薄层色谱的操作

薄层色谱的操作1.方法原理 薄层色谱是一种微量分析的分离过程，它将样品点在以玻璃板或铝、塑料等片材为载体的多孔吸附剂薄层的固定相上,利用流动相在特定的展开室中将混合物中的组份推移到不同距离处，在色谱展开整个过程中，样品的成份受到正反不同的力的作用。(1) 流动相利用毛细管力带着样品穿过固定相。(2) 样品与固定相的相互作用是指组份在移行过程中由于偶极 - （诱导） - 偶极相互作用，氢键和范德华力的作用而产生不同程度的延缓、吸附、分散、离子交换和络合等分离机理。由于样品组份与流动相和固定相之间的相互作用力程度不同，整个毛细管流动过程中分离运动都在进行。基于这点，TLC系统（流动相和固定相）必须与样品很好地匹配。用显色试剂处理，许多组份可在日光或紫外灯光下检视。色谱可用肉眼或使用光密度计和照相机记录或影像系统方法来评价。2. 薄层板2.1手工自制板2.1.1玻璃板的要求:用于制备薄层板的玻璃板要求表面光洁、平整，最好使用厚薄12mm的优质平板玻璃，普通窗玻璃一般不宜用于制作薄层板，玻璃板需洗净至不挂水，晾干，贮存于干燥洁净处备用。玻璃板反复使用时，应注意经常用洗液及碱液清洗，保持玻璃板面的光洁是保证薄层板质量的最基本要求2.1.2制作方法:除另有规定外，将1份吸附剂加适量的水（如1份硅胶G一般加3份水），在研钵中用研杵沿一个方向小心研磨至成均匀的有适当粘稠度的胶浆,立即倾入涂布器中,均匀地向前推进涂布在玻璃板上;或按照不同涂布器的规定操作涂布;涂布好的薄层板于室温下在水平台上晾干,再在规定的温度(一般为105110)下烘约30分钟活化,贮于干燥器中备用。薄层板的厚度一般为0.250.5mm.。2.2 商品化供应的预制板和高效板2.2.1板的尺寸 20x20cm 10x20cm 20x10cm 10x10cm图1 不同的板尺寸TLC/HPTLC预制板有不同的规格供应。常用的尺寸为20 x 20，10 x 20，20 x 10，或10 x 10 cm。使用的规格取决于TLC或HPTLC的类别和样品的数目。2.2.3 TLC/HPTLC板的预洗及活化一般来说，色谱板应用溶剂如氯仿-甲醇(8:2)，甚至用更强的洗脱溶剂的混合物进行预洗。具体操作可通过空白色谱展开来实现。色谱板预洗完后,应在105C加热1小时进行干燥，再在室温下置放至少2小时（需采取保护措施以防止实验室空气中的污染物重新附着在其上面，如放置在空的干燥器中）。3. 样品点样31点状点样和条带状点样每次点样前，TLC/HPTLC板应在正常光线下和紫外灯下用肉眼检查薄层的损伤情况和杂质，只有无损伤、清洁的TLC/HPTLC板方可使用。样品可进行点状或条带状点样。要想获得最佳的薄层分辨率，必须保证移行方向中的起点要小，常规的TLC薄层点状点样每次点0.5至5微升，相比之下，HPTLC薄层最大点样量为1微升。点样量较大的样品可使用自动化装置点样，喷雾成条带状是一种可以点样量大而同时又能促成最有效分离的点样方法。在常规操作过程中，人工点样一般使用微量毛细管（0.5/1/2/3和5 ?l），点样时毛细管必须完全充满和完全排空，要以垂直方向小心接触TLC/HPTLC板面，不要损伤薄层，受损的薄层会导致溶剂不规律地流动而在色谱上产生失真的TLC谱带。人工点样建议使用Nanomat。它点样位置精确并安全，使薄层免于受损。用适当的介质干燥Nanomat也可用作单个量的多次点样。样品体积大于5 ?l，通常用如Linomat或Automatic TLC Sampler III的方法用氮气喷雾成窄条。若（就是）要求点状样品点样，Linomat 和Automatic TLC Sampler III应将条长度设定在1至2 mm。3.2 样品点样位置起点的最佳位置如图2和3所示。起点下缘的最小距离b取决于溶剂量。两个起点之间的距离c必须令平行移行的主成份不会相互触及。点状点样时原点的直径应小于或等于3mm（高效板原点的直径应更小）,条带的长度d由点样样品体积或样品的种类和相对于板的尺寸点样的数目来决定。到板侧边的距离a必须足够大以避免分离区失真变形（见图2和3）。图2： 斑状样品点样的一般点样位置（a = 20mm, b = 10mm, c =两起点之间的距离。）