【毕业学位论文】荞麦种质资源遗传多样性分析硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 硕士学位论文 荞麦种质资源遗传多样性分析 士研究生： 赵丽娟 指 导 教 师： 张宗文 研究员 黎 裕 研究员 申请学位类别： 农学硕士 专 业： 作物遗传育种 研 究 方 向： 种质资源多样性评价 培 养 单 位： 作物科学研究所 提交日期 2006年6月 s. u 006 I 摘 要 荞麦（是一种重要的粮药兼用作物。本研究旨在分析中国荞麦栽培种的遗传多样性，探讨不同地理来源荞麦栽培种间的关系，为荞麦种质资源的保护和利用提供参考依据。 本研究对170份荞麦种质资源分别用所得数据计算遗传距离和遗传相似系数，进行聚类分析。 主要研究结果如下： 首次在我国利用立了适合的研究用19条引物分别对91份甜荞和79份苦荞种质的基因组1份甜荞共获得508条带，其中多态性带462条，79份苦荞共获得546条带，其中多态性带506条，聚类结果与地理来源有较强的一致性，来自辽宁、内蒙古、陕西、四川、甘肃等省的甜荞都是按来源各自聚为一类，来自云南、湖北、青海等省的苦荞也都按来源各自聚为一类。 应用所筛选的15对1份甜荞共获得641条带，其中多态性带547条，79份苦荞共获得621条带，其中多态性带537条，聚类结果与地理来源的一致性较小。 综合比较两种标记的研究结果发现不完全一样，苦荞的相关性分析发现两者相关系数为r=关性较高；苦荞的品种间遗传多样性高于甜荞，这两种标记的研究结果均证实了这一点；与多态性带的比率较低；用聚类结果中均发现了一些特殊的类型，两种标记的研究结果基本相符，建议对这些特殊类型进一步研究。 关键词 荞麦；传多样性 he is an in to It is in be as as as of is to of in to of is to A 1 9 In 508 of 62 of A 9 9 In 546 of 06 of to eis a of 5 In 641 of 47 of of 5 In 621 of 37 of to eis to we in in of by It be on in of 录 第一章 引言. 2 . 2 传多样性的概念与研究意义. 2 要遗传标记. 3 传多样性研究在种质资源研究中的应用. 8 传多样性分析. 9 . 11 麦的起源与分类. 11 . 12 麦资源的收集保存. 13 麦种质遗传多样性研究进展. 14 . 15 第二章 荞麦种质. 17 验材料. 17 验方法. 22 据处理方法. 27 . 28 荞. 28 荞. 33 . 38 . 38 荞种质的. 38 荞种质的. 39 荞和苦荞的遗传多样性比较. 40 第三章 荞麦种质. 41 验材料. 41 验方法. 41 . 44 . 45 甜荞. 45 荞. 49 . 54 . 54 荞种质的. 54 荞种质的. 55 荞与苦荞的. 56 第四章 荞麦. 57 . 57 . 58 . 58 . 58 . 59 . 60 . 60 . 60 第五章 结论. 62 . 62 . 62 参考文献. 谢. 者 简 历.国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 1英文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 烯酰胺 增片段长度多态性 叉双丙烯酰胺 代十六烷基三甲胺 二乙基二硫氨基甲酸 氧核糖三磷酸 二胺四乙酸 有效多元比率 点平均信息量 单序列重复区间 MI 分子标记指数 态性信息指数 of 态性位点百分率 制性片段长度多态性 单序列重复 NA 栖热水生菌酸/E N,N,N,N甲基乙二胺 三羟甲基氨基甲烷 U 位 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 2第一章 引言 遗传多样性的概念与研究意义 广义的遗传多样性是指地球上所有生物所携带的遗传信息的总和，但通常所说的遗传多样性是指种内基因的变化，包括种内显著不同的种群间和同一种群内的遗传变异，亦称基因多样性（钱迎倩等，1994）。