第7章分子标记辅助育种(准)ppt课件

分子标记辅助选择育种,第一章遗传标记概述,定义：指可以明确反映遗传多态性的生物特征。特点：能够稳定遗传而且遗传方式简单。经典遗传学，多态性指等位基因的变异。现代遗传学，多态性指基因组中任何座位上的相对差异。,一、遗传标记的概念,形态学标记细胞学标记生化标记分子标记,二、遗传标记的种类,(一)形态学标记,形态标记：是指那些能够明确显示遗传多态性的外观性状，如株高、穗形、粒色或芒毛等的相对差异。,优点：形态标记简单直观、经济方便；缺点:(1)数量在多数植物中是很有限的;(2)且多态性较差，表现易受环境影响，(3)有一些标记与不良性状连锁。(4)形态标记的获得需要通过诱变、分离纯合的过程，周期较长。因此形态标记在作物遗传育种中的作用是有限的。,(二)细胞学标记,细胞学标记：是指能明确显示遗传多态性的细胞学特征。染色体的结构特征:染色体的核型和带型染色体的数量特征:整倍性和非整倍性,水稻IR36初级三体的形态特征,优点：受环境影响较小缺点（1）标记材料的产生需要花费大量的人力、物力进行培养选择；（2）有些物种对染色体结构和数目的变异的耐受性差，难以获得相应标记材料；（3）标记的数目有限。,酶蛋白质和非酶蛋白质,种子贮藏蛋白,醇溶蛋白,谷蛋白,水溶蛋白,同工酶,等位酶,(三)生化标记,isozyme,allozyme,大豆同工酶图谱,优点：蛋白质是基因表达的产物，与形态标记和细胞学标记相比，数量上更丰富，受环境影响更小。缺点：（1）每一种同工酶标记都需要特殊的显色方法和技术；（2）某些酶的活性具有发育和组织阶段的特异性；（3）局限于反映基因组的表达信息；（4）标记的数量有限。,(四)DNA分子标记,1.概念DNA分子标记：指以DNA遗传多态性为基础的一类遗传标记。DNA水平的遗传多态性表现为核苷酸序列的任何差异，甚至是单个核苷酸的变异。,2.分子标记的特点,能稳定遗传；多态性高、揭示的信息量大；无表型效应；不受环境影响；不受组织和发育阶段的影响；表现中性,第二章DNA标记技术,RFLP(restrictionfragmentlengthpolymorphism，限制性内切酶酶切片段长度多态性)标记；,第一节基于DNA-DNA杂交的DNA标记,原理：生物在长期进化的过程中，会在种、属甚至品种间同源DNA序列的限制性内切酶识别位点上出现差异，在限制性内切酶作用下产生许多大小不等的DNA片段，用放射性同位素标记的DNA作探针，把与被标记DNA相关的片段检测出来，与DNA探针特异结合的特定限制性酶切片段即为RFLP分子标记。,酶切位点突变,W1,M1,插入突变,W2,M2,缺失突变,W3,M3,8.0,2.5,8.0,W1,M1,W3,M3,W2,M2,8.0,10.5,1.6,9.6,8.0,6.9,6.9,8.0,9.6,8.0,2.5,2.5,8.0,2.5,2.5,2.5,Probe,酶切位点,RFLP实例,totalDNA,RE,electrophoresis,blotting,probe(p32),hybridization,多态性来源RE酶切位点的点突变限制性酶切片段内的大片段的插入与缺失特征特性特定位点，稳定，共显性DNA用量大，周期长，同位素,技术路线,第三节基于PCR的分子标记,94,37,72,PCRprocedure,Cycle12分子,Cycle24分子,RAPD(RandomlyAmplifiedPolymorphismDNA),一、RAPD标记,原理,周期短，操作简单，灵敏度高，DNA用量少,SimpleSequenceRepeatsSSR,5repeats,7repeats,P2P1,二、SSR标记,A9repeats,B5repeats,C13repeats,PCR,A,B,C,SSR多态性分析示意图,ABC分别代表不同的基因型,原理,SSR引物在大豆中的扩增谱带,（1）数量丰富，广泛分布于整个基因（2）具有较多的等位性变异；（3）共显性标记，可鉴别出杂合子和纯合子；（4）实验重复性好，结果可靠；（5）由于创建新的标记时需知道重复序列两端的序列信息，因此其开发有一定困难，费用也较高。,SSR标记的主要特点,三、ISSR标记（Inter-simplesequencerepeats）,原理：利用真核生物基因组中广泛存在的SSR序列，设计出各种能与SSR序列结合的PCR引物，对两个相距较近、方向相反的SSR序列之间的DNA区段进行扩增。