【毕业学位论文】（Word原稿）南瓜种质资源多样性及亲缘关系的AFLP分析蔬菜学硕士论文

密级 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 南瓜种质资源多样性及亲缘 关系的 析 of of I 摘 要 南瓜属作物在世界范围内广泛分布，中国更是南瓜种植大国，具有丰富的南瓜种质资源。南瓜具有丰富的营养成分和极高的药用价值，因此，南瓜的开发利用受到越来越多蔬菜学家的关注。然而，长期以来南瓜属种质资源的搜集、保存、开发以及利用并没有得到足够的重视，品种混杂现象严重。所以，广泛搜集南瓜属种质资源，加强南瓜属种质资源 的整理、开发利用以及种质保存工作十分必要。本研究搜集了 88 份来源和类型不同的代表性南瓜属种质，开展南瓜属作物遗传多样性和亲缘关系研究，旨在从分子水平探讨南瓜属种质资源的多样性分布、亲缘关系以及在分类学上的地位，鉴别和发现新的基因源，为种质资源的收集、整理、保存和开发利用提供一定的理论和实践依据。主要研究结果如下： 本研究采用 形态学和分子角度对 88 份南瓜属蔬菜的遗传多样性以及亲缘关系进行了探讨。 通过对 64 对 E+2/M+3 引物组合的筛选，选出 10 对多态性较高，且带形清晰的引物组合。这 10 对引物组合共获得 515 条清晰可辨的标记，其中有 202 条多态性标记， 多态率最高的引物组合为 而最低的组合为 为 所以引物的选用对全面揭示南瓜属种质资源的遗传多样性是非常重要的。 同时使用 种软件，通过 所得的多态性标记进行聚类分析，两种软件聚类分析得出的结果完全一致，在相似性系数分别为 将供试材料分成了四大类群，即中国南瓜类群、美洲南瓜类群、印 度南瓜类群和黑籽南瓜类群。在四个类群中，黑籽南瓜和美洲南瓜的亲缘关系最近，和中国南瓜的亲缘关系次之，和印度南瓜的亲缘关系最远；三个常见的栽培种，即中国南瓜，美洲南瓜和印度南瓜三者之间，美洲南瓜和中国南瓜的亲缘关系较近，与印度南瓜的亲缘关系较远。 中国南瓜类群 以中国南瓜为主，该类群包括的种质数量较多，各种质间的叶形、瓜型、果实颜色等的差异也较大，这些种质的遗传多样性与我国南瓜栽培历史比较悠久，栽培地域辽阔，生态环境多种多样有关， 这从 为南瓜属种质资源的收集、开 发利用以及新品种的选育提供了重要的参考依据。 关键词：南瓜，遗传多样性，亲缘关系， is So to of a on of of is So it is to 88 or in to on of is to to of as In to 8 10 +2/M+3 4 A 15 of 02( On of by of 88 be . . . . . . . . . . of . to It NA 录 摘要 引言 1 第一章 文献综述 3 瓜的起源与演化 3 瓜的分类 3 瓜遗传多样性的研究 5 传多样性的概念及其研究意义 5 瓜遗传多样性研究 8 子标记技术在植物起源、演化及分类上的应用 8 要分子标记技术的类型及基本原理 8 子标记技术在南瓜遗传多样性 研究中的应用及研究进展 16 研究的目的和意义 16 第二章 南瓜遗传多样性及亲缘关系研究 18 料和方法 18 试材料 18 间性状调查 19 验地点和 设计 19 验材料植物学性状调查 19 子标记方法 19 取及浓度检测 20 应体系及银染程序的建立 20 丙烯酰胺凝胶电泳 