《蛋白质III》PPT课件

蛋白质（III）,蛋白质的主要研究技术,蛋白质的性质,胶体性质蛋白质分子直径在1100nm范围内透析：根据蛋白质分子大于一般小分子物质的特点，可以利用半透膜把蛋白质与小分子分开丁达尔现象水化现象吸附现象酸碱性质等电点与电场迁移蛋白质在等电点附近溶解性最小，电场中不迁移一般情况下，大分子蛋白质的等电点是不能直接利用氨基酸侧链基团推算。,蛋白质的颜色反应（p35）双缩脲反应：与CuSO4碱性溶液反应，生成紫红色或蓝紫色的复合物，540nm处有最大光吸收。米伦反应：蛋白质与硝酸汞、亚硝酸汞、硝酸、亚硝酸的混合液反应生成白色沉淀，加热后变为红色，这是酚类化合物的反应（Tyr）乙醛酸反应：蛋白质溶液加入乙醛酸，并沿试管壁慢慢注入浓硫酸，两液层之间会出现紫色环，这是含吲哚基化合物的反应（Trp），明胶一般无此反应坂口反应：蛋白质加入次氯酸、-萘酚、氢氧化钠可以生成红色化合物，胍基反应（Arg）酚试剂：福林（Folin）试剂，酚基（Tyr）可以把磷钼酸、磷钨酸还原成蓝色化合物，Lowry法。,光吸收性质蛋白质在280nm处有强烈的光吸收Phe、Tyr、TrpTrp贡献最大,蛋白质的沉淀与变性,沉淀作用蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大小、所带的电荷和水化作用有关改变溶液的条件将影响蛋白质的溶解性质，在适当的条件下，蛋白质能够从溶液中沉淀出来可逆沉淀在温和条件下，通过改变溶液的pH或电荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，所以这种沉淀又称为非变性沉淀,可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法根据蛋白质的不同溶解和沉淀性质将目标蛋白质和其他物质分开等电点沉淀法：调整pH至对应蛋白质等电点，使其沉淀分离适用于区分等电点差异大的亲水蛋白盐析与盐溶法：中性盐影响蛋白质溶解性的双向作用常用盐析剂：MgCl2、（NH4）2SO4、K2SO4有机溶剂沉淀法改变介质常数，破坏蛋白质胶体的水化作用常用丙酮、乙醇，结合低温和等电点共同沉淀蛋白质,不可逆沉淀在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化，所以又称为变性沉淀变性沉淀因素：高温强酸碱重金属盐有机试剂：溶剂、脲、胍、生物碱去垢剂：SDS（十二烷基磺酸钠）,变性后蛋白质化学性质的改变生物活性丧失侧链基团暴露（颜色反应增强）物理化学性质改变：溶解性、粘度、扩散系数生物化学性质改变：易于酶解,蛋白质的分离纯化,一般流程：前处理：分离组织破碎细胞去其他组分注意问题：保持蛋白质的完整和活性常用方法超声粉碎微研磨酶消化超速离心,粗分级常用方法：盐析法、等电沉淀、有机溶剂要求：简便、处理量大、既能除去大量杂质，又能收缩蛋白质溶液细分级进一步提纯常用方法：层析、电泳规模小，分辨率高结晶只有纯度达到一定的程度，才能实现结晶结晶不一定意味着蛋白质已提纯本身有一定提纯作用。,蛋白质的纯度鉴定活性鉴定：酶、激素等可以用对应的生物活性检测来确定纯度抗原抗体效价法电泳、层析、超离心等方法恒溶法：在严格控制的条件下，以加入的固体蛋白的量对溶解蛋白的量作图，可以确定是否提纯。根据纯化和鉴定的方式的不同，常把蛋白质的纯度定义为：电泳纯、结晶纯、色谱纯等等,蛋白质分离纯化常用技术,沉降分离（Sedimentation）蛋白质分子量、形状的不同会产生密度和沉降速度的差异差速离心：利用蛋白质分子在离心力场的作用下沉降速度的差异分离不同蛋白质单位离心力场下，物质的沉降速度与分子量和分子形状有关在生物化学中常用沉降系数表征分子量密度梯度离心利用物质在密度与其相同的溶液中不会沉降的特点区分不同密度的物质常用蔗糖，CSCl等构建,层析、色谱（Chromatography）分配层析一般原理：利用待分离物质在流动相和固定相中分配系数的不同，使物质间出现移动速度的差异，从而区分不同的物质。