浅谈毛细管电泳-电化学检测法及其在药物分析中的应用

1/17浅谈毛细管电泳电化学检测法及其在药物分析中的应用浅谈毛细管电泳电化学检测法及其在药物分析中的应用摘要本文介绍了毛细管电泳以及电化学检测法。叙述了各种分离模式和检测方法，并评述了近六年来，毛细管电泳电化学检测法在药物分析中的应用进展。关键词毛细管电泳；电化学检测法；药物分析；综述毛细管电泳具有分离效率高、快速和所需样品量少等特点。应用范围包括无机离子、有机分子及生物大分子和对映体等，在分析化学、生物化学、分子生物学、药物化学、食品化学、环境化学和医学许多领域，有着广阔的应用前景。毛细管电泳CE又称高效毛细管电泳HPCE或毛细管电分离法CESM，是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的新型液相分离分析技术，具有分离效率高理论塔板数已达106107/M、快速一般20MIN内即可完成一次电泳操作，甚至几分钟即可完成几十个阳离子或阴离子的分离、样品用量少仅需纳升级等特点。在近十几年中，CE受到分离分析科学家的极大关注，成为生物化学和分析化学中最受人瞩目、发展最快的一种分离分析新技术。1分离模式毛细管电泳按分离模式的不同主要可分为CZE,MEKC、CGE、CIEP、CITP、ACE亲和毛细管电泳、2/17CAE毛细管阵列电泳等。2检测技术CE的检测技术以其高效、微量、快速等特点引起了广泛的重视，因为毛细管内径极小通常为25100微米和纳升级的进样量，对检测器的灵敏度要求很高。检测是CE中的关键问题。目前己有多种检测器成功地用于CE中。检测器检出限MOL/L特点检测器检出限MOL/L特点紫外可见吸收激光光热荧光非相干光诱导激光诱导折射指数1051061071081071083/1710101012105107近似通用，常规应用灵敏度高受激光波长限制灵敏度高灵敏度高，价格高通用，简单，灵敏度低电导安培质谱放射间接紫外间接安培法1051071081091071091091011104105105106通用灵敏度高，选择性好，微量4/17仪器复杂，可获得结构信息灵敏度高，特殊操作CE中应用最广泛的是紫外/可见检测器，其灵敏度低，但通用性好，十分适合小分子的分析。缺点是受毛细管狭窄内径的限制，有效光程短，其灵敏度相对较低一般为105106MOL/L。激光诱导检测器灵敏度可比紫外可见检测器高1000倍，但是造价昂贵，且大多数样品需要衍生。联用技术是解决毛细管电泳定性问题的最佳方法。与CE联用的检测器必须有较小的体积和较高的灵敏度。己经有许多检测器被成功地运用于CE技术中，商品化仪器中常用的检测器主要是紫外可见检测器，但是毛细管的短光程严重限制了它的灵敏度1。激光诱导荧光检测器虽然灵敏度高，选择性好，缺点在于仅适合于具有荧光或易于进行荧光衍生的物质23。CEMS联用法灵敏度高，专属性强，能提供分子结构信息，是CE非常理想的一种检测器，但是价格昂贵4。电化学检测器与CE联用不仅可满足分析微量样品时灵敏度的要求，而且有良好的选择性，仪器造价低廉，易于普及。电化学检测对于大多数易于氧化还原物质的浓度检测限可达109MOL/L质量检测限可达1012MOL1018MOL。5/173CE电化学检测的基本模式CE电化学检测有三种基本模式安培法、电导法和电位法5。安培法测量化合物在电极表面受到氧化或还原时，失去或得到电子，产生与分析物浓度成正比的电极电流。电导法和电位法是测量两电极间由于离子化合物的迁移引起的电导率或电位变化。安培法是CEED中应用最广泛的一种检测技术。4毛细管电泳电化学检测法在药物分析中的应用近年来毛细管电泳在药物分析中的应用得到了迅速的发展。在中药材、中成药制剂、西药复方制剂及生物技术产品等药物和制剂的分离、鉴定和分析中，显示了高效果、快速的特点，正越来越受人们的重视。