22 据处理与分析 23 第三章 结果与分析 24 间试验材料植物学性状调查结果 24 应体系的建立以及对南瓜属蔬菜遗传多样性的检测 28 浓度与纯度 28 切连接及预扩增 28 择性扩增 29 瓜属蔬菜种质资源遗传多样性及亲缘关系的 类分析 32 第四章 讨论与结论 38 论 38 术研究生物遗传多样性的优势 38 于南瓜属植物的 系探索 38 染技术存在的问题的克服办法 40 不同聚类软件聚类图比较及拓扑结构可靠性分析 40 瓜属蔬菜亲缘关系探讨 40 研究对于南瓜属植物遗传育种的作用 41 论 42 参考文献 43 附录 47 致谢 48 作者简历 50 1 引言 南瓜 (葫芦科南瓜属的一个植物种群，是人类社会栽培较古老的作物之一，人类种植南瓜的历史可以追溯到公元前 4050 年，最早的中国南瓜和墨西哥南 瓜的碎片在公元前5000 3000年就已经存在了。 南瓜具有良好的栽培特性，对环境条件的适应性强，在世界范围内广泛栽培。据联合国粮农组织（ 计资料， 2002年全世界南瓜种植面积为 137万公顷，总产量 1691 万吨，在世界蔬菜作物种植产值中，南瓜居第位，年销售产值达 40 亿美元。 2002 年我国的南瓜种植面积约为25万公顷，占世界面积的 19%，总产量 410万吨，占世界当年产量的 赵一鹏等， 2004)。 在过去的很长一段时间内，南瓜只是用作救灾救荒，以及淡季蔬菜的替代品，或者被用作动物饲料，被人们 视为“上不了台面”的粗粮。但是随着对南瓜营养价值研究的深入，人们发现，南瓜不仅具有丰富的营养成分，还具有很高的药用价值。南瓜中胡萝卜素、钾和磷含量丰富 , 胡萝卜素含量可与胡萝卜、番茄相媲美；南瓜还含有果胶、南瓜多糖、甘露醇、寡氨酸、生物碱、南瓜籽碱、葫芦巴碱、色素、降血糖多肽物质等。其中，南瓜多糖有降血糖、血脂、提高肌体免疫力之功效；果胶具有很好的吸附性 ,能粘接、消除体内细菌毒性和其它有害物质 ,预防和治疗动脉粥样硬化 ,保护胃肠道粘膜免受粗糙食品刺激 ,促进溃疡愈合；葫芦巴碱有减肥和降血糖的作用；南瓜中还含有丰 富的 生物 ,能降低肌体对致癌物质的敏感程度 ,防止癌变 ,还含有一种可分解亚硝铵的酶 ,对防癌也有一定的作用 (李新峥等 ,2004)。随着人们对南瓜认识的不断深入，南瓜走上了高档餐桌，成为人们的膳食新宠。 南瓜种质资源非常丰富，就其含的物种的量而言，超过了蔬菜中的两大家族芸薹属（ 番茄属 (丰富的种质资源类型以及世界范围内栽培条件的多样性带来了南瓜属蔬菜极为丰富的多样性，被誉为多样性之最 (王鸣， 2002)。南瓜的多样性包括：生育期的多样性，既有早熟、中熟、晚熟类型；植株 形态多样性：包括长蔓、短蔓、中蔓、矮生等类型；果实形状多样性，有球形、扁圆形、葫芦形、椭圆形等；果实大小多样性，大的果实达到几百公斤，小的果实只有几十克；果实色彩多样性，有红、白、黄、绿、复色等；利用多样性，可鲜食、籽用、药用、观赏、加工等。但是，如此丰富的种质资源似乎并没有得到人们广泛地开发利用，就我国而言，目前南瓜的栽培主要以民间栽培为主，品种混杂，同物异名和同名异物现象严重，为南瓜种质资源的收集、保存和利用造成了一定的困难，所以加强南瓜种质资源的调查、整理、利用，对稀有种质资源的保存成为南瓜植物育种工 作中迫切需要解决的问题。 