辐照交联透明质酸凝胶性能的研究

辐照交联透明质酸凝胶性能的研究刘鹤张丽叶北京化工大学生命科学与技术学院，北京100029摘要透明质酸HA与甲基丙烯酸缩水甘油酯GMA接枝形成GMAHA衍生物，在60CO射线辐照环境下，GMAHA衍生物在水溶液中形成交联HA凝胶。流变学检测数据显示，交联HA凝胶的存储模量G显著高于损耗模量G，且对剪切频率的依赖性不明显，表现出了高弹性凝胶特征交联HA凝胶在水中稳定性较好，可吸收自身质量2050倍的水分，在分子量一定的情况下，交联HA凝胶的吸水量随着GMAHA质量分数和一定范围内辐照剂量的增加而减小咔唑显色法检测的糖醛酸结果显示，交联HA凝胶的抗氧化性和耐酶解性较交联前有很大提高在制备条件一定的情况下，环境PH值、温度是影响该交联HA凝胶抗氧化性、耐酶解性的主要因素。关键词交联流变学分析吸水性能抗氧化性耐酶解性中图分类号TQ050条件对该交联HA凝胶抗氧化性与耐酶解性的影响。引言透明质酸HA具有良好的保湿性、流变性和润滑性1。但是，临床应用发现天然HA在组织中易扩散，易被人体内的氧化物质或酶降解，很难满足某些特殊情况要求的黏弹性和稳定性，限制了HA在临床上的应用24。通常将HA进行适当交联，使HA黏弹性增强，水溶性减弱，降解时间延长。目前研究较多的交联方法主要采用化学交联剂，包括环氧化物、二乙烯基砜、甲醛等57，化学交联剂一般具有细胞毒性，残留的交联剂应用于人体时会产生不良反应8。高能射线辐照交联反应无需催化剂或引发剂，可获得纯度高且无毒的交联产物。将射线直接应用于HA交联时，由于能量较高，HA分子链产生大量自由基而断裂，辐照结果往往向降解方向进行。陈森军等9将甲基丙烯酸缩水甘油酯GMA接枝到HA链上引入双键，再用射线辐照的方法成功制备出具有高交联度的HA衍生物张丽等10采用分光光度法研究表明该交联衍生物是可降解的生物材料。在此基础上，本文从流变性能、吸水性能、抗氧化性能和耐酶解性能方面综合考察辐照法制备的交联HA凝胶，并从PH值、温度方面考察环境实验部分111原料和仪器111实验原料HA分子量30万，山东福瑞达生物制药有限公司GMA，分析纯，日本三菱公司三乙胺，分析纯，北京化学试剂公司四丁基溴化铵，分析纯，北京化学试剂公司双氧水，质量分数30，分析纯，北京化工厂透明质酸酶HASE，SIGMA公司咔唑，分析纯，国药集团化学试剂有限公司。112实验仪器CO60源，北京原子高科金辉辐射技术有限公司DF101S集热式恒温加热磁力搅拌器，河南省予华仪器有限公司1012A型电热鼓风干燥箱，天津市泰斯特仪器有限公司。哈克RS150多功能流变仪，美国HAAKE公司。交联HA凝胶的制备将HA溶解于适量去离子水中，以适当比例逐个添加GMA、三乙胺、四丁基溴化铵，室温搅拌24H，60保温接枝30MIN后用丙酮沉淀，将沉淀洗涤23次后干燥。将干燥后的样品配制成一定质量分数的溶液，在射线辐照强度20GY/MIN条件下进行辐照，即得交联HA凝胶。13分析方法12收稿日期20110425第一作者女，1985年生，硕士生通讯联系人EMAILLYZHANGMAILBUCTEDUCN131流变性能测试使用哈克RS150型多功能流变仪，在测试温度北京化工大学学报自然科学版2011年5025、应力50PA条件下对交联HA进行黏弹性测定，对照品为相同浓度的HA原料。132交联HA凝胶吸水性能测定取适量凝胶，放于50烘箱彻底干燥至恒重，称得质量为MD。将干燥后的凝胶置于去离子水中浸泡，吸水饱和后取出，擦干表面水分，反复吸水擦干直至称量为恒重，质量为MS。根据式1计算交联HA凝胶的吸水性能Q，吸水性能Q指每G凝胶吸收的水的质量，G/G。凝胶分子内的相互作用较强，结构比未交联的HA更稳定。HA交联后黏弹性的提高可以更好地符合其作为防治术后粘连材料、软组织填充材料等的性能要求1213。22制备条件对交联HA凝胶吸水性能的影响221GMAHA质量分数GMAHA质量分数对凝胶吸水性能的影响如表1所示。交联HA凝胶的吸水量保持在2050G/G之间。随着GMAHA质量分数的增加，单位体积内的GMAHA增多，分子相距较近，射线辐照时产生的自由基较多且相距较近，自由基相互碰撞结合几率大大增加，分子链之间缠绕紧密，形成交联度较高的凝胶，对外表现为吸水量少。