西药分析一般药物黄宝美、莫金垣6采用毛细管电泳柱端安培检测法测定了脂可平胶囊中的姜黄素。谢玉璇、谢天尧等7采用毛细管电泳电导法分离磺胺药物，磺胺嘧啶、磺胺甲嘧啶、磺胺二甲嘧啶3种结构相近磺胺药物。汪尔康8采用碳纤维电极CEED分离了局部麻醉要普鲁卡因和利多卡因。抗生素药物单瑞峰等9采用高效毛细管电泳电化学检测法测定了氯霉素针剂和氯霉素片中的氯霉素的含量。MALONE等10利用6/17CEED直接测定人血清中的丝裂霉素C。吴明嘉等11利用柱端检测模式测定了尿样中的异丙嗪。方禹之等以各种金属盘电极作检测电极用于双氢链霉素、小诺霉素、林可霉素、卡那霉素等九种多羟基抗生素的分离分析检测12,13,14。复方制剂CEED在药物分析中的另一应用是用来分离测定复方制剂中的有效成分。方禹之等用CEED分离分析测定复方磺胺类药物15、三磷酸腺苷16。手性分离当今化学和医学中，生物物质对映体的分离，特别是在生命界具有不同生物活性的对映体的分离，引起人们极大的研究兴趣。近年来CE在手性分离起着重要的作用，最主要因为它有以下优点1分离效率高，分离选择系数小的对映体可以达到很好的分离度；2可供选择的分离模式多且变换简单；3受性选择剂的消耗量小，运行成本低。近年来也有许多关于CDED用于手性分离的研究。HADWIGER等17利用CDED在含有环糊精的电泳液中分离了异丙肾上腺素的两个对映体。方禹之等18,19以环糊精作为手性试剂，利用该方法在强碱介质中直接分离了两种氨的衍生物，2氨基11，3丙二醇和2二甲基苯基11，3丙二醇。7/17中药材有效成分分析CE在中药及中成药分析中的应用虽然起步较晚,但发展十分迅速,目前应用范围以从生物碱类、黄酮类及其苷类、有机酸类扩展到香豆素类、苷类、酚酸类等多种成分的分析。这些成分都可以用CE进行分析。生物碱类生物碱是植物中一类重要的化学成分,在植物中分布较广。已知的生物碱种类至少在3000种以上,生物碱能解离带正电荷,可采用毛细管区带电泳进行分析。一般在植物中同类生物碱结构极为相似,有时PKA值相差也很小,因此在分离时,除可以根据PKA值的不同选择缓冲液PH值,还可根据结构上的细微差异适当加入一些添加剂以增加选择性和分离度。王峻梅等20以1MMOL/LHAC2MMOL/LNH4AC10MMOL/LCD2MMOL/LSDS缓冲液为电泳介质，分离电压，用高频电导法实现了对千金藤属植物粉防己中粉防己碱和去甲粉防己碱两种生物碱的测定。黄酮类黄酮类化合物是植物中普遍存在的植物次级代谢产物，具有多种药理作用，比如抗炎、抗菌、抗病毒、解痉、抗肿瘤以及在心血管系统等方面均具有生理活性2124。由于黄酮类化合物在药用方面的重要性，对于黄酮类化合物分8/17离分析则显得尤为重要。CAO等25,26采用CZEED测定了葛根、天麻中的葛根素、大豆甙元、天麻素等黄酮。CHEN等27,28采用CEED在碱性条件下测定了植物中的芦丁、槲皮素、黄芩素和黄琴甙等黄酮甙元和甙。彭友元等29利用毛细管电泳安培检测器分离测定了沙棘黄酮口服液中的芦丁和5羟色胺。陈刚等30用毛细管电泳电化学检测法测定了葛根和葛藤中葛根素、大豆甙元和芦丁含量。吴婷等31用毛细管电泳电化学检测法同时测定了益母草及三种益母草冲剂中的根皮苷、橙皮素、芦丁、山奈酚、洋芹素和槲皮素六种黄酮类化合物的含量。分离分析药材中的代表性成分，可以用于中药材的鉴别，比如黄芩苷和黄芩素是药用植物黄芩中的主要黄酮类成分，但在药用植物黄芪中不存在，通过定性定量分析确定黄芩苷及黄芩素两种化合物的存在与否及其含量可以用来鉴定黄芩和黄芪。CHEN等32用CEED检测了这两个化合物。有机酸类酚酸类经解理后带负电，可用CZE模式分离，但分析时间较长，在中性成分后出峰。在电解液中加入阳离子表面活性剂十二烷基三甲基氯化铵，使电渗流方向翻转，此时出峰顺序为负离子、中性分子、正离子，使酚酸类出峰时间大大缩短，毛细管等速电泳模式亦可用于酚酸类的分离。