在中国乃至世界范围内，对南瓜的研究工作相对较少，传统的遗传多样性与亲缘关系研究一般从形态学角度进行，目前已有学者用同工酶电泳和 术对南瓜亲缘关系进行研究，但是总的看来，研究群体的代表性还不够，并且，由于研究方法的限制性，研究内容也无法更加深入地进行。所以采用更加可靠的分子标记技术对南瓜属的遗传多样性以及亲缘关系进行深入探讨是一项十分重要的研究课题。 本研究以不同地区不同类型的代表性南瓜属种质为材料，在前人研究的基础上采用 子标记技术开展了南瓜种质资源遗传多样性、亲缘 关系和分类的研究，主要目标如下： 2 1 了解供试南瓜种质资源在不同水平上的遗传多样性状况； 2 分析不同来源南瓜种质遗传多样性的特点； 3 明确不同类型南瓜种质资源的遗传进化关系和分类地位。 本研究为南瓜的起源、演化和分类提供新的理论依据，为进一步的遗传多样性评价和核心种质构建提供技术支持，进而提高南瓜种质资源收集、鉴定、评价、管理、利用和创新的效率，更有效地为育种和生产服务。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 3 第一章 文献综述 瓜的起源与演化 南瓜是葫芦科（ 瓜属（ 菜作物， 2n=2x=40。 1936 年，园艺学家、浙江大学教授吴耕民先生，依据法国罗典的分类意见，将南瓜的 3 个主要栽培种命名为：中国南瓜、印度南瓜和美洲南瓜（林德佩， 2000），但是，中国、印度和美国并不是这三种南瓜栽培种的初生起源中心。 目前，公认的南瓜属植物起源于美洲大陆，具体由两个中心地带：一是墨西哥和中南美洲，是美洲南瓜 ( 搅瓜 )、中国南瓜 (、墨西哥南瓜 (名灰籽 南瓜 )，可能还有黑籽南瓜 (栽培种的初生起源中心。二是南美洲的秘鲁南部、玻利维亚和阿根廷北部，是印度南瓜 (栽培种的初生起源中心（ 962; 983）。 20 世纪 20 年代起，美国、前苏联等国家派出多批探险考察队赴墨西哥、危地马拉、秘鲁等国调查南瓜栽培植物及其野生近缘种的起源和分布。美国怀特克等在墨西哥奥克沙卡 (窟的考古发掘中的出土物证明，早在公 元前 8500 年，人类就开始食用美洲南瓜，而人类开始栽培美洲南瓜则在公元前 4050 年。最早的中国南瓜和墨西哥南瓜残片是怀特克等在墨西哥奥坎波(窟和秘鲁胡阿沙普雷塔 (址的出土发掘中发现，存在于公元前 50003000 年。至于南美洲唯一起源的印度南瓜，据卡特等的发掘报告，在秘鲁圣里约哈纳斯 (址，出土的印度南瓜残片不早于公元前 1800 年（林德佩， 2000；赵一鹏等， 2004）。 目前，南瓜已经在世界范围内大面积种植，但是其多样性中心依然集中 在它的起源地，中国南瓜从墨西哥城南经过中美洲，延伸至哥伦比亚和委内瑞拉北部。墨西哥南瓜从墨西哥中部延伸至尤卡坦半岛抵哥斯达黎加。美洲南瓜主要在墨西哥北部。黑籽南瓜从墨西哥中部，经中美洲高原沿安第斯山抵智利中部。而印度南瓜的多样性中心则集中在南美阿根廷、玻利维亚北部，秘鲁南部和智利北部（林德佩， 2000）。 瓜的分类 据英国著名葫芦科分类学家杰弗里研究，葫芦科是一个中等大科，全世界大约有 130 个属900 个种（ 980）。在我国，据中国植物志 73 卷第 1 分册记载，我国葫芦科植物有 32 个属154 个种 35 个变种。南瓜属植物是葫芦科中葫芦亚科（ 个组成部分之一。据艾斯奎纳斯 阿尔卡扎等报道，全世界的南瓜属植物中栽培南瓜及其野生近缘种共有 27 个 (983)。 