,四、SSCP(单链构象的多态性)(SingleStrandConformationPolymorphism),变性复性,五.DD-PCR(Differentialdisplay-PCR),主要原理：,利用真核生物mRNA结尾处有POLY（A）结构，在其3端设计象5-T11GA样引物，该引物可与mRNA总数的十二分之一结合，从而使这部分基因得到逆转录，同时结合5端的随机引物（20条10-mer），可以使不同长度的基因得到扩增。,AATTTTTTTTACTTTTTTTTAGTTTTTTTTTATTTTTTTTTCTTTTTTTTTGTTTTTTTTCATTTTTTTTCCTTTTTTTTCGTTTTTTTTGATTTTTTTTGCTTTTTTTTGGTTTTTTTT,提取mRNA；特定引物（12分之一）反转录；特定引物和RP结合RT-PCR；把不同处理的样品扩增产物按引物组合分别进行电泳比较cDNA带，从而找出差别cDNA。,具体操作：,（1）简便、灵敏、高效、省时，能快速显示mRNA的组成。（2）所需的mRNA量少。（3）各样本mRNA的差异可同时进行比较。（4）扩出的cDNA可直接用于测序、文库筛选等。,特点,AmplifiedFragmentLengthPolymorphism,AFLP标记,原理,第四节基于PCR和限制性酶切的分子标记,AFLPprocedure,AFLP引物1.核心碱基序列(core)：与接头互补2.限制性内切酶识别序列（ENZ)3.引物3末端的选择碱基(EXT),EcoRIadaptor:5-CTCGTAGACTGCGTACC-33-CTGACGCATGGTTAA5E00:5-GACTGCGTACCAATTC3MseIadaptor:3AATGAGTCCTGAGTAG5M005TACTCAGGACTCAT-33GAGTCCTGAGTAGCAG-5,52,51,（1）只需要极少量的DNA模板；（2）不需要Southern杂交；（3）不需要预先知道DNA的序列信息；（4）重复性好，可快速获得大量信息。（5）受专利保护,AFLP标记的主要特点,主要类型DNA分子标记的比较,第五节DNA分子标记在植物生物技术中的应用,一、构建高密度的遗传连锁图在经典遗传学中由于遗传标记的数量较少，只能建立稀疏且分布不均匀的遗传连锁图。DNA分子标记数量丰富，为高密度遗传图谱的制作提供了可能，促进DNA指纹的分析。,二、进行基因定位基因定位就是寻找与目的的基因紧密连锁的遗传标记并确定其在染色体上的位置，高密度遗传连锁图的建立使目的基因的定位更为方便。,三、遗传多样性和物种亲缘关系DNA标记可以覆盖整个基因组，能客观、准确地检测物基因组DNA水平的差异。,四、种质鉴定利用DNA分子标记可以鉴别品种，评估品种纯度，分析农艺性状基因，分离和鉴别遗传材料。,植物育种都是依植株的表型性状进行选择的。DNA标记的出现使植物育种从表型选择过渡到分子育种的新阶段。,五、育种中的分子标记辅助选择,第三章分子图谱的构建,第一节图谱构建的理论基础,一、染色体遗传理论,(1)体细胞核内的染色体成对存在，其中一条来自父本，一条来自母本，成对染色体的两个成员是同源的。(2)每条染色体在个体的生命周期中均能保持其结构上的恒定性和遗传上的连续性，因而在个体的发育过程中起着一定的作用。(3)在减数分裂中，同源染色体的两个成员相互配对，随后又发生分离，走向细胞的两极，从而形成两个单倍体性细胞。,二、基因重组和连锁理论,在细胞减数分裂时，非同源染色体上的基因相互独立、自由组合，同源染色体上的基因产生交换与重组，交换的频率随基因间距离的增加而增大。同一染色体上的基因在遗传过程中一般倾向于维系在一起，而表现为基因连锁。重组是通过一对同源染色体的两个非姊妹染色单体之间的交换来实现的。,连锁图谱构建的理论基础是染色体的交换与重组！,重组型配子占总配子的比例称为重组率。重组率的高低取决于交换的频率，而两对基因之间的交换频率取决于它们之间的直线距离。重组率的值变化于完全连锁时的0%到完全独立时的50%之间。重组率可用来表示基因间的遗传图距，图距单位用厘摩（centi-Morgan，cM）表示，1cM的大小大致符合1%的重组率。,三、图谱制作的统计学原理,两个基因座位于同一染色体上且相距较近，则在分离后代中通常表现为连锁遗传。