9/17CAO等33以CZEED法分析了满山红中原儿茶酸、丁香酸、香草酸等有机酸的含量。曾玉华、汪云34采用CEED法测定了胡黄连中香草酸和阿魏酸的含量。陈刚等35用CZEED法同时测定复方芦丁片及果汁中芦丁和L抗坏血酸的含量。苷类CAO等36以CZEED法分析了天麻中的天麻苷及其它7种成分。陈刚等37采用CZEED测定了黄芩中的黄芩素和黄芩苷。陈缵光38等采用毛细管电泳安培法测定鸡矢藤中熊果苷的含量。郑一宁等39采用毛细管电泳电导法检测法分离检测了双黄连粉针剂中黄芩苷的含量。酚类彭友元等40采用CEED法同时测定了烟草中的多元酚，即芦丁、绿原酸，槲皮素和咖啡酸。傅亮等41采用CEED检测法同时测定了蜘蛛香根中香叶木素、山奈酚、芹菜素、绿原酸和咖啡酸等5种主要生物活性成分的含量。糖类由于糖类结构极其相似，且缺少生色团，给它的分离与测定带来了困难。传统的糖类测定多采用滴定法，不仅速度慢，而且仅能测定糖类的总量，对于低含量成分测定结果也不准确。高效液相色谱法具有同时分离检测多种糖等优点42，但该方法须有专门的分离柱，价格昂贵，操作较10/17繁琐，其他检测手段多为灵敏度较低的紫外吸收。毛细管电泳分离效率高、分析速度快，仅需要价廉的石英毛细管、试剂、样品消耗也很小，因而运行成本低。电化学检测器的灵敏度比紫外检测器高，对于大多数易于氧化还原物质的浓度检测限比紫外低得多。因此CEED越来越多地被应用于分析如糖类等的缺少生色基团的分子。单瑞峰等43采用高效CEED同时测定了南瓜中的蔗糖、麦芽糖、葡萄糖、果糖的含量。傅崇岗等44采用CEED法同时测定了枣中的主要成分蔗糖、葡萄糖、果糖的含量。丁祥欢等45利用CEED技术分离测定牛膝多糖水解液中的葡萄糖、甘露糖和果糖3种单糖。农残分析王文雷等46用CEED法对对氧磷、甲基对硫磷、乙基对硫磷、扑灭松四种常见有机磷农药进行了分离检测。以乙酸乙酸钠缓冲液，PH值为,离子浓度为20MMOL/L,SDS胶束浓度为20MMOL/L,分离电压L2KV,工作电极检测电势为,此方法对4种农药的质量检测限较气相色谱法低34个数量级。中药物化参数的测定中药中很多成分是弱酸或弱碱性化合物，它们的物理化学常数与其性能及药理作用有直接的关系。比如解离常数PKA或PKB与药物穿过细胞膜的过程有相关性，这对药理11/17研究和新药开发都具有重要意义。采用CE测定中药活性成分的解离常数具有简单、快速、不需要纯样品等特点。宋立楠等47用高效毛细管电泳安培检测研究了核苷酸水解反应。方法运行时间短、样品需求量小，适用于生物样品的分析。冯海清等48利用自制微圆盘铜电极，建立了一种CEED同时测定色氨酸、丝氨酸和半胱氨酸PKA值的新方法。该方法简便、快速，测定值与文献值符合良好。张兰等49依据毛细管区带电泳的特性，推导出在不同PH条件下，有效淌度的倒数1/EFF与缓冲溶液中氢离子浓度H成线性关系，进而建立了用CEED法测定四种生物碱苯异丙胺、苯丙醇胺、麻黄碱和甲基麻黄碱电离常数的线性模型和测定方法，并测定PKA值。方禹之、叶建农等50,51,52分别利用CEED测定了糖类物质的解离常数和水解常数，所测定的值与文献值一致。中药指纹图谱研究鉴于中药本身的药理特性和成分复杂性，加之目前药材来源的多样性、生产工艺的不规范和分析要求的特殊性，中药的质量控制标准仍然是一个有待解决的国际性难题。从20世纪70年代将薄层扫描色谱用于中成药分析，到1990年版中国药典设置薄层色谱鉴别对照药材，再到20XX年国家药品监督局发布“中药注射剂在中药质量控制中的技术要求暂行”53，我国中医药界对指纹图谱在中药12/17质量控制中的作用已达到了重要的共识，并提出了多维多息特征谱和中药材特征性总成分指纹图等概念。孙国祥等54建立大青叶药材的电泳指纹图谱CEFP。