遗传多样性(生物多样性(基本组成部分，是遗传信息的总和，蕴藏在地球上动物、植物和微生物的个体基因中，它决定着物种的发生、进化和变异(1990)。广义遗传多样性，包括物种以上的分类群以及种群以上的生态学系统的遗传多样性。但从群体遗传学角度讲，遗传多样性主要指种内的群体内和群体间的遗传变异，而孟德尔遗传学主要是在控制的环境条件下，研究物种内个体性状的遗传问题，这种意义上的遗传多样性称之为狭义的遗传多样性（施立明等，1993）。 遗传变异是物种进化的重要原料储备，一个物种的遗传变异愈丰富，对环境变化的适应性就愈大。反之，遗传多样性贫乏的物种通常在进化上的适应性就弱，也就是说，群体内的遗传变异反映了物种的进化潜力。从保护生物学的角度对物种遗传多样性的了解，有助于物种濒危原因的探讨以及对物种“命运”的预测。因此对遗传多样性的深入了解不但是动植物遗传育种的基础，而且也是为了适应未来人类需求的变化培育相应的品种做准备。 遗传多样性的研究具有重要的理论和实际意义。首先，物种或居群的遗传多样性大小是长期进化的产物，是其生存（适应）和发展（进化）的前提。一个居群（或物种）遗传多样性越高或遗传变异越丰富，对环境变化的适应能力就越强，越容易扩展其分布范围和开拓新的环境，理论推导和大量实验证据表明，生物居群中遗传变异的大小与其进化速率成正比，因此对遗传多样性的研究可以揭示物种或居群的进化历史（起源的时间、方式）也能为进一步分析其进化潜力和未来命运提供重要资料，尤其有助于物种稀有或濒危原因及过程的探讨。其次，遗传多样性是是保护生物学研究的核心之一。不了解种内遗传变异的大小、时空分布及其与环境条件的关系，我们就无法采取科学有效的措施来保护人类赖以生存的遗传资源（基因），来挽救濒于绝灭的物种，保护受威胁的物种，对珍稀濒危物种保护方针和措施的制定，如采样策略、迁地或就地保护的选择等，都有赖于我们对物种遗传多样性的认识。再次，对遗传多样性的认识是生物各学科重要的背景资料。对遗传多样性的研究无疑有助于人们更清楚地认识生物多样性的起源和进化，尤其能加深人们对微观进化的认识，为动植物分类、进化研究提供有益的资料，进而为动植物育种和遗传中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 3改良奠定基础。 当今的世界面临着人口、资源、环境、粮食与能源五大危机，这些危机的解决与地球上的生物多样性有着密切的关系，保护生物多样性已成为国际社会关注的热点。生物多样性是生物及其环境形成的生态复合体以及与此相关的各种生态过程的总和，它包括数以百万计的动物、植物、微生物和他们所拥有的基因以及它们与生存环境形成的复杂的生态系统。因此，生物多样性是一个内涵十分丰富的重要概念，包括四个层次：遗传多样性、物种多样性、生态系统多样性和景观多样性。其中，遗传多样性是生物多样性的核心，保护生物多样性最终是要保护其遗传多样性，因为一个物种的稳定性和进化潜力依赖其遗传多样性，而物种的经济和生态价值也依赖其特有的基因组成。物种的遗传多样性可以从形态特征、细胞学特征、生理特征、基因位点及要遗传标记 遗传标记(遗传物质特殊的易于识别的表现形式，是能够稳定遗传的、在生物个体之间具有丰富多态性的生物特征特性（贾继增，1996）。理想的遗传标记应具备以下特点：(1)多态性丰富，多态性越丰富，应用潜力就越大；(2)遗传稳定性高，一方面，基因型与环境之间的互作要尽可能小，另一方面，不因组织、器官、实验条件等的不同而产生差异；(3)共显性，共显性的遗传标记能够鉴别出纯合基因型或杂合基因型；(4)经济方便、易于操作和易于观察记载。