对两个基因座之间的连锁关系进行检测，称为两点测验。在进行连锁测验之前，必须了解各基因座位的等位基因分离是否符合孟德尔分离比例，这是连锁检验的前提。,（一）两点测验,两点测验杂交图示遗传作图,假设两座位间存在连锁（r3；而要否定连锁的存在，则要求似然比小于100:1，即LODt，则接受t0，说明存在QTL。,分析示例,（结果显示在标记3附近可能有QTL）,（二）QTL区间定位法,基本思想：用相邻的两个标记检测位于它们之间的QTL数学模型（以DH群体为例）yi=+bxi+i式中：yi某个株系的性状值模型均值b被检QTL的效应值xi该株系中被检QTL的基因型指示变量（QQ：xi=1;qq:xi=1）i误差,各个株系中被检QTL的基因型（亦即回归模型中自变量x*的值）是未知的，但可根据两侧标记的基因型来推算被检QTL为某种基因型（QQ或qq）的概率。,Ar1Qr2B,aqb,r,假设在某个标记区间中存在一个QTL（如下图）,重组率r1、r2和r可以利用作图函数从图距换算得到。,注：s=1r,t=r1r2,根据两侧标记基因型和标记与QTL间的重组率推算出的QTL各种基因型的概率以及x*的期望值,用x*的期望值取代其真值，代入回归模型中，即可用最小二乘法进行回归分析，由此可估计出QTL的效应值b*，并进行显著性测验。,显著性测验的假设无效假设H0:被检测的位置没有QTL，即b*=0备择假设H1:被检测的位置存在QTL，即b*0,似然比检验LR=nlnRSS(b*0)/RSS(b*=0)也可用LOD统计量：LOD0.217LR其中：RSS(b*=0)无效假设下的最小剩余平方和RSS(b*0)备择假设下的最小剩余平方和,以一定步长（如1cM），沿整条染色体逐点检测，可以得到LOD（或LR）沿染色体位置变化的曲线。大于显著阈值的LOD曲线高峰所对应的染色体位置就是存在QTL可能性最大的位置。,番茄第10号染色体上与果实性状有关的QTL的区间定位结果,果实pH值,果实重,果实可溶固形物浓度,三、QTL复合区间定位法,基本思想：用标记来消除遗传背景对被检区间的影响数学模型（以DH群体为例）y=b0+b*x*+ibixi+式中：bi第i标记的偏回归系数xi第i标记的基因型指示变量（MM：xi=1;mm:xi=1）其它符号含义与区间定位模型相同可以看出，复合区间定位模型比区间定位模型多了一项ibixi，称为余因子项，它是性状值对标记的回归项。,QTL定位的计算机软件,t测验和方差分析可使用常用的统计软件，如SAS、SPSS等区间定位Mapmaker/QTL复合区间定位QTLCartographer中文版软件QTL工具箱（QTLKit）包含了t测验、方差分析、联合定位、区间定位和复合区间定位几种方法,第六章分子标记辅助选择,分子标记辅助选择（Marker-assistedselection，MAS）就是利用与基因紧密连锁的分子标记，对目的基因进行辅助选择，从而实现对基因的有效利用。,第一节分子标记辅助选择的原理,分子标记辅助选择主要是根据与目标基因紧密连锁的分子标记基因型的检测来推测、获得目标基因的基因型。直接选择的是分子标记的基因型，而不是目的基因的基因型，因此利用分子标记选择目的基因的基因型，只是起辅助选择的作用。分子标记辅助选择的效果取决于连锁的紧密程度。,一、标记与基因的关系,RR(1-r)20.9025,RS2r(1-r)0.09,SSr20.0025,目的基因(R)与标记(m)连锁（交换值为r）,亲本中的标记带型,F1中的标记带型,F2群体中3种标记带型,当r=0.05时，根据标记基因型mm选择目的基因型RR，选错的概率约为0.10,m,R,M,S,二、分子标记辅助选择的原理,Mm,mm,MM,分子标记与目标基因紧密连锁（一般应小于5cM）；标记实用性强，重复性好，而且能够经济简便地检测大量个体；最好是以PCR为基础的标记。不同遗传背景选择有效。,三、分子标记辅助选择的条件,第二节作物MAS育种方法,（一）回交育种,受体亲本供体亲本(不含优质基因)(含优质基因),F1受体亲本,BC1,目标基因定位,标记辅助选择,中选BC1受体亲本(含优质基因),BC2,BC3,标记辅助选择,标记辅助选择,中选BC3(含优质基因),新育成的优质品种(受体亲本遗传本背景+优质基因),自交,目标基因的定位与标记辅助回交育种相结合程序图,中选BC1受体亲本(含优质基因),（二）SLS-MA