高效液相色谱

.,高效液相色谱法,HighPerformanceLiquidChromatography，HPLC,.,高效液相色谱法（HPLC）是20世纪60年代末70年代初发展起来的一种新型分离分析技术，随着不断改进与发展，目前已成为应用极为广泛的化学分离分析的重要手段。它是在经典液相色谱基础上，引入了气相色谱的理论，在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，因而具备速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化的特点。为了更好地了解高效液相色谱法优越性，现从两方面进行比较：,第一节概述,.,1高效液相色谱法与经典液相色谱法,HPLC优点：高速、高效、高灵敏度、高自动化。高速是指在分析速度上比经典液相色谱法快数百倍。由于经典色谱是重力加料，流出速度极慢；而高效液相色谱配备了高压输液设备，流速最高可达10cm3min-1.如分离苯的羟基化合物，7个组分只需1min就可完成。对氨基酸分离，用经典色谱法，柱长约170cm，柱径0.9cm，流动相速度为30cm3h-1，需用20多小时才能分离出20种氨基酸；而用HPLC，只需lh之内即可完成。又如用25cm0.46cm的LichrosorbODS(5)的柱，采用梯度洗脱，可在不到0.5h内分离出尿中104个组分.,第一节概述,.,2HPLC与GC,(1)GC分析对象只限于分析气体和沸点较低的化合物，它们仅占有机物总数的20。对于占有机物总数近80的那些高沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质，目前主要采用HPLC进行分离和分析。(2)GC采用流动相是惰性气体，它对组分没有亲和力，即不产生相互作用力，仅起运载作用。而HPLC中流动相可选用不同极性的液体，选择余地大，它对组分可产生一定亲和力，并参与固定相对组分作用的剧烈竞争。因此，流动相对分离起很大作用，相当于增加了一个控制和改进分离条件的参数，这为选择最佳分离条件提供了极大方便。,第一节概述,.,(3)GC一般都在较高温度下进行的，而HPLC法则经常可在室温条件下工作。总之，HPLC是吸取了GC与经典液相色谱优点，并用现代化手段加以改进，因此得到迅猛的发展。目前HPLC已被广泛应用于分析对生物学和医药上有重大意义的大分子物质，例如蛋白质、核酸、氨基酸、多糖类、植物色素、高聚物、染料及药物等物质的分离和分析。HPLC主要缺点：仪器设备费用昂贵，操作严格。,第一节概述,.,3.液相色谱分离原理及分类,和GC一样，LC分离系统也由固定相和流动相组成。其固定相可以是吸附剂、化学键合固定相（或在惰性载体表面涂上一层液膜）、离子交换树脂或多孔性凝胶；流动相是各种溶剂。被分离混合物由流动相液体推动进入色谱柱。根据各组分在固定相及流动相中的吸附能力、分配系数、离子交换作用或分子尺寸大小的差异进行分离。色谱分离的实质是样品分子（以下称溶质）与溶剂（即流动相或洗脱液）以及固定相分子间的作用，作用力的大小，决定色谱过程的保留行为。根据分离机制不同，液相色谱可分为：液固吸附色谱、液液分配色谱、化合键合色谱、离子交换色谱以及分子排阻色谱等类型。,第一节概述,.,第二节高效液相色谱仪器,.,第二节高效液相色谱仪器,一、流程（processofHPLC）,首先高压泵将贮液器中流动相溶剂经过进样器送入色谱柱，然后从控制器的出口流出。当注入欲分离的样品时，流经进样器贮液器的流动相将样品同时带入色谱柱进行分离，然后依先后顺序进入,检测器，记录仪将检测器送出的信号记录下来，由此得到液相色谱图。,.,第二节高效液相色谱仪器,.,二、主要部件（mainassemblyofHPLC）,第二节高效液相色谱仪器,4（6）个主要部分：高压输液系统；脱气装置；梯度洗脱；进样系统；分离系统；检测系统；,此外还配有自动进样及数据处理等辅助装置。,.,第二节高效液相色谱仪器,.,1高压输液系统由于高效液相色谱所用固定相颗粒极细，因此对流动相阻力很大，为使流动相较快流动，必须配备有高压输液系统。它是高效液相色谱仪最重要的部件，一般由储液罐、高压输液泵、过滤器、压力脉动阻力器等组成。高压输液泵核心部件。压力：150350105Pa。应符合密封性好，输出流量恒定，压力平稳，可调范围宽，便于迅速更换溶剂及耐腐蚀等要求。,第二节高效液相色谱仪器,.,第二节高效液相色谱仪器,常用的输液泵分为恒流泵和恒压泵两种。恒流泵特点：在一定操作条件下，输出流量保持恒定而与色谱柱引起阻力变化无关；恒压泵特点：能保持输出压力恒定，但其流量则随色谱系统阻力而变化，故保留时间的重视性差。它们各有优缺点。目前恒流泵正逐渐取代恒压泵。恒流泵又称机械泵，它又分机械注射泵和机械往复泵两种，应用最多的是机械往复泵。,.,第二节高效液相色谱仪器,输液泵按工作方式分为气动泵和机械泵两大类。机械泵中又有螺旋传动注射泵、单活塞往复泵、双活塞往复泵和往复式隔膜泵。几种输液泵的基本性能见下表。