度、面积和宽度电脉冲信号经A/D转换成数字信号数字信号传送到计算机，进行储存、作图、统计分析42数据处理检测数据的显示视测量参数的不同有多种形式可供选择单参数数据以直方图的形式表达，其X轴为测量强度，Y轴为细胞数目。双参数或多参数数据既可以单独显示每个参数的直方图，也可以选择二维的散点图、等高线图、灰度图或三维立体视图。43流式细胞仪数据分析（1）直方图分析X轴代表荧光信号或散射光信号的强度，用“通道数”表示，可以与光强度之间线性关系或对数关系Y轴代表该通道内所出现具有相同光信号特征性细胞的频率单参数直方图（HISTOGRAM）44流式细胞仪数据分析（2）点图分析便于数据统计不同的细胞群可以用不同的颜色标记主要表达方式二维点图DOTPLOT45流式细胞仪数据分析（3）二维等高图和密度图46PSEUDO3DPLOT3DPLOT47流式细胞仪的应用48临床研究淋巴细胞亚群测定、血小板分析、网织红细胞分析、白血病和淋巴瘤免疫分型、造血干细胞移植监测、HLAB27分析、PNH诊断、人类同种异体器官移植中应用、细胞因子测定、AIDS诊断与治疗和疗效评价、FLOWFISH法测定端粒长度49基础研究淋巴细胞功能、树突状细胞（DC）研究、造血干细胞研究、细胞周期分析、细胞凋亡分析、凋亡相关蛋白分析、细胞功能研究、多药耐药基因研究（MDR）、肿瘤相关基因表达研究、RNA测定、DNA测定、总蛋白测定、癌基因和抑癌基因表达产物测定、血管内皮细胞研究50常用免疫荧光染料组合常用免疫荧光染料组合荧光染料激发波长（NM）发射波长（NM）颜色FITCPE488525、575绿色、橙色FITCPECY5488525、675绿色、红色FITCECD488525、625绿色、橙红色FITCPEPECY5488525、575、675绿色、橙色、红色FITCECDPECY5488525、625、675绿色、橙红色、红色51抗体的选择首选直接标记抗体根据仪器型号和抗原表达强弱合理选择荧光抗体PE最强，适用于弱表达抗原FITC最便宜，适用于强表达抗原使用双标以上抗体必做荧光补偿52光谱交叉EMISSIONWAVELENGTHNM530580630680730780FITCPEPETRPECY54COLORSSIMULTANEOUSCOLLECTION两色以上荧光分析存在光谱交叉53荧光补偿方法所有补偿调为“0”调节电压，用同型对照或阴性对照，使阴性群位于“左下角”依单阳群体调节荧光补偿54流式细胞术样品制备的要求制备单细胞悬液是流式细胞分析的基础。标本应新鲜；采用密度梯度离心分离外周血淋巴细胞，在分离和洗涤过程中应避免高速离心而致细胞膜结构破坏。常用溶血剂处理红细胞。温度和PH25370C，PH7072。制备实体组织标本的单细胞悬液时多采用机械法，而少用化学法或酶消化法。被检细胞或颗粒大小0280UM样品中至少20000个细胞，浓度105107个/毫升55实验对照的设计空白对照阴性对照常用同型抗体对照单色分析设同型抗体对照多色分析同型对照，单阳性对照（用于仪器校正）阳性对照检测阴性时56实验标本的处理单细胞悬液的制备胰酶消化抗体或标记分子的染色抗原抗体反应非特异结合的去除洗涤和封闭封闭血清和同型抗体57特别提醒注意荧光染料浓度的控制合适的荧光染料浓度是保证最佳信号产生的重要技术指标。1106/ML细胞，用20L荧光标记的单克隆抗体（011G/ML。常用固定剂细胞周期测定时应将细胞用PBS洗涤三次后用70冰乙醇固定，在40C保存数月；荧光染色后不能及时上机检测，可用14多聚甲醛固定，40C保存。58同型对照为阴性对照；实验中选用的大鼠或小鼠源性标记单抗，就一定选用相同源性的标记单抗作为同型对照来调整设置电流电压。上机前一般需过目200300目全程质控从样品制备和标记、溶血、洗涤、仪器质控和上机检测，需全程质控。59样品培养细胞新鲜组织石蜡包埋单细胞悬液标记荧光抗体检测表型测定细胞分选流式细胞术操作流程统计学分析继续培养60细胞周期分析（DNA倍体分析）61细胞周期、DNA倍体分析原理PI（碘化丙啶）是一种DNA结合剂，能非特异性嵌入到死细胞的DNA、RNA上；细胞经TRITONX100或NP40打孔，把染料引入细胞内，经过一段时间染色后，用FCM检测，可判断DNA的相对含量。