在表 除了与人类关系比较密切的五大栽培种：中国南瓜、印度南瓜、美洲南瓜、黑籽南瓜、墨西哥南瓜外，还有抗病的野生南瓜种质，如：高抗白粉病的阿克丘宾南瓜和龙德里南瓜，高抗病毒病的厄瓜多尔南瓜，高抗白粉病、病毒病的马提尼南瓜，可作为油料作物的油瓜（由于这些南瓜种质在 国内不太常见，所以并没有明确的定名，以上只是音译名），以及其他一些在国内不太常见的类型。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 4 表 瓜属种名录 名 种名 习性 生态环境 染色体 2n 产地 用途 C. 度南瓜 l 年生栽培 低地种 40 全球 熟果、花、叶、种子可食 西哥南瓜 1 年生栽培 低地种 40 全球 熟果、花、叶、种子可食 国南瓜 1 年生栽培 低地种 40 全球 熟果、花、叶、种子可食 洲南瓜 1 年生栽培 低地种 40 全球 熟果、花、叶、种子可食 德列南瓜(拟 ) 1 年生 湿地，低地 40 阿根廷 杂草 C. 利福尼亚南瓜 多年生野生 旱生、低地 40 美国南加州 亚利桑那州 杂草 杂草 形南瓜 (拟 ) 多年生野生 旱生、低地 40 墨西哥 杂草 形南瓜 (拟 ) 多年生野生 旱生、低地 40 墨西哥 杂草 C 形南瓜 (拟 ) 多年生野生 旱生、低地 40 美国，墨 西哥 杂草 瓜 (拟 ) 多年生野生 旱生、低地 40 美国，墨西哥 杂草，潜在油料 拉特南瓜(拟 ) 一年生野生 湿地，低地 40 墨西哥 杂草 洛提南瓜(拟 ) 多年生野生 旱生，低地 40 墨西哥 细南瓜 (拟 ) 多年生野生 湿地，低地 40 墨西哥 利南瓜 (拟 ) 1 年生野生 湿地，低地 40 墨西哥 德里南瓜(拟 ) 多年生野生 湿地，低 地 40 危地马拉、伯利兹 高抗白粉病 C 提尼南瓜(拟 ) 1 年生野生 湿地，低地 40 墨西哥 抗白粉病，病毒病 C 勒南瓜 (拟 ) l 年生野生 湿生低地 40 墨西哥 阿克丘宾南瓜 (拟 ) 1 年生野生 湿生低地 40 美国佛罗里达州 高抗白粉病 掌状南瓜 (拟 ) 多年生野生 旱生，低地 40 美国南加州 尔双南瓜(拟 ) 多年生野生 湿生低地 40 墨西哥足叶南瓜(拟 ) 多年生野生 湿生低地 40 墨西哥生根南瓜 (拟 ) 多年生野生 湿生低地 40 墨西哥 糙叶南瓜 (拟 ) 多年生野生 旱生、低地 40 墨西哥北部 果南瓜 (拟 ) l 年生野生 湿生低地 40 墨西哥国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 5 续表 德克萨斯南瓜 (拟 ) 1 年生野生 湿生低地 40 美国得克萨斯州 黑籽南瓜 多年生栽培 高地种 40 墨西哥一智利 作瓜类砧木，抗病，耐低温 瓜多尔南瓜 (拟 ) 野生 低地 40 厄瓜多尔 高抗病毒病 在我国常见的南瓜属植物有四个栽培种：即中国南瓜 (又名倭瓜、饭瓜；印度南瓜 (又名笋瓜；美洲南瓜 (又名美国南瓜、西葫芦；黑籽南瓜 (徐东辉， 2004）。这四个栽培种中黑籽南瓜属多年生高地栽培种，因其独特的抗性和适应性，一半用于砧木南瓜，故 可以明显的与其他三种区分开，其他三种南瓜的主要特征见下表 (利用表中的特征可以鉴别这几个栽培种。 表 国南瓜，印度南瓜和美洲南瓜的主要特征 C . 