,名称恒流或恒压脉冲更换流动相梯度洗脱再循环价格气动放大泵恒压无不方便需两台泵不可高螺旋传动注射泵恒流无不方便需两台泵不可中等单活塞往复泵恒流有方便可可较低双活塞往复泵恒流小方便可可高隔膜往复泵恒流有方便可可中等,.,第二节高效液相色谱仪器,（动画）,.,第二节高效液相色谱仪器,双活塞往复泵：如下图a所示，双活塞往复泵有一个精心设计的偏心凸轮，用同步电机或变速直流电机驱动偏心凸轮，偏心凸轮再推动两活塞作往复运动。偏心凸轮短半径端所对应的活塞向外伸，使该活塞的下单向阀打开吸入流动相，与此同时，偏心凸轮的长半径端所对应的另一活塞被推入，使其上单向阀打开，并将流动相送至色谱柱。于是，两活塞交替伸缩，往复运动，获得的排液特性如图b所示，即具有稳定的输出流量，这样就能避免单活塞泵液流脉冲的问题。,.,第二节高效液相色谱仪器,双活塞往复泵的输液流量比单活塞泵小得多。优点：不必使用消除脉冲的阻尼器，避免了阻尼器的压力消耗。缺点：设备成本较高，流量调节也比单活塞泵复杂。,双活塞往复泵的构造和排液特性,.,（动画）,第二节高效液相色谱仪器,优点：隔膜泵活塞不直接与流动相接触，故不存在活塞密封垫磨损对流动相的污染。隔膜泵死体积小（约0.1mL），因此，更换流动相后平衡快，利于梯度洗脱。缺点：结构较复杂，价格较贵，和单活塞机械往复泵一样，也产生脉冲，也需要配置阻尼装置来消除脉冲。,.,第二节高效液相色谱仪器,2.脱气装置流动相溶液往往因溶解有氧气或混入了空气而形成气泡。气泡进入检测器后会在色谱图上出现尖锐的噪音峰。小气泡慢慢聚集后会变成大气泡，大气泡进入流路或色谱柱中会使流动相的流速变慢或出现流速不稳定，致使基线起伏。气泡一旦进入色谱柱,排出这些气泡则很费时间。在荧光检测中,溶解氧还会使荧光淬灭。溶解气体还可能引起某些样品的氧化或使溶液pH值发生变化。,.,第二节高效液相色谱仪器,目前，液相色谱流动相脱气使用较多的是：离线超声波振荡脱气；在线惰性气体（氦气）鼓泡吹扫脱气；在线真空脱气。,真空脱气装置：将流动相通过一段由多孔性合成树脂膜制造的输液管，该输液管外有真空容器，真空泵工作时，膜外侧被减压，分子量小的氧气、氮气、,单流路真空脱气装置的原理,二氧化碳就会从膜内进入膜外而被脱除。一般真空脱气装置有多条流路，可同时对多个溶液进行脱气。,.,第二节高效液相色谱仪器,.,第二节高效液相色谱仪器,3.梯度洗脱装置在进行多成分的复杂样品的分离时，经常会碰到前面的一些成分分离不完全，而后面的一些成分分离度太大，且出峰很晚和峰型较差。为了使保留值相差很大的多种成分在合理的时间内全部洗脱并达到相互分离，往往要用到梯度洗脱技术。HPLC的梯度洗脱是指流动相梯度，即在分离过程中改变流动相的组成或浓度。,线性梯度;阶梯梯度,高压梯度,低压梯度,.,第二节高效液相色谱仪器,高压梯度装置结构,优点：只要通过梯度程序控制器控制每台泵的输出，就能获得任意形式的梯度曲线，而且精度很高，易于实现自动化控制。缺点：使用了两台高压输液泵，使仪器价格变得更昂贵，故障率也相对较高，而且只能实现二元梯度操作。,.,第二节高效液相色谱仪器,四元低压梯度系统结构,只需一个高压泵，混合就在泵前安装了一个比例阀中完成。因比例阀是在泵之前，所以是在常压（低压）下混合，在常压下混合易形成气泡，常配置在线脱气装置，来自于四种溶液瓶的四根输液管分别与真空脱气装置的四条流路相接，经脱气后进入比例阀，混合后从一根输出管进入泵体。,.,第二节高效液相色谱仪器,梯度淋洗装置,外梯度:利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。内梯度:一台高压泵,通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。,.,4进样系统,HPLC柱比GC柱短得多（约530cm），所以柱外展宽（又称柱外效应）较突出。柱外展宽是指色谱柱外的因素所引起的峰展宽，主要包括进样系统、连接管道及检测器中存在死体积。柱外展宽可分柱前和柱后展宽。进样系统是引起柱前展宽的主要因素，因此HPLC法中对进样技术要求较严。流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置。结构如图所示：,第二节高效液相色谱仪器,.,第二节高效液相色谱仪器,（动画）,.,5.分离系统色谱柱,色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括柱管与固定相两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑的聚合材料的其他金属。玻璃管耐压有限，故金属管用得较多。一般色谱柱长530cm，内径为45mm，凝胶色谱柱内径312mm，制备柱内径较大，可达25mm以上。一般在分离前备有一个前置柱，前置柱内填充物和分离柱完全一样，这样可使淋洗溶剂由于经过前置柱为其中的固定相饱和，使它在流过分离柱时不再洗脱其中固定相，保证分离柱的性能不受影响。,第二节高效液相色谱仪器,.,第二节高效液相色谱仪器,柱子装填得好坏对柱效影响很大。对于细粒度的填料（20m）一般采用匀浆填充法装柱，先将填料调成匀浆，然后在高压泵作用下，快速将其压入装有洗脱液的色谱柱内，经冲洗后，即可备用。,一般柱体为直型不锈钢管，内径16mm，柱长540cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。