表1GMAHA质量分数对交联HA凝胶吸水性能的影响QMSMD/MD1133交联HA凝胶抗氧化性和耐酶解性测定将样品置于冰水中冷却，缓慢滴加4、0025MOL/L四硼酸钠硫酸溶液，混匀后置于沸水浴中煮沸20MIN，冷却至室温。加入咔唑试剂025G咔唑溶于200ML无水乙醇02ML，混匀后置于沸水浴煮沸10MIN，冷却至室温。在570NM波长处测定吸光度。HA的降解产物葡萄糖醛酸在570NM波长处的吸光度与葡萄糖醛酸的量成正比。通过测定葡萄糖醛酸的量来反映HA凝胶的降解情况，进而反映该凝胶的抗氧化性能和耐酶解性能11。2结果与讨论TABLE1EFFECTOFGMAHACONTENTONTHEWATERUPTAKECAPABILITYOFTHECROSSLINKEDHAGELQ/GG1编号WGMAHA/1239152046833753091425257421交联HA凝胶的流变性分析交联前后HA的流变性如图1所示。纯HA的222辐照剂量辐照剂量对凝胶吸水性能的影响如表2所示。随着辐照剂量的增加，产生自由基增多，因而凝胶交联度升高，辐照剂量在520KGY之间时，交联HA凝胶吸水量随着辐照剂量的增加而降低。辐照剂量过高对实际操作没有太大意义，所以本文没有继续讨论。储存模量G随着剪切频率的增加而增加，G与损耗模量G出现了相交。交点之后G稍大于G，纯HA显示出了弱的黏弹性特征。表2TABLE2辐照剂量对交联HA凝胶吸水性能的影响EFFECTOFIRRADIATIONDOSAGEONTHEWATERUPTAKECAPABILITYOFTHECROSSLINKEDHAGEL编号辐照剂量/KGYQ/GG112345101520375227119931852图1G和G与剪切频率的关系FIG1THERELATIONSHIPBETWEENG，GANDSHEARINGFREQUENCYHA由GMA接枝后，经射线辐照，由原先的水溶性变为水不溶性的凝胶，且交联HA凝胶在吸水溶胀过程中状态稳定，没有出现变形、溶解等现象，由本法制备的交联HA凝胶在保持吸水性能的同时大大增加了其在水中的稳定性。交联HA凝胶的存储模量G远远大于损耗模量G，且当剪切频率变化时，G几乎不变，是聚合物凝胶典型的交联网络结构特征11。本文制备的辐照交联HA凝胶表现出了黏弹性材料的特性，说明该第6期刘鹤等辐照交联透明质酸凝胶性能的研究5123环境条件对交联HA凝胶的抗氧化性能的影响渐降低。高温环境下凝胶氧化降解快且降解率高，中、低温有利于凝胶抗氧化性能的保持。231纯HA与交联HA凝胶的抗氧化性比较纯HA和交联HA凝胶在双氧水作用下的氧化降解结果如图2所示。HA在3D时已经接近全部氧化降解。交联的HA凝胶在5D时氧化降解60左右。可见，本法制备的交联HA凝胶可被氧化降解，由于产生交联，其抗氧化能力较之纯HA大大提高。图4温度对HA凝胶抗氧化性的影响FIG4EFFECTOFTEMPERATUREONTHEANTIOXIDATIVECAPABILITYOFTHECROSSLINKEDHAGEL环境条件对交联HA凝胶的耐酶解性能的影响24241纯HA与交联HA凝胶的耐酶解性比较纯HA和交联HA凝胶在HASE作用下的酶解结果如图5所示。纯HA在3D时已经接近全部酶解。辐照后的交联HA凝胶在5D时酶解70左右。可见，由本法制备的交联HA凝胶可被酶降解，由于交联使其耐酶解能力较之纯HA大大提高。图2纯HA凝胶与交联HA凝胶的抗氧化情况FIG2ANTIOXIDATIVECAPABILITIESOFHAGELANDTHECROSSLINKEDHAGEL环境PH232PH值对交联HA凝胶抗氧化性的影响如图3。中性条件下，凝胶随着时间的延长接近匀速降解，5D时降解60左右。酸性环境中氧化降解相对缓慢，交联HA凝胶本身含有的酸性基团使其在酸性环境中更容易保持自身的稳定性14。碱性环境中，交联HA凝胶的抗氧化性有所提高。图5纯HA与交联HA凝胶的耐酶解性情况FIG5ANTIENZYMOLYSISCAPABILITIESOFHAGELANDTHECROSSLINKEDHAGEL242环境PHPH值对交联HA凝胶耐酶解性的影响如图6所示。中性条件下，交联HA凝胶的酶解情况随着时间的延长接近匀速降解。