目前的遗传标记主要有四类，即形态标记(细胞学标记(生化标记( 态标记是指那些能够明确显示遗传多态性的外观性状，如株高、穗形、籽粒颜色或芒毛等的相对差异。典型的形态标记用肉眼即可识别和观察。广义的形态标记还包括那些借助简单测试即可识别的某些性状如生理特性、生殖特性、抗病虫等。形态标记直观有效、测量简单，是长期以来作物种质资源评价、育种后代选择和遗传多样性研究的最基本标记。但由于形态标记数量少、可鉴别标记基因有限，多态性差，易受环境、生育期等因素的影响，而使其应用受到一定限制。 多基因控制的数量性状也可以作为遗传标记利用，但必须通过数量遗传学的方法尽量减少环境因素的影响。数量性状因更容易受环境条件的制约，用于检测种质之间的遗传差异难度更大（992）。 胞学标记是指能够明确显示遗传多样性的细胞学特征。染色体的结构特征和数量特征是常见的细胞学标记。染色体结构特征包括染色体的核型和带型。核型特征是指染色体的长度、着丝中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 4粒位置和随体有无等，由此可以反映染色体的缺失、重复、倒位和易位等遗传变异；带型特征是指染色体经特殊染色带型显现后，带的颜色深浅、宽窄和位置顺序等，由此可以反映染色体上常染色质和异染色质的分布差异。染色体数量特征是指细胞中染色体数目的多少，染色体数量上的遗传多样性包括整倍性和非整倍性的变异，前者如多倍体，后者如缺体、单体、三体、端着丝点染色体等非整倍体。 细胞学标记克服了形态标记易受环境影响的缺点，但这种标记材料的产生需要花费大量的人力物力进行培养选择。有些物种对染色体结构和数目变异的耐受性较差，难以获得相应的标记材料。某些物种虽然已有细胞学标记材料，但这些标记常常伴有对生物有害的表型效应，或有时观察和鉴定比较困难，从而限制了细胞学标记的应用。随着染色体研究技术的不断发展，如染色体分带和原位杂交技术的应用，拓宽了细胞学标记的可用性（贺学勤，2004）。 前主要的生化标记是同工酶和贮藏蛋白。同工酶是由同一基因位点不同等位基因编码的、具有同一底物的蛋白质分子，在同一物种不同的个体之间有不同的表现形式，具有组织、发育和物种的特异性。同工酶通常利用非变性淀粉凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳及特异性染色来检测，根据电泳谱带的不同来显示同工酶在遗传上的多态性。常用的同工酶包括：酯酶(过氧化物酶(过氧化氢酶(细胞色素氧化酶(超氧化物歧化酶(苹果酸脱氢酶(天冬氨酸转氨酶(乙醇脱氢酶(，因研究目的不同和物种各异而选用几种或十几种同工酶作为遗传标记。 蛋白质是基因表达的产物，与形态性状、细胞学特征相比，数量上更丰富，受环境影响更小，能更好地反映遗传多态性。但蛋白质标记仍然存在诸多不足，如每一种同工酶标记都需特殊的显色方法和技术；某些酶的活性具有发育和组织特异性；局限于反映基因组编码区的表达信息；标记的数量还是比较有限等。980）、994）曾对不同木豆种质资源种子中的蛋白和同工酶进行电泳分离，希望检测其多样性，但只得到了较少的多样性信息。 传统的遗传标记相比，够揭示生物遗传多样性的本质；怕是单个核苷酸的变异，因此满足各种要求；且受环境条件影响也不与不利性状连锁；只要利用足够量的可充分反映生物的客观性；而且有相当多的前，已开发了多种类型的分子标记，并已广泛应用于图谱构建、基因定位、基因克隆、分子标记辅助选择和育种等方面。历了第一代非代表技术为第二代是基于 第一章 引言 5术的代表技术有三代是以基因组测序结果为基础的代表技术有(1)非就是以类标记以记为代表，主要是利用限制性内切酶酶切不同生物的同位素或非同位素标记的随机基因组克隆、卫星或小卫星序列等作为探针进行过放射自显影或非同位素显色技术来揭示位、缺失和倒位等引起的。用广泛、具有代表性的基本原理是检测此，凡是可以引起酶切位点发生变异的突变，均可导致些作物，如玉米、水稻、番茄等，已有覆盖整个基因组的克隆。