,.,6检测系统,在液相色谱中，有两种基本类型的检测器。一类是溶质性检测器，它仅对被分离组分的物理或化学特性有响应，属于这类检测器的有紫外、荧光、电化学检测器等。另一类是总体检测器，它对试样和洗脱液总的物理或化学性质有响应，属于这类检测器的有示差折光，电导检测器等。,第二节高效液相色谱仪器,.,（l）紫外检测器应用最广，对大部分有机化合物有响应。其特点：灵敏度高；线形范围高；流通池可做的很小（1mm10mm，容积8L）；对流动相的流速和温度变化不敏感；波长可选，易于操作；可用于梯度洗脱。,第二节高效液相色谱仪器,.,第二节高效液相色谱仪器,UV/Visdetecter,.,第二节高效液相色谱仪器,(2)光电二极管阵列检测器,紫外检测器的重要进展；光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。,.,第二节高效液相色谱仪器,.,第二节高效液相色谱仪器,Photodiodearraydetecter,.,第二节高效液相色谱仪器,光电二极管阵列检测器,.,二极管阵列检测器（DAD）优点：,第二节高效液相色谱仪器,1.可实施一个样品的全波长扫描，方便快速确定最佳吸收波长。2.可同时给出紫外光谱和色谱图，便于组分定性和定量。3.提供多种色谱峰纯度判断方法，包括：等高线图法、光谱色谱三维图法、重叠光谱图法、波长比图法和色谱峰纯度计算法等。可进行峰的纯度检测。4.可提供各种类型的色谱图，其中包括：单波长色谱图、任意两个波长的吸收比色谱图、波长时间程序色谱图、最大吸收波长色谱图以及总体吸收色谱图。其中最大吸收波长色谱图为灵敏度最高的检测方式，而总体吸收色谱图为定量重复性最好的方法。,.,第二节高效液相色谱仪器,(3)示差折光率检测器（differentialrefractiveindexdetector）,除紫外检测器之外应用最多的检测器；可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。差值与浓度呈正比；几乎所有物质都有各自不同的折射率，因此差示折光检测器是一种通用型检测器。灵敏度可达10-7gcm-3。主要缺点：对温度变化敏感，灵敏度低、并且不能用于梯度淋洗。分类：偏转式、反射式和干涉型三种；,.,第二节高效液相色谱仪器,示差折光检测器,.,第二节高效液相色谱仪器,.,第二节高效液相色谱仪器,（4）荧光检测器（fluorescencedetector）,特点：高灵敏度、高选择性；对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应；,.,第二节高效液相色谱仪器,（5）电导检测器conductometricdetector测量溶剂电导率，特别适合于离子溶液。,（6）电化学检测器electrochemicaldetector,.,第二节高效液相色谱仪器,（7）电流检测器Amperometricdetector,（8）蒸发光散射检测器（ELSD）Evaporativelightscatteringdetector,由雾化器、加热漂移管（溶剂蒸发室）、激光光源和光检测器（光电转换器）等部件构成。,.,色谱柱流出液导入雾化器，被载气（压缩空气或氮气）雾化成微细液滴，液滴通过加热漂移管时，流动相中的溶剂被蒸发掉，只留下溶质，激光束照在溶质颗粒上产生光散射，光收集器收集散射光并通过光电倍增管转变成电信号。因为散射光强只与溶质颗粒大小和数量有关，而与溶质本身的物理和化学性质无关，所以ELSD属通用型和质量型检测器。适合于无紫外吸收、无电活性和不发荧光的样品的检测。其灵敏度与载气流速、汽化室温度和激光光源强度等参数有关。与示差折光检测器相比，它的基线漂移不受温度影响，信噪比高，也可用于梯度洗脱。,第二节高效液相色谱仪器,.,第二节高效液相色谱仪器,蒸发光散射检测器原理（动画）,.,。,.,一、液-固吸附色谱法(LSAC)liquid-solidadsorptionchromatography,液-固吸附色谱是以固体吸附剂作为固定相。吸附剂通常是些多孔的固体颗粒物质，在它们的表面存在吸附中心。液固色谱实质是根据物质在固定相上的吸附作用不同来进行分离的。,第三节HPLC分离类型与原理,固定相：固体吸附剂为，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是510m的硅胶吸附剂；流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。,.,1分离原理当流动相通过固定相（吸附剂）时，吸附剂表面的活性中心就要吸附流动相分子。同时，当试样分子（X）被流动相带入柱内，只要它们在固定相有一定程度的保留就要取代数目相当的已被吸附的流动相溶剂，于是在固定相表面发生竞争吸附:X+nSad=Xad+nS,第三节HPLC分离类型与原理,.,第三节HPLC分离类型与原理,达平衡时,有,其中Kad为吸附平衡常数，值大表示组分在吸附剂上保留强，难于洗脱。Kad值小,则保留值弱，易于洗脱。试样中各组分据此得以分离。Kad值可通过吸附等温线数据求出。