在酸性、碱性条件，交联HA凝胶的耐酶解性比在中性条件下更强。图3PH值对交联HA凝胶抗氧化性的影响FIG3EFFECTOFPHONTHEANTIOXIDATIVECAPABILITYOFTHECROSSLINKEDHAGEL233环境温度温度对交联HA凝胶抗氧化性的影响如图4。随着温度的升高，交联HA凝胶抗氧化降解能力逐243环境温度温度对交联HA凝胶耐酶解性的影响如图7。生理温度下，交联HA凝胶呈现近似匀速降解趋势。20条件下，交联HA凝胶酶解缓慢，低温环境下有北京化工大学学报自然科学版2011年52条件研究J食品科技，2007，3243235TANCF，WANGM，CHENXFSTUDYONDEGRADATIONMETHODSANDCONDITIONSOFHYALURONICACIDJFOODSCIENCEANDTECHNOLOGY，2007，3243235INCHINESE聂素云，卢文庆，冯晓健，等交联透明质酸的降解3及其释药性能J功能材料，2007，38增刊1910NIESY，LUWQ，FENGXJ，ETALDEGRADATIONANDDRUGRELEASINGPROPERTYOFCROSSLINKEDHAJJOURNALOFFUNCTIONALMATERIALS，2007，38SUPPL19071910INCHINESE于学丽，王传栋，李保陆，等透明质酸的改性及其应用J生物医学工程研究，2005，2416166YUXL，WANGCD，LIBL，ETALMODIFICATIONANDAAPPLICATIONOFHYALURONICACIDJJOURNALOFBIOMEDICALENGINEERINGRESEARCH，2005，2416166INCHINESE米鹏程，王伯初，冯薇，等二乙烯基砜交联透明质酸钠凝胶的制备及其生物相容性J中国组织工程研究与临床康复，2008，121426752678MIPC，WANGBC，FENGW，ETALPREPARATIONANDBIOCOMPATIBILITYOFSODIUMHYALURONATEGELCROSSLINKEDBYDIVINYLSULFONEJJOURNALOFCLINICALREHABILITATIVETISSUEENGINEERINGRESEARCH，2008，121426752678INCHINESE葛翠兰，朱彬，张雪雁，等交联透明质素特性的研1907图6PH值对交联HA凝胶耐酶解性的影响FIG6EFFECTOFPHONTHEANTIENZYMOLYSISCAPABILITYOFTHECROSSLINKEDHAGEL利于交联HA凝胶抗酶解性能的保持。高温环境下，交联HA凝胶降解迅速，酶解率较高，在实际应用中，相对于较高环境温度，可通过增加HA的交联度以提高其耐酶解性能。456图7温度对交联HA凝胶耐酶解性的影响FIG7EFFECTOFTEMPERATUREONTHEANTIENZYMOLYSISCAPABILITYOFTHECROSSLINKEDHAGEL究J中华生物医学工程杂志，2007，133143GECL，ZHUB，ZHANGXY，ETALPROPERTIESSTUDYOFCROSSLINKEDHYALURONANGELJCHINESEJOURNALOFBIOMEDICALENGINEERING，2007，133139143INCHINESEPRESTWICHGD，MARECAKDM，MARECEKJF，ETALCONTROLLEDCHEMICALMODIFIEATIONOFBYALURONICACIDSYNTHESIS，APPLICATIONS，ANDBIODEGRADATIONOFHYDRAZIDEDERIVATIVESJJOURNALOFCONTROLLEDRELEASE，1998，531/2/393103朱彬，葛翠兰，顾其胜气相色谱法检测交联透明质酸中交联剂残留量J生物医学工程学进展，2008，2912628ZHUB，GECL，GUQSGASCHROMATOGRAPHYANALYSISOFDIVINYLSULFONEINCROSSLINKEDHYALURONANGELSJPROGRESSINBIOMEDICALENGINEERING，2008，2912628INCHINESE陈森军，张丽叶辐照交联改性透明质酸的研究J139结论1HA经辐照交联形成了具有高黏弹性的不溶于水的凝胶。