图3： 条状样品点样的一般点样位置（a = 20mm, b = 10mm, c = 两起点之间的距离，d = 条的长度）。4.层析4.1展开室 4.1.1直立式双槽展开室 具有节省溶剂、便于预平衡、可控制展开箱内的湿度等优点。4.1.2 水平展开室 可以从薄层板的两侧向中间水平地展开，这样可使一块薄层板所承受的样品个数比常规上行展开的薄层板增加一倍。 4.1.3 自动展开室(AMD) 可使用五种溶剂对同一薄层进行多次展开，自动控制预饱和、展开方式、展开距离和干燥条件，分离效率比传统方式提高三倍（可在80mm之内分离40种成分），符合GLP/GMP要求。4.2. 溶剂使用的溶剂必须是“分析纯”或“色谱纯”，溶剂组成采用体积量比（如正丁醇 - 冰乙酸 - 水 = 4：1：1，V/V/V），或者绝对量（如18ml甲苯 + 2 ml甲醇）。其总量应足以使TLC/HPTLC板的浸入深度约为5mm。展开剂要求新鲜配制，不要多次反复使用,如需分层，则按要求放置分层后取需要的一相（上层或下层），备用。在双槽展开室中，对每种类型和规格和层析板，每槽通常注入的溶剂数量如表3。表3：板的规格 板的尺寸（宽高） 溶剂量预制板 2020cm2010cm1010cm 25ml15ml8ml高效板 2010cm1010cm 10ml5ml4.3展开室状况溶剂的蒸气相在展开箱中也参与色谱展开而形成三维的层析过程，展开箱的气体空间在层析过程中起着重要的作用。以下有四种常见的情况（A、B、C、和D）。 4.3.1方法A（展开室不饱和）方法A的特点：l 不呈饱和状态l 无滤纸l 只有一个槽内有溶剂 l 每个展开室只有一块TLC/HPTLC板l 薄层向里（如图4）图4：有溶剂和TLC/HPTLC板的双槽展开室方法A的操作程序：TLC/HPTLC板在倒入相应量的展开剂后立即放至展开室中，薄导层板应垂直地竖放在溶剂中，薄层向里，展开室盖上后层析立即展开。对某些分离过程，在产品专用方法中有明确的说明时，另一槽可盛放一些调节液体（乙酸，浓氨水等）。 4.3.2方法B（部分饱和，无滤纸）方法B的特点：l 不完全饱和l 无滤纸l 在两个槽内盛放溶剂 l 每个展开室只有一块TLC/HPTLC板l 薄层向里（如图5）图5： 有溶剂和TLC/HPTLC板的双槽展开室方法B的操作程序：将展开剂倒入至两个槽内，盖上盖子，置放15分钟后，将盖子移向一边，TLC/HPTLC板涂层向时地竖放入溶剂中，盖上展开室，让TLC/HPTLC板开始展开。对某些分离过程，在产品专门方法中有明确的说明时，另一槽可放置调节液体（乙酸，浓氨水等）。 4.3.3方法C（展开室饱和，有滤纸）方法C的特点：l 用放入滤纸使饱和（至少30分钟）l 在两个槽内盛放溶剂 l 每个展开室只有一块TLC/HPTLC板l 薄层面向滤纸（如图6）l 图6： 有溶剂、滤纸和TLC/HPTLC板的双槽展开室方法C的程序：将展开剂倒入至两个槽内，将与展开室相同型号的滤纸（如CAMAG序号022.5243）用规定量的溶剂湿润后贴在玻璃展开室正面，盖上盖子，放置30分钟（标准时间），然后将盖子移向一边, TLC/HPTLC板薄层面向着滤纸竖放入溶剂中，盖好展开室让板进行层析。对某些分离过程，在产品专用方法中有明确说明时，另一槽可置放调节液体（乙酸，浓氨水等）。 4.3.4方法D（展开室饱和，薄层预稳定）方法D的特点：l 薄层预稳定，放置滤纸使展开室饱和l 溶剂量增加一倍l 每个展开室只有一块TLC/HPTLC板l 薄层面向滤纸(如图7)图7：有溶剂， 滤纸和TLC/HPTLC板的双槽展开室方法D的程序：将展开剂倒入至一个槽内，将与展开室相同型号的滤纸（如CAMAG序号022.5243）用规定量的溶剂湿润后贴在玻璃展开室正面，另一槽空着,TLC/HPTLC板薄层面向滤纸地置放在空槽中，除非产品专用方法另有规定，15分钟（标准时间）后，稳稳地倾斜使足够量的溶剂移至有TLC/HPTLC板的槽中（图8，只有用20x20和20x10cm的展开室才能这样做；若为10x10cm的展开室，溶剂需从外部用移液管或类似器材实现转移）。图8： 倾斜的双槽展开室图9：有溶剂，滤纸和经预稳定TLC/HPTLC板的双槽展开室，层析开始4.4参数4.4.1温度 薄层色谱分析一般在室温中进行。