62样品制备1000RPM5分钟收集2X106个细胞PBS漂洗两次70酒精4固定过夜收集固定的细胞PBS漂洗05MLPBS悬浮细胞25L10G/LRNASEA37消化1小时过300目细胞筛50L01MG/MLPI（含1TRITON，1000RPM5分钟离心两次混匀，室温静止5分钟上机63建立获取模式，获取数据（PI单染分析细胞周期，同时看凋亡）去甲斑蟊素对肝癌细胞周期的作用64G0G1SG2MFLUORESCENCEINTENSITYOFEVENTSATYPICALDNAHISTOGRAMOFCELLPROLIFERATION65数据分析圈门去除细胞碎片，分析细胞凋亡圈门去除粘连体，分析细胞周期66细胞凋亡分析67凋亡细胞的特点在形态上，早期细胞核固缩，染色体边集在核膜内侧显新月体形、核碎裂；细胞浆和细胞器密度增高、细胞体积变小；细胞膜皱折卷曲，但早期细胞膜的完整性未受到破坏凋亡细胞的FSC降低，SSC增加。细胞坏死时，细胞肿胀，FSC增大，SSC也增大68FCM在细胞凋亡检测中的应用DNA含量分析ANNEXIN检测法TUNEL检测与凋亡相关的蛋白测定，如APO27，BCL2,BAX,FAS,FASL等检测69DNA含量分析凋亡的细胞因核酸内切酶的活性增强，使DNA分裂成一些小片段，这些小片段因细胞膜的通透性的增加而漏出胞外，使凋亡细胞的DNA含量相对减少，因此在DNA的直方图上出现一个位于G1峰左侧的小峰（亚G1峰），称为AP峰。FCM的DNA分析检测细胞凋亡存在一定的局限性。比如，机械处理的肿瘤标本常有许多碎片，在DNA直方图上出现较宽的杂信号峰，使凋亡细胞被“淹没”其中，不少文献将G1峰前的所有信号均算为凋亡细胞，可能会过高计算凋亡细胞的数量；因此在评价细胞早期凋亡时，该指标不够灵敏。7071ANNEXIN磷脂结合蛋白作为探针识别细胞膜表面磷脂酰丝氨酸细胞凋亡早期，细胞表面发生变化，细胞膜内部的磷脂酰丝氨酸（PS）可以迁移到细胞外层表面。巨噬细胞就是通过识别凋亡细胞表面的磷脂酰丝氨酸将凋亡细胞或凋亡小体吞噬，保护机体避免因细胞内部暴露引起的炎症反应。ANNEXIN是一种CA离子依赖的、对PS有高度亲和力的磷脂结合蛋白，可作为探针识别细胞膜是否有PS而识别凋亡细胞，由于坏死细胞也可能在膜表面出现PS，故需要同时进行染料（PI）排斥实验，凋亡细胞膜完整，不能染色。ANNEXIN检测72ANNEXINV/PI双染活细胞为（ANNEXINV/PI）坏死细胞为（ANNEXINV/PI）凋亡细胞（ANNEXINV/PI）73细胞周期不能区分凋亡与死亡细胞SUBG0/G1PEAKSPISTAINING74PHOSPHATIDYLSERINEEXPOSUREONOUTERLEAFLETOFMEMBRANEBILAYERDURINGAPOPTOSIS75ANNEXINVASSAY建议用于悬浮细胞76ANNEXINVASSAY能够区分死亡与凋亡77ANNEXINVPE/7AAD双染色法双阴活细胞ANNEXINVPE单阳早期凋亡细胞双阳晚期凋亡细胞7AADD单阳坏死细胞784TERMINALDEOXYNUCLEOTIDYLTRANSFERASETDTMEDIATEDDUTPNICKENDLABELINGTUNELASSAYSCHEMATICREPRESENTATIONOFTHEPRINCIPLEOFTUNELASSAYTHEENZYMETDTCATALYSESATEMPLATEINDEPENDENTADDITIONOFBROMOLATEDDEOXYURIDINETRIPHOSPHATESBRDUTPTOTHE3HYDROXYLOHENDSOFDOUBLEANDSINGLESTRANDEDDNAAFTERBRDUTPINCORPORATION,DNABREAKSITESAREIDENTIFIEDBYAFITCLABELEDANTIBRDUMONOCLONALANTIBODYTUNEL检测79注意细胞凋亡FCM分析必须与形态学分析、DNA电泳等一系列常规检测方法结合，综合分析，才能给