交联HA凝胶吸水量保持在2050G/G之间，随着GMAHA质量分数和一定范围内辐照剂量的增加而减小。2交联HA凝胶在氧化剂、酶解剂作用下，5D降解70左右，较之交联前3D全部降解的情况，HA的抗氧化性能和耐酶解性能在交联后大大提高。378参考文献1LIUYC，SHUXZ，PRESTWICHGDBIOCOMPATIBILITYANDSTABILITYOFDISULFIDECROSSLINKEDHYALURONANFILMSJBIOMATERIALS，2005，262347374746覃彩凤，王淼，陈晓峰透明质酸的降解方法及工艺92北京化工大学学报自然科学版，2009，36346第6期刘鹤等辐照交联透明质酸凝胶性能的研究5349CHENSJ，ZHANGLY基吡咯烷酮水凝胶的流变性J功能高分子学报，2000，134415417XIEXL，LIUXX，TONGZ，ETALRHEOLOGICALPROPERTIESOFPOLY1VINYL2PYRROLIDONEHYDROGELSASARTIFICIALVITREOUSBODYJJOURNALFUNCTIONALPOLYMERS，2000，134415417INCHINESE13ZHAOL，XUL，MITOMOH，ETALSYNTHESISOFPHSENSITIVEPVP/CMCHITOSANHYDROGELSWITHIMPROVEDSURFACEPROPERTYBYIRRADIATIONJCARBOHYDRATEPOLYMERS，2006，64347348014白绘宇，徐晶，李慧瑶，等透明质酸的制备及应用研究进展J广东化工，2010，3711243248BAIHY，XUJ，LIHY，ETALRESEARCHPROGRESSOFPREPARATIONANDAPPLICATIONOFHYALURONICACIDJGUANGDONGCHEMICALINDUSTRY，2010，3711243248INCHINESECROSSLINKINGOFHYALURONICACIDBYIRRADIATIONJJOURNALOFBEIJINGUNIVERSITYOFCHEMICALTECHNOLOGYNATURALSCIENCE，2009，3634649INCHINESE10张丽，张丽叶辐照交联透明质酸的降解特性研究J北京化工大学学报自然科学版，2009，36增刊4649ZHANGL，ZHANGLYDEGRADATIONCHARACTERISTICSOFHYALURONICACIDCROSSLINKEDBYIRRADIATIONJJOURNALOFBEIJINGUNIVERSITYOFCHEMICALTECHNOLOGYNATURALSCIENCE，2009，36SUPPL4649INCHINESE11JEONO，SONGSJ，LEEKJ，ETALMECHANICALPROPERTIESANDDEGRADATIONBEHAVIORSOFHYALURONICACIDHYDROGELSCROSSLINKEDATVARIOUSCROSSLINKINGDENSITIESJCARBOHYDRATEPOLYMERS，2007，70325125712谢小莉，刘新星，童真，等用作人工玻璃的聚乙烯PROPERTIESOFHYALURONICACIDCROSSLINKEDBYIRRADIATIONLIUHEZHANGLIYECOLLEGEOFLIFESCIENCEANDTECHNOLOGY，BEIJINGUNIVERSITYOFCHEMICALTECHNOLOGY，BEIJING100029，CHINAABSTRACTGLYCIDYLMETHACRYLATEGMAHASBEENGRAFTEDONTOHYALURONICACIDHATOFORMGMAHACONJUGATESAFTERTREATINGTHESOLUTIONOFGMAHADERIVATIVESWITH60COIRRADIATION，ACROSSLINKEDHAGELWASOBTAINE