对这过程，温度在20 - 25?C算不上是临界值。 在这过程，中无短期的温度波动才是更为重要（避免抽风）。展开室应放置在无直射阳光和不通风处。温度波动对层析结果不利，故将展开室放在靠近窗口或热源处是欠妥的。4.4.2空气湿度 空气湿度极高或极低主要影响有非极性溶剂 体系的无机涂层。相对空气湿度高于70-80%会影响薄层钝化，使Rf值增加。样品点样后，TLC薄层可置放在适当的硫酸和水的混合物的上面不少于30分钟，调整至指定的相对湿度。有关这方面的更多资料可从HPTLC Vario系统的操作手册中获得。另一方面，在样品点样前，TLC/HPTLC板可在105?C再活化30分钟进行干燥。然后薄层必须用一块玻璃板保护起来，只有起点区露出以便于样品点样。若空气太干燥，可在干燥器中将TLC/HPTLC薄层置于水的上方以达到所要求的状况。确定合适的层析条件的有效方法（用规定的湿度，溶剂蒸汽或溶剂调整使薄层达到要求的状况）是使用HPTLC Vario体系。控制相对湿度用的硫酸溶液下表： 相对湿度 所需硫酸浓度（V/V）硫酸（ml） + 水（ml）32%47%42%58%65%72%88% 68.0 10050.0 10057.0 10039.5 10034.0 10027.5 10010.8 1005 层析后衍生作用若层析板分离的物质肉眼看不见又不能被紫外光活化，需加试剂 方能显色或发射荧光者，则需使用适当的试剂浸渍或均匀喷洒于薄层板面上，直接观察或加热显色后观察。加热显色者须注意加热时间和温度，尤其含羧甲基纤维素钠的薄层板，加热温度过高或时间过长，容易引起板面的焦化，如用硫酸等显色剂更易造成板面的炭化而影响显色效果。有的成分加试剂后，如挥发油成分经香草醛硫酸显色，加热温度和时间长短不同或放置时间不同均可能使斑点的显色有所改变。有的品种可熏以试剂或试液的蒸气（如碘蒸气、氨蒸气）显色。5.1 喷雾试剂溶液以气溶胶的形式均匀地喷洒在薄层上。电动的TLC喷雾器用最少的试剂溶液产生几近理想的气溶胶。5.2 浸渍使用适当的设备如色谱浸渍设备III（Chromotogram Immersion Device III）,TLC/HPTLC板浸渍具有重现的结果。通过设定垂直方向速度（进入，抽出）和规定停留时间，浸渍条件可被精确地标准化。6检测 6.1 定性分析（同一性试验）在相同的状态下（相同类型的TLC/HPTLC板、相同的溶剂体系组成、相同的组份点样体积和其它TLC设备系统），样品成份的Rf值、颜色、与专用的或特殊基因衍生化试剂的反应和参考物或标准物在同一TLC/HPTLC板同时层析所得的结果相符时，未知物就可认为是存在而被鉴别出来。分析的结果可以采用照片，照片复制品，影像记录（如：CAMAG 薄层色谱数码成像系统）或TLC扫描仪方法记录下来。当混合物物质被测试时，参考标准物中单个馏份的Rf值可能会与纯物质的Rf有所不同，但测试物理学馏份和标准化馏份的hRf值必须相符，其DhRf在 3之内。为增加测试物与参照物同一性的可信度，采用TLC扫描仪实时记录其紫外光和可见光图谱并进行比较。多波长测定将测试物和参照物的图谱情况和hRf值相关联供进一步鉴别。6.2 定量分析（仪器：CAMAG scanner-3；具体操作请参考操作手册或教学软件）定量分析采用光密度扫描法来评价。用winCATS 软件控制薄层色谱扫描仪以及进行扫描结果的数据处理，计算出各成分的峰高和峰面积及其平均值和离散系数（CV）或置信窨（CI）。通过单水平或多水平校准计算出结果。最后以报告形式将所有扫描参数、原始资料及图像结果保存及打印。扫描狭缝宽度根据被测成份斑点的大小来调整（1）点状点样得到TLC中各成份，扫描其全宽度；（2）条带状点样，通常可以扫描其色谱带同心部份的50 - 70%。物质的扫描波长可以通过光谱扫描来决定。TLC/HPTLC板空白部位的漫射反射光用光电倍增器（PM）来收集并定其值为10% （=0% 吸收）。扫描吸光物质时，其吸收随着物质的量而增加。对于具有荧光或可转变成具荧旋光性衍生物的物质的测定。光源一般使用发射光谱在254 - 578 nm之间的高压汞蒸汽灯，在254，302，313，366，405，436，546和578nm处有特别高强度的谱线。