,适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有官能团的化合物和异构体有较高选择性；缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾；,.,2固定相,吸附色谱所用固定相多是一些吸附活性强弱不等的吸附剂，如硅胶、氧化铝、聚酸胶等。由于硅胶的优点较多，如线性容量较高，机械性能好，不溶胀，与大多数试样不发生化学反应等，因此，以硅胶用得最多。在HPLC中，表面多孔型和全多孔型都可作吸附色谱中的固定相，它们具有填料均匀、粒度小。孔穴浅的优点，能极大地提高柱效。但表面多孔型由于试样容量较小，目前最广泛使用的还是全多孔型微粒填料。,第三节HPLC分离类型与原理,.,3.流动相,一般把吸附色谱中流动相称作洗脱剂。在吸附色谱中：对极性大的试样往往采用极性强的洗脱剂；对极性弱的试样宜用极性弱的洗脱剂。洗脱剂的极性强弱可用溶剂强度参数（0）来衡量。0越大，表示洗脱剂的极性越强。下表列出一些常用溶剂在氧化铝吸附剂中的0值。在硅胶吸附剂中0值的顺序相同，数值可换算（0硅胶=0770氧化铝）。,第三节HPLC分离类型与原理,.,第三节HPLC分离类型与原理,.,第三节HPLC分离类型与原理,在液-液色谱中,流动相和固定相都是液体（互不相溶）。它能适用于各种样品类型的分离和分析，无论是极性的和非极性的，水溶性和油溶性的，离子型的和非离子型的化合物。1分离原理液液分配色谱的分离原理基本与液液萃取相同，都是根据物质在两种互不相溶的液体中溶解度的不同，具有不同的分配系数。,二、液一液分配色谱法（LLPC）liquid-liquidpartitionchromatography,.,第三节HPLC分离类型与原理,所不同的是液液色谱的分配是在柱中进行的，使这种分配平衡可反复多次进行，造成各组分的差速迁移，提高了分离效率，从而能分离各种复杂组分。2.固定相由于液液色谱中流动相参与选择竞争，因此，对固定相选择较简单。只需使用几种极性不同的固定液即可解决分离问题。例如，最常用的强极性固定液，氧二丙睛，中等极性的聚乙二醇，非极性的角鲨烷等。,.,固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用；为了更好解决固定液在载体上流失问题。产生了化学键合固定相。化学键合固定相：将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。C-18柱（反相柱）。它将各种不同有机基团通过化学反应键合到载体表面代替了固定液的机械涂渍，因此它的产生对液相色谱法迅速发展起着重大作用，可以认为它的出现是液相色谱法的一个重大突破。它是目前应用最广泛的一种固定相。据统计，约有3/4以上的分离问题是在化学键合固定相上进行的。,第三节HPLC分离类型与原理,.,在液液色谱中为了避免固定液的流失。对流动相的一个基本要求是流动相尽可能不与固定相互溶，而且流动相与固定相的极性差别越显著越好。根据所使用的流动相和固定相的极性程度，将其分为正相分配色谱和反相分配色谱。正相分配色谱normalphase：采用流动相的极性小于固定相的极性，它适用于极性化合物的分离。其流出顺序是极性小的先流出，极性大的后流出。反相分配色谱reversephase：采用流动相的极性大于固定相的极性。它适用于非极性化合物的分离，其流出顺序与正相色谱恰好相反。,第三节HPLC分离类型与原理,3流动相,.,三、化学键合相色谱法（CBPC）chemicalbondedpartitionchromatography,采用化学键合相的液相色谱称为化学键合相色谱法，简称键合相色谱。由于键合固定相非常稳定，在使用中不易流失，适用于梯度淋洗，特别适用于分离容量因子k值范围宽的样品。由于键合到载体表面的官能团可以是各种极性的，因此它适用于种类繁多样品的分离。,第三节HPLC分离类型与原理,.,第三节HPLC分离类型与原理,1键合固定相类型,用来制备键合固定相的载体，几乎都用硅胶。利用硅胶表面的硅醇基(Si一OH)与有机物可成键,即可得到各种性能的固定相。一般可分三类：（1）极性键合固定相（极性基团）：键合在载体表面的功能分子是具有二醇基、醚基、氰基、氨基等极性基团的有机分子。,.,第三节HPLC分离类型与原理,（2）非极性键合固定相（疏水基团）：键合在载体表面的功能分子是烷基、苯基等非极性有机分子。如最常用的ODS（OctaDecyltrichloroSilane）柱或C18柱，它是将十八烷基三氯硅烷通过化学反应与硅胶表面的硅羟基结合，在硅胶表面形成化学键合态的十八烷基，其极性很小。（3）离子交换基团如作为阴离子交换基团的胺基，季镀盐；作为阳离子交换基团的磺酸等.,.,2键合固定相的制备（l）硅酸酯（Si一OR）键合固定相,它是最先用于液相色谱的健合固定相。用醇与硅醇基发生酯化反应：SiOHROHSiORH20由于这类键合固定相的有机表面是一些单体，具有良好的传质特性,但这些酯化过的硅胶填料易水解且受热不稳定，因此仅适用于不含水或醇的流动相。（2）SiC或Si一N共价键合固定相制备反应如下,第三节HPLC分离类型与原理,.,共价键健合固定相不易水解，且热稳定较硅酸酯好。缺点是格氏反应不方便；当使用水溶液时，必须限制pH在48范围内.,第三节HPLC分离类型与原理,.,（3）硅烷化（SiOSiC）键合固定相制备反应如下：,这类键会固定相具有热稳定好，不易吸水，耐有机溶剂的优点。