但是大多数作物还没有覆盖整个基因组的克隆，仍然需要研制特异探针。由于息完整、重复性和稳定性好等优点，已经成为一种经典的分子标记技术，应用于多种生物的遗传学研究中。但是比较消耗时间，也不容易实现自动化。需要对探针进行同位素标记，即使应用非放射性的然是个相当耗时费力的过程。 (2)基于类所用引物的核苷酸序列是随机的，其扩增的用这种标记技术可以在基因组中寻找未知的多态性座位作为新的前，常用的随机引物记是由常以10过产生的大小不同的需要的模板物没有物种限制，操作安全、简便、快速，目前已经广泛应用于遗传作图、基因定位、特殊染色体区段的鉴定与分离，种属特异性以及物种演化等研究中。作简单易行，不需要接触放射性物质，一套引物可用于不同生物的基因组分析，可以检测整个基因组。特别的是，如果将2种引物组合使用，还可以扩增出两端分别具有其中一种引物结合位点的生新的带型，找到更多的是此对设备、条件以及操作的要求都很严格，如果达不到要求，稳定性和重复性就很难保证。996）和王莉花等（2004）曾利用证实了其有效性。 简单序列重复区间， 第一章 引言 6出来的一种新技术，是由在1994年提出的。该技术检测的是两个基本原理是在3端加锚14个嘌呤或嘧啶碱基，然后以此为引物，对两侧具有反向排列不是扩增于8个碱基序列，由14个碱基组成的串连重复和几个非重复的锚定碱基组成，从而保证了引物与基因组3末端结合，通过复序列和锚定碱基是随机选择的，扩增产物经聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳分离后，每个引物可以产生比此靠、可以提供有关基因组丰富信息的需知道且可以揭示比以提供更多的关于基因组的信息，而且比验重复性更好(et 1999; et 998; et 1999; et 999)，现已广泛用于植物品种鉴定、遗传作图、基因定位、遗传多样性、进化及分子生态学研究中（et 1998 ;1999; 1997; 1999）。 异引物使用的引物是针对已知序列的有特定的核苷酸序列，引物长度通常为18在常规据引物序列的来源，主要可以分为记，即简单序列重复。其基本原理是，依据微卫星重复序列两翼保守的特定短序列设计引物，来扩增重复序列本身。由此可以看出，检测此，必须先了解找其中的特异保守区。由于重复序列的长度变化很大，所以这是一种检测多态性的有效方法。显性遗传，可以鉴定杂合子和纯合子；操作简便；结果重复率很高。为提高其分辨率，通常使用聚丙烯酰胺凝胶电泳，并结合银染，这样它可以检测出单拷贝差异。对于多态性扩增差异较大的引物，其4%的琼脂糖凝胶电泳检测即可。有逐渐取代前已经在人类和许多动植物中发展了该标记，如：拟南芥、水稻、大麦、小麦、大豆、玉米等。005）开发了5对可用于荞麦种质资源遗传多样性研究的限制性酶切和将两种技术有机结合的种是先将后再进行测其多态性的一种是先对样品对扩增产物进行限制性酶切检测其多态性的简称，是中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 7a)分析时基因组b) 多态性高；c)程序简单，不必通过此分析的周期大大缩短；4）无需预知引物序列；5）共显性。其基本原理是选择性扩增基因组于不同材料此其基本做法是先将后连上一个接头，根据接头的核苷酸序列和酶切位点设计引物，即：引物=接头+酶切位点+2或3个核苷酸，进行特异性可见此方法是把通过选用不同的限制性内切酶达到选择目的。 he 多态性十分丰富，利用放射性标记在变性的聚丙烯酰胺凝胶上可检测到100而非常适合用来绘制品种的指纹图谱、资源的分类及多样性研究。现在利用银染法也可在变性的聚丙烯酰胺胶上检测到丰富的扩增产物。001)通过比较了分别基于果表明，栽培苦荞麦可能起源于中国的西藏东部或云南的西北地区；005）利用4对到79条清晰的多态性带。 (3)以基因组测序结果为基础的类分子标记的代表技术有 标记即单核苷