吸收了选择性激发波长后TLC中各成份发射出的较长波长荧光由光倍增器记录下来，使用锐截止滤波器或窄带滤波器将会阻止TLC/HPTLC板反射的激发波长光到达光电倍增器。和吸附测定一样，荧光强度作为板上定位的函数作图得模拟曲线（荧光定位曲线）（图10）。TLC扫描仪的测定原理在有关的设备文献中有报导。荧光测定比吸收测定优越在于如下几点：（1）检出极限低1 - 3个数量级；（2）在较宽的浓度范围内校准曲线呈线性；（3）选择性较高。图10： a) 有好几个成份的TLC/HPTLC板b) TLC/HPTLC板的模拟曲线在测定极限以上所有的检测成份可被量化。在检出极限以上而在测定极限以下的检测成份会给出检出和测定极限的平均值（作为结果）。7 标准条件下述的两个标准条件对不同的板规格适用。在产品专用试验方法中，应参考这一普通的分析方法。标准条件或对标准条件的偏差必须限定。71 HPTLC板10 x 10和20 x 10 cm HPTLC预涂板的标准条件总结如下以便于参考。薄层 商品化生产的HPTLC板规格 10 x 10和20 x 10 cm板；由样品数目决定点样 用毛细管移液管或Nanomat进行斑状点样或用自动点样器作条状点样数量 一般，斑状点样用20 nl - 1 ml, 窄条点样用2 - 20ml定位 起点在距板下缘10 mm处溶剂 数量限定采用体积量或绝对量。一般，对10 x 10 cm双槽展开室的一个槽加5ml,对20 x 10 cm双槽展开室的一个槽加10ml分离距离 5 cm展开室 对10 x 10或20 x 10 cm板用双槽展开室分离模式 线性（上行式或水平的）饱和 （A） 无滤纸放入；溶剂和TLC/HPTLC板同时加入到展开室中。（B） 无滤纸放入；至少在层析展开开始前10分钟将溶剂倒入至展开室中。（C） 放入滤纸；至少在层析展开开始前30分钟将溶剂倒入至展开室中。（D） 放入滤纸；用溶剂蒸汽将在无溶剂的空槽中的TLC/HPTLC板调整其状况不少于10分钟。将展开室倾侧使层析展开开始。这方法只在用20 x 10 cm板的双槽展开室适用。用10 x 10 cm板的双槽展开室，溶剂需从外面用移液管或类似方法注入。温度 室温，通常为20 - 25?C空气湿度 无机薄层必须在室温，相对湿度50 - 60%下达到平衡检测 如各相应的方法所规定72 TLC板20 x 20和10 x 20 cm TLC预涂板的标准条件总结如下以便于参考。薄层 商品化生产的TLC板规格 20 x 20cm， 20 x 10cm或10 x 20 cm（标准的）板；由点样样品数目决定点样 斑状点样用标准的用后即弃的毛细管移液管，条状点样用自动点样器数量 一般，斑状点样用1 ml - 5 ml, 条状点样用2 - 20ml定位 起点在距板下缘15 mm处溶剂 数量限定采用体积量或绝对量。一般，对20 x 10 cm双槽展开室的一个槽加15ml,对20 x 20 cm双槽展开室的一个槽加25ml分离距离 对20 x 20 cm展开室为12 cm，对20 x 10 cm展开室为7 cm展开室 对20 x 20或20 x 10 cm板用双槽玻璃展开室分离模式 线性（上行式或水平的）饱和 （A） 无滤纸放入；溶剂和TLC/HPTLC板同时加入到展开室中。（B） 无滤纸放入；至少在色谱展开开始前10分钟将溶剂倒入至展开室中。（C） 放入滤纸；至少在色谱展开开始前30分钟将溶剂倒入至展开室中。（D） 放入滤纸；用溶剂蒸汽将在无溶剂的空槽中的TLC/HPTLC板调整其状况不少于10分钟。将展开室倾侧使色谱展开开始。这方法只在用20 x 10 cm板的双槽展开室适用。用10 x 10 cm板的双槽展开室，溶剂需从外面用移液管或类似方法注入。温度 室温，通常为20 - 25?C空气湿度 无机薄层必须在室温，相对湿度50 - 60%下达到平衡检测 如各相应的方法所规定铺板铺板用的匀浆不宜过稠或过稀：过稠，板容易出现拖动或停顿造成的层纹；过稀，水蒸发后，板表面较粗糙。匀浆配比一般是硅胶G:水=1：23，硅胶G:羧甲基纤维素钠水溶液=1:2。研磨匀浆的时间，根据经验来定，与空气湿度有关，一般通过拿起研