所建立的CEFP具有较好的重现性，可用于大青叶药材的质量控制。利云55、王天松56分别对HPCE法在药物分析中的应用进行了评述和展望，并对其与HPLC法进行了比较，肯定了其在中药指纹图谱研究中的应用。目前，毛细管电泳法已被用于中草药中生物碱、黄酮黄酮苷、酚酸、香豆素、强心苷、皂苷、多肽、蛋白质等成分的分析。5结语CE由于其自身的特点，一出现就引起分离科学界的极大关注，目前CE的研究己进入了一个重要的发展阶段，被认为是二十世纪90年代分析科学最具活力的前沿研究课题。CE作为一种新型高效的分离技术，给现代生物医学提供了强有力的分离分析手段。CE的多种分离模式给样品分离提供了不同的选择机会，这对分离来源复杂的生物样品尤为有利。利用CE的快速分离特征，还可以研究植物生长环境如空间失重条件对中药质量的影响57。随着CE的不断发展和完善，将在中药分析、食品分析、环境监测等领域得到更广泛应用。参考文献13/171,3471912,6026423,4801414,634965,66527A6黄宝美、莫金垣毛细管电泳安培法测定脂可平胶囊中的姜黄素分析试验室第25卷第7期7谢玉璇，谢天尧毛细管电泳一电导法分离检测磺胺嘧啶、磺胺甲嘧啶和磺胺二甲嘧啶分析测试学报,L00L028周伟红、刘峻、丁建华、汪尔康，分析化学，238809单瑞峰毛细管电泳电化学检测测定药物制剂中的氯霉素的含量化学工程师10,661994378211辛慧君、刘峻、丁建华、汪尔康，分析化学，2388012方禹之、方晓明、叶建农，高等学校化学学报，16151413,32919964914,291996197515SHEAANAL,399199925917,B,681199624118方晓明、刘晓峰、叶建农、方禹之，高等学校化学学14/17报，181944，19,701998403020王峻梅毛细管电泳高频电导法测定粉防己药材中的生物碱分析试验室V0L23NO1220XX1221CASSADYJM，BAIRDWM，CHANGCJNATURALPRODUCTSASASOURCEOFPOTENTIALCANCERCHEMOTHERAPEUTICANDCHEMOPREVENTIVEAGENTSJJOURNALOFNATURALPRODUCT，1990，531234122LIUYL,HODK，ALIFORNICVMJJOURNALOFNATURALPRODUCTS，1992，55335736323毛雪石黄酮类化合物的抗肿瘤活性J国外医学药学分册，1995，222929624张德权，台建祥生物类黄酮的研究及应用概况J食品与发酵工业，1999，256525725,42512326,126152427,4236928,5347129彭友元，丁祥欢，叶建农沙棘黄酮口服液中芦丁和5羟色胺的毛细管区带电泳电化学检测J分析测试学报，15/1720XX，221767830陈刚,章慧琴,吴性良,等毛细管电泳电化学检测葛根和几种黄酮类化合物J，复旦大学自然科学版，20XX，43467267531吴婷毛细管电泳电化学检测益母草及其冲剂中的黄酮类化合物分析科学学报,40640932CHENG,YINGXY，ELECTROPHORESISWITHELECTROCHEMICALDETECTIONJANALYST，20XX，125581581833,4315334曾玉华、汪云毛细管电泳电化学检测法测定胡黄连中香草酸和阿魏酸的含量分析测试学报,35陈刚毛细管区带电泳电化学检测法测定药物及果汁中芦丁和L抗坏血酸高等学校化学学报,1364L36836,ANALYST20XX,126152437陈刚,李利军,叶建农等分析测试学报20XX,202638陈缵光等毛细管电泳安培法测定鸡矢藤中熊果苷的含量分析化学第30卷20XX年7月第7期，88639郑一宁等双黄连粉针剂中黄芩苷的高效毛细管电泳电导法测定分析测试学报,40彭友元等