能在70以下，pH=28范围内正常工作，应用较广泛.,第三节HPLC分离类型与原理,.,3反相键合相色谱法,此法的固定相是采用极性较小的键合固定相，如硅胶C18H37、硅胶苯基等；流动相是采用极性较强的溶剂，如甲醇、乙腈、水和无机盐的缓冲溶液等。它多用于分离多环芳烃等低极性化合物；若采用含一定比例的甲醇或乙腈的水溶液为流动相，也可用于分离极性化合物；若采用水和无机盐的缓冲液为流动相，则可分离一些易离解的样品，如有机酸、有机碱、酚类等。反相键合相色谱法具有柱效高，能获得无拖尾色谱峰的优点。,第三节HPLC分离类型与原理,.,3反相键合相色谱法,第三节HPLC分离类型与原理,.,关于反相键合相色谱的分离机理，可用所谓疏溶剂作用理论来解释。这种理论把非极性的烷基键合相看作一层键合在硅胶表面上的十八烷基的“分子毛”，这种“分子毛”有较强的疏水特性。当用极性溶剂为流动相来分离含有极性官能团的有机化合物时，一方面，分子中的非极性部分与固定相表面上的疏水烷基产生缔合作用，使它保留在固定相中；而另一方面，被分离物的极性部分受到极性流动相的作用，促使它离开固定相，并减小其保留作用，见下图。显然，两种作用力之差，决定了分子在色谱中的保留行为。,第三节HPLC分离类型与原理,.,第三节HPLC分离类型与原理,.,4.正相键合相色谱法,此法是以极性的有机基团，CN、NH2双羟基等键合在硅胶表面，作为固定相；而以非极性或极性小的溶剂（如烃类）中加入适量的极性溶剂（如氯仿、醇、乙腊等）为流动相，分离极性化合物。此时，组分的分配比k值随其极性的增加而增大，但随流动相极性的增加而降低。这种色谱方法主要用于分离异构体、极性不同的化合物，特别适用于分离不同类型的化合物。,第三节HPLC分离类型与原理,.,5.离子性键合相色谱法,当以薄壳型或全多孔微粒型硅胶为基质，化学键合各种离子交换基团，如一SO3H一CH2NH2、COOH、一CH2N（CH3）等时，就形成了离子性键合相色谱的固定相；流动相一般采用缓冲溶液。其分离原理与离子交换色谱类同。,第三节HPLC分离类型与原理,.,键合相色谱的最大优点：通过改变流动相的组成和种类，可有效地分离各种类型化合物（非极性、极性和离子型）。此外，由于键合到载体上的基团不易流失，特别适用于梯度淋洗。据统计，在高效液相色谱法中，约有80的分离问题是用键合相色谱法解决。此法的最大缺点：不能用于酸、碱度过大或存在氧化剂的缓冲溶液作流动相的体系。如何根据样品极性种类来选择化学键合的固定相，见下表。,第三节HPLC分离类型与原理,.,第三节HPLC分离类型与原理,.,四、离子交换色谱法（IEC）ion-exchangechromatography,此法是利用离子交换原理和液相色谱技术的结合来测定溶液中阳离子和阴离子的一种分离分析方法。凡在溶液中能够电离的物质，通常都可用离子交换色谱法进行分离。它不仅适用无机离子混合物的分离，亦可用于有机物的分离。,例如氨基酸、核酸、蛋白质等生物大分子。因此，应用范围较广。,第三节HPLC分离类型与原理,.,1离子交换原理离子交换色谱法是利用不同待测离子对固定相亲和力的差别来实现分离的。其固定相采用离子交换树脂，树脂上分布有固定的带电荷基团和可游离的平衡离子。当待分析物质电离后产生的离子可与树脂上可游离的平衡离子进行可逆交换，其交换反应通式如下：阳离子交换：,阴离子交换：,一般形式：RABRBA,第三节HPLC分离类型与原理,.,达平衡时，以浓度表示的平衡常数（离子交换反应的选择系数）：,式中Ar，Br分别代表树脂相中洗脱剂离子（A）和试样离子（B）的浓度，A、B则代表它们在溶液中的浓度。离子交换反应的选择性系数见从表示试样离子B对于A型树脂亲和力的大小：KB/A越大，说明B离子交换能力越大，越易保留而难于洗脱。一般说来，B离子电荷越大，水合离子半径越小，KB/A值就越大。,第三节HPLC分离类型与原理,.,对于典型的磺酸型阳离子交换树脂，一价离子的KB/A值按以下顺序：Cs+Rb+K+NH4+Na+H+Li+二价离子的顺序为：Ba2+Pb2+Sr2+Ca2+Cd2+Cu2+Zn2+Mg2+对于季铝型强碱阴离子交换树指，各阴离子的选择性顺序为：ClO4-I-HS04-SCN-NO2-Br-CN-Cl-BrO3-OH-HCO3-H2P04-IO3-CH3COOF,第三节HPLC分离类型与原理,.,2固定相作为固定相的离子交换剂，其基质大致有三大类：合成树脂（聚苯乙烯）、纤维素和硅胶。而离子交换剂又有阳离子和阴离子之分。再根据官能基的离解度大小还有强弱之分。,第三节HPLC分离类型与原理,.,常用的离子交换剂固定相大致可分以下几种：（l）多孔型离子交换树脂它主要是聚苯乙烯和二乙烯苯基的交联聚合物，直径约为520m，有微孔型和大孔型之分。（2）薄膜型离子交换树脂它是在直径约对30m的固体情性核上，凝聚12m厚的树脂层。,第三节HPLC分离类型与原理,.,第三节HPLC分离类型与原理,（3）表面多孔型离子交换树脂,它是在固体情性核上，覆盖一层微球硅胶，再在上面涂一层很薄的离子交换树脂。,（4）离子交换键合固定相,它是用化学反应将离子交换基团键合到惰性载体表面。