常用方式：分配柱层析滤纸层析薄层层析离子交换层析气相色谱高效液相色谱（HPLC）利用非常细的颗粒固相支持剂，提高分配表面积溶剂系统采用高压，提高系统速度,离子交换层析原理：利用不同离子在不同的pH下与固定相结合强度的差异，使待分离的物质在特定条件下与固定相中的同型离子发生交换，而与固定相结合，从而区分不同物质可分为：阳离子交换柱：强酸型、弱酸型阴离子交换柱：强碱型、弱碱型常用介质：聚苯乙烯-苯二乙烯树脂离子交换纤维素离子交换葡聚糖洗脱方式分段洗脱梯度洗脱,分子排阻层析（molecular-exclusionChromatography）原理：利用具有不同孔径的多孔网状结构的凝胶珠作为分离介质，小分子由于扩散作用进入凝胶颗粒内部而被滞留；大分子被排阻在凝胶颗粒外面，在颗粒之间迅速通过。又称凝胶过滤、分子筛一般步骤柱平衡蛋白质混合物上柱洗脱液洗脱蛋白收集记录可以用于分析分子量分子量与洗脱体积相关排阻极限：表示分级范围的上限，不能扩散进入凝胶珠微孔的最小分子的分子量,亲和层析（Affinitychromatography）原理：利用待分离蛋白质与固定相中相应配体的特异性结合，将目标蛋白质与其他物质分开一般步骤制备交联有配体的层析柱蛋白质上样，平衡杂质洗脱可溶性配体洗脱目标蛋白质,电泳（elecctrophoresis）在外电场的作用下，带电颗粒，例如不处于等电状态的蛋白质分子，将向着与其电性相反的电极移动，这种现象称电泳电泳的基本原理：相同分子，有相同的电泳迁移率常见电泳形式：界面移动电泳：在U型管中使蛋白质溶液与缓冲液形成清晰液面，利用电泳过程中液面的移动来记录电泳结果血浆电泳、毛细管电泳都属于这一类区带电泳：在固定的支持物上进行电泳，各组分因迁移率不同，形成不同区带，可以区分不同蛋白质滤纸电泳、薄膜电泳、涂层电泳、微介质电泳、凝胶电泳,SDS-盘式凝胶电泳：用聚丙烯酰胺凝胶作为支持物，可以将凝胶分别作成浓缩胶和分离胶两部分.浓缩胶一般孔径较大，pH6.8，分离胶一般孔径较小，pH8.8样本加入SDS（十二烷基磺酸钠）、巯基乙醇、尿素处理，使蛋白质分子带上均匀的负电荷，分子形状变为一致的杆状分子，消除电荷差异和分子形态差异的影响。具有：样品的浓缩效应，凝胶对分子的筛选效应。可以用于测定蛋白质分子量，以标准分子量的蛋白质做对照，迁移率与分子量的对数成反比。蛋白质可用考马斯亮蓝或者苯胺黑染色，也可将其转移到醋酸酯膜上，用相应的抗体鉴定，称westblotting样本与凝胶之间没有共价的结合，可以将电泳后的样本回收，复性后，将保持其功能。,等电聚焦电泳利用蛋白质在等电点的pH时不会发生电场迁移的原理，缓冲液或固定介质中构建pH梯度，蛋白质“聚焦”在等于其等电点的pH点处，形成一个很窄的区带，从而区分不同的蛋白质区分精度可以到0.02pH,沉降系数,定义：单位离心力场下的沉降速度mp，分子颗粒质量（1-）为浮力因子f：摩擦系数Svedberg单位：10-13秒，S,流动相,固定相,64,0,0,0,0,0,流动相,固定相,分配系数：物质在两相溶剂中分配平衡时的比例,分配系数：1,分配系数：3,32,32,32,16,16,16,16,16,16,8,8,8,8,阴,Ve：洗脱体积Vo：凝胶外体积Vi：凝胶内体积Kd：分配系数Kav：可用分配系数,带电颗粒在电场中的泳动速度主要决定于它所带的净电荷量以及颗粒的大小和形状。颗粒在电场中发生泳动时，将受到两种方向相反的力的作用F(电场力)=qE(=qU/s)f(摩擦力)=fvq颗粒所带的