它也分为两种类型。一种是键合薄壳型，其载体是薄壳玻珠。另一种是键合微粒载体型，其载体是多孔微粒硅胶。后者是一种优良的离子交换固定相，它的优点是机械性能稳定，可使用小粒度固定相和高柱压来实现快速分离。,.,3流动相,离子交换色谱法所用流动相大都是一定pH和盐浓度（或离子强度）的缓冲溶液。通过改变流动相中盐离子的种类、浓度和pH值可控制k值，改变选择性。如果增加盐离子的浓度，则可降低样品离子的竞争吸附能力，从而降低其在固定相上的保留值。对于阴离子交换树脂来说，各种阴离子滞留次序为：柠檬酸离子SO42C2O42-I-NO3-CrO42-Br-SCN-Cl-HCOO-CH3COO-OH-F-所以用柠檬酸离子洗脱要比用氟离子快。,第三节HPLC分离类型与原理,.,第三节HPLC分离类型与原理,阳离子的滞留次序大为：Ba2+Pb2+Ca2+Ni2+Cd2+Cu2+Co2+Zn2+MgAg+Cs+Rb+K+NH4+Na+H+Li十但差别不如阴离子明显。关于pH值的影响，要视不同情况而定。例如，分离有机酸和有机碱时，这些酸碱的离解程度可通过改变流动相的pH值来控制。增大pH值会使酸的电离度增加，使碱的电离度减少；降低pH值，其结果相反。但无论属于哪种情况，只要电离度增大，就会使样品的保留增大。,.,六、离子对色谱法（IPC）ionpairchromatography,离子对色谱法是分离分析强极性有机酸和有机碱的极好方法。它是离子对革取技术与色谱法相结合的产物。在20世纪70年代中期，Schill等人首先提出离子对色谱法，后来，这种方法得到十分迅速的发展。1离子对色谱法原理离子对色谱法是将一种（或数种）与溶质离子电荷相反的离子（称对离子或反离子）加到流动相或固定相中，使其与溶质离子结合形成离子对，从而控制溶质离子保留行为的一种色谱法。,第三节HPLC分离类型与原理,.,第三节HPLC分离类型与原理,关于离子对色谱机理，至今仍不十分明确，已提出三种机理：离子对形成机理；离子交换机理；离子相互作用机理。现以离子对形成机理说明之。假如有一离子对色谱体系，固定相为非极性键合相，流动相为水溶液，并在其中加入一种电荷与组分离子A-相反的离子B+，B+离子由于静电引力与带负电的人组分离子生成离子对化合物A-B+。离子对生成反应式,.,由于离子对化合物A-B+具有疏水性，因而被非极性固定相（有机相）提取。组分离子的性质不同，它与反离子形成离子对的能力大小不同以及形成的离子对流水性质不同，导致各组分离子在固定相中滞留时间不同，因而出峰先后不同。这就是离子对色谱法分离的基本原理。,第三节HPLC分离类型与原理,.,2键合相反相离子对色谱法离子对色谱法类型很多，根据流动相和固定相的极性可分为反相离子对和正相离于对色谱法。其中以键合相离子对色谱法最重要。这种色谱法的固定相采用非极性的疏水键合相如十八烷基键合相（ODS）等，流动相为加有平衡离子（反离子）的极性溶液（如甲醇-水或乙睛-水）。根据离子对生成反应式，平衡常数KAB可表示为,第三节HPLC分离类型与原理,.,根据上两式，有,式中为相比率。容量因子k随KAB和B+水相的增大而增大。键合相反相离子对色谱法操作简便，只要改变流动相的pH值、平衡离子的浓度和种类，就可在较大范围内改变分离的选择性，能较好解决难分离混合物的分离问题。此法发展迅速，应用较广泛.,根据定义，溶质的分配系数,第三节HPLC分离类型与原理,.,第三节HPLC分离类型与原理,阴离子分离：常采用烷基铵类，如氢氧化四丁基铵或氢氧化十六烷基三甲铵作为对离子；阳离子分离：常采用烷基磺酸类，如己烷磺酸钠作为对离子；,.,七、尺寸排阻色谱法（SEC）size-exclusionchromatography,尺寸排阻色谱法又称凝胶色谱法，主要用于较大分子的分离。与其他液相色谱方法原理不同，它不具有吸附、分配和离子交换作用机理，而是基于试样分子的尺寸和形状不同来实现分离的。尺寸排阻色谱被广泛应用于大分子的分级，即用来分析大分子物质相对分子质量的分布。,第三节HPLC分离类型与原理,.,第三节HPLC分离类型与原理,尺寸排阻色谱具有其他液相色谱所没有的特点：（1）保留时间是分子尺寸的函数，有可能提供分子结构的某些信息。（2）保留时间短，谱峰窄，易检测，可采用灵敏度较低的检测器（3）固定相与分子间作用力极弱，趋于零。由于柱子不能很强保留分子，因此柱寿命长。（4）不能分辨分子大小相近的化合物，相对分子质量差别必须大于10才能得以分离。,.,1分离原理尺寸排阻色谱是按分子大小顺序进行分离的一种色谱方法。其固定相为化学情性多孔物质凝胶，它类似于分子筛，但孔径比分子筛大。凝胶内具有一定大小的孔穴。体积大的分子不能渗透到孔穴中去而被排阻，较早地被淋洗出来；中等体积的分子部分渗透；小分子可完全渗透入内，最后洗出色谱柱。这样，样品分子基本上按其分子大小，排阻先后由柱中流出。其渗透过程模型见图。,第三节HPLC分离类型与原理,.,第三节HPLC分离类型与原理,凝胶色谱分离过程（动画）,.,第三节HPLC分离类型与原理,分类：凝胶过滤色谱（gelfiltrationchromatography,GFC）：以水或缓冲溶液作流动相的凝胶色谱法。主要适合于水溶性高分子的分离。凝胶渗透色谱（gelpermeationchromatography,GPC）：以有机溶剂作流动相的凝胶色谱法。主要适合于脂溶性高分子的分离。如甲苯和四氢呋喃能很好地溶解合成高分子，所以GPC主要用于合成高分子的分子量（分布）的测定。,.,2固定相排阻色谱固定相种类很多，一般可分为软性、半刚性和刚性凝胶三类。凝胶：指含有大量液体（一般是水）的柔软而富于弹性的物质，它是一种经过交联而具有立体网状结构的多聚体。（1）软性凝胶如葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶都具有较小的交联结构，其微孔能吸入大量的溶剂，并能溶胀到它们干体的许多倍。它们适用以水溶性溶剂作流动相，一般用于小分子质量物质的分析，不适宜用在高效液相色谱中。,第三节HPLC分离类型与原理,.,第三节HPLC分离类型与原理,（2）半刚性凝胶如高交联度的聚苯乙烯（Styragel）比软性凝胶稍耐压，溶胀性不如软性凝胶。常以有机溶剂作流动相。用于高效液相色谱时，流速不宜大。,（3）刚性凝胶如多孔硅胶、多孔玻璃等它们既可用水溶性溶剂，又可用有机溶剂作流动相，可在较高压强和较高流速下操作。一般控制压强小于7MPa，流速1cm3s-1；否则将影响凝胶孔径，造成不良分离。,.,排阻色谱所选用的流动相必须能溶解样品，并必须与凝胶本身非常相似，这样才能润湿凝胶。当采用软性凝胶时，溶剂也必须能溶胀凝胶。另外，溶剂的粘度要小，因为高粘度溶剂往往限制分子扩散作用而影响分离效果。这对于具有低扩散系数的大分子物质分离，尤需注意。选择溶剂还必须与检定器相匹配。常用的流动相有四氢呋喃、甲苯、氯仿、二甲基酸胺和水等。以水溶液为流动相的凝胶色谱适用于水溶性样品，以有机溶剂为流动相的凝胶色谱适用于非水溶性样品。,第三节HPLC分离类型与原理,3流动相,.,八、亲和色谱法（AC）Affinitychromatograph,定义：利用蛋白质或生物大分子等样品与固定相上生物活性配位体之间的特异亲和力进行分离的液相色谱方法。固定相：将具有生物活性的配位体以共价键结合到不溶性固体基质上制得。生物活性配位体：常用的有酶（如底物及其类似物）、辅酶（如类固醇）、抗体（植物激素）、激素（如糖和多糖）、抗生素（核苷酸）等。基质：通常为凝胶，许多无机和有机聚合物都可形成凝胶，如琼脂糖衍生物、多孔玻璃。,第三节HPLC分离类型与原理,.,第三节HPLC分离类型与原理,分离过程：亲和色谱是吸附色谱的发展，在分离过程中涉及疏水相互作用、静电力、范德华力和立体相互作用。在键合了某类配体的亲和色谱柱上加入含生物活性大分子的样品，只有那些与该柱中配位体表现出明显亲和性的生物大分子才会被吸附，这些被吸附的生物分子只有在改变流动相（缓冲溶液）的组成时才会被洗脱。应用：亲和色谱主要用于蛋白质和生物活性物质的分离与制备。,.,第三节HPLC分离类型与原理,.,第三节HPLC分离类型与原理,Affinitychromatograph,.,第四节HPLC的固定相和流动相,HPLC固定相以承受高压能力来分类，可分为刚性固体和硬胶两大类。刚性固体以二氧化硅为基质，可承受7.01081.0109Pa的高压，可制成直径、形状、孔隙度不同的颗粒。如果在二氧化硅表面键合各种官能团，就是键合固定相，可扩大应用范围，它是目前最广泛使用的一种固定相。硬胶主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中，它由聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成。承受压力上限为3.5108Pa。固定相按孔隙深度分类，可分为表面多孔型和全多孔型固定相两类。,一、液相色谱固定相（stationaryphasesofLC）,.,液相色谱固定相的物理结构,.,第四节HPLC的固定相和流动相,（一）液-液分配及离子对分离固定相,1全多孔型固定相,它由直径为10m的氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体微粒凝聚而成。早期采用100m的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见；现采用10m以下的小颗粒，化学键合制备柱填料；硅胶微粒如国外的Porasil，Zobbex、Lichrosorb系列，上海试剂一厂的堆积硅珠，青岛海洋化工厂的YWG系列，天津试剂二厂的DG系列等。也可由氧化铝微粒凝聚成全多孔型固定相，如国外的LichrosorbALOXT。这类固定相由于颗粒很细（510m），孔仍然较浅，传质速率快，易实现高效、高速。特别适合复杂混合物分离及痕量分析.,.,第四节HPLC的固定相和流动相,2.表面多孔型固定相（薄壳型微珠担体）,它的基体是实心玻璃珠，在玻璃球外面覆盖一层多孔活性材料，厚度为12m。如硅胶、氧化铝、离子交换剂、分子筛、聚酸胺等。表面活性材料为硅胶的固定相如国外的Zpax，CorasilI和II，Vydac，Pellosil以及上海试剂一厂的薄壳玻璃珠等；表面活性材料为氧化铝的固定相，如Pellumina；,.,第四节HPLC的固定相和流动相,为聚酰胺的，如Pellion。这类固定相的多孔层厚度小、孔浅，相对死体积小，出峰迅速、柱效亦高；颗粒较大，渗透性好，装柱容易，梯度淋洗时能迅速达平衡，较适合做常规分析。由于多孔层厚度薄，最大允许量受限制。即表面积小，柱容量底。,.,第四节HPLC的固定相和流动相,.,第四节HPLC的固定相和流动相,3.化学键合固定相,化学键合固定相:目前应用最广、性能最佳的固定相；a.硅氧碳键型：SiOCb.硅氧硅碳键型：SiOSiC稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广；c.硅碳键型：SiCd.硅氮键型：SiN,.,第四节HPLC的固定相和流动相,化学键合固定相的特点,(1)传质快，表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快；(2)寿命长，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击；耐水、耐光、耐有机溶剂，稳定；(3)选择性好，可键合不同官能团，提高选择性；(4)有利于梯度洗脱；(5)存在着双重分离机制：(键合基团的覆盖率决定分离机理)高覆盖率：分配为主；低覆盖率：吸附为主；,.,第四节HPLC的固定相和流动相,（二）液-固吸附分离固定相,种类：硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等；结构类型：全多孔型和薄壳型；粒度：510m；,（三）离子交换色谱分离固定相,按结构类别：1.薄壳型离子交换树脂薄壳玻璃珠为担体，表面涂约1%的离子交换树脂；,.,第四节HPLC的固定相和流动相,（2）离子交换键合固定相薄壳键合型；微粒硅胶键合型（键合离子交换基团）按树脂类别：（1）阳离子交换树脂（强酸性、弱酸性）（2）阴离子交换树脂（强碱性、弱碱性）,.,第四节HPLC的固定相和流动相,（四）空间排阻分离固定相,（1）软质凝胶葡聚糖凝胶、琼脂凝胶等。多孔网状结构；水为流动相。适用于常压排阻分离。（2）半硬质凝胶苯乙烯-二乙烯基苯交联共聚物，有机凝胶；非极性有机溶剂为流动相，不能用丙酮、乙醇等极性溶剂,.,第四节HPLC的固定相和流动相,（3）硬质凝胶,多孔硅胶、多孔玻珠等；化学稳定性、热稳定性好、机械强度大，流动相性质影响小，可在较高流速下使用。可控孔径玻璃微球，具有恒定孔径和窄粒度分布。,.,第四节HPLC的固定相和流动相,二、液相色谱流动相（mobilephasesofLC）,1.流动相特性（1）液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。流动相组成改变，极性改变，可显著改变组分分离状况；（2）亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正相柱。（3）若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。,.,第四节HPLC的固定相和流动相,2.流动相类别,按流动相组成分：单组分和多组分；按极性分：极性、弱极性、非极性；按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。常用溶剂：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。,.,3.对流动相溶剂的要求是：（1）溶剂对于待测样品，必须具有合适的极性和良好的选择性。（2）溶剂要与检测器匹配。对于紫外吸收检测器，应注意选用检测器波长比溶剂的紫外截止波长要长。所谓溶剂的紫外截止波长指当小于截止波长的辐射通过溶剂时，溶剂对此辐射产生强烈吸收，此时溶剂被看作是光学不透明的，它严重干扰组分的吸收测量。,第四节HPLC的固定相和流动相,.,第四节HPLC的固定相和流动相,下表列出了一些常用溶剂的紫外截止波长。对于折光率检测器，要求选择与组分折光率有较大差别的溶剂作流动相，以达最高灵敏度。,.,（3）高纯度。由于高效液相灵敏度高，对流动相溶剂的纯度也要求高。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生“伪峰”。痕量杂质的存在，将使截止波长值增加50100nm。（4）化学稳定性好。勿选与样品发生反应或聚合的溶剂。（5）低粘度。若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不利于分离。常用的低粘度溶剂有丙酮、乙醇、乙腈等。但粘度过于低的溶剂也不宜采用，例戊烷、乙醚等，它们易在色谱柱或检测器内形成气泡，影响分离.,第四节HPLC的固定相和流动相,.,第四节HPLC的固定相和流动相,4.流动相选择,在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。采用正相液-液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保留时间缩短。常用溶剂的极性顺序：水(最大)甲酰胺乙腈甲醇乙醇丙醇丙酮二氧六环四氢呋喃甲乙酮正丁醇乙酸乙酯乙醚异丙醚二氯甲烷氯仿溴乙烷苯四氯化碳二硫化碳环己烷己烷煤油(最小),.,第四节HPLC的固定相和流动相,5.选择流动相时应注意的几个问题,（1）尽量使