官 中国南瓜 度南瓜 洲南瓜 蔓 中等硬度，细，茎五棱 软，粗，近圆形 硬，有棱沟 叶 叶裂浅或五角形，叶脉分叉处有白斑，有绒毛 叶裂浅 叶裂浅，圆或心形 ,无白斑，右中 等长刺毛 叶裂深，卵形，部分有白斑，背有刺毛 花 花冠裂片大，展开，雄蕊细长 花冠裂片外垂，雄蕊粗短 花冠裂片狭长，雄蕊粗短 果梗 硬，细长，有棱，基部膨大呈五角型 软，圆筒形，草质，不膨大 硬，短，基部稍膨大，有棱 果肉 细或有胶质纤维 细 粗 种脐 钝，稍对称 尖，对称 钝，对称 种缘 隆起，色较暗，钝 光滑，色与种面同，钝 光滑，有窄边，钝 用途 果实种子供食用 果实种子供食用 果实种子供食用 瓜遗传多样性的研究 传多样性的概念及其研究意义 遗传多样性（ 生物多样性 (重要组成部分，所以要讲遗传多样性，我们必须首先引入生物多样性的概念。根据联合国生物多样性公约，生物多样性(指所有来源的活的生物体中的变异性，包括陆地、海洋和其他水生生态系统及其所构成的生态综合体（ et 1993 ，陈灵芝， 1993）。生物多样性是生物及其环境形成的生态复合体以及与此相关的各种生态系统的总和，包括数以百万计的动物、植物、微生物和它们所拥有的基因以及它们与生存环境形成的复杂的生态系 统，所以当今世界所面临的人口、资源、环境、粮食、能源五大问题都与生物多样性密切相关，解决好生物多样性问题是保证人类社会可持续发展的重要前提。生物多样性包括四个层次：遗传多样性、物种多样性、生态多样性和景观多中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 6 态性（马克平， 1993），其中遗传多样性（ 生物多样性的核心。 广义的遗传多样性是指地球上所有的生物所携带的遗传信息的总和，但是一般所指的遗传多样性是指种内的遗传多样性，即种内个体之间或一个种群内不同个体的遗传变异总和 (钱迎倩，1994)。种内多样性是物种以上的各种水平 多样性的最重要的来源。对遗传多样性的系统研究始于达尔文（ 1809 1882）的物种起源，他将生物中普遍存在的有遗传倾向的变异现象称为多样性。遗传多样性的主要来源是 子结构的突变，在物种长期的进化过程中，物种与环境条件相互适应，发生基因水平的变异，反映在植物上的就是植物遗传物质即 生突变，不同的生态环境使这些突变向着不同的方向发展，在长期的选择过程中一些适应环境的突变被积累下来，形成了各种环境下的不同个体类型，于是就有了我们现在所看到的多种多样的生物，以及物种之间、之内的差别。 不同植物类型遗 传变异的来源也不同，对大范围连续分布的异交植物来说，遗传变异的大部分存在于群体之内，同一群体，个体之间会产生不同的变异类型；而对自交为主的植物来说，群体之间的遗传变异明显大于群体之内；至于以无性系为主的植物，因为每个无性系内大部分位点都是纯合的，形态变异也很小，而不同无性系之间都有很大或明显的差异，遗传变异分布在无性系之间（夏明， 1999）。 遗传变异既是生物保持生物特性稳定遗传的基础，也是物种发生、选择、进化的基础。一个物种或群体的进化潜力和抵御不良环境的能力既取决于种内遗传变异的大小，也有赖于遗传变异的 群体结构 (V. 1991)。一个物种或群体遗传多样性越大或遗传变异越丰富，对环境变化的适应能力就越强，越容易扩展其分布范围和开拓新的生存环境。物种或群体中遗传变异的大小与进化的快慢成正比（董玉琛， 1995；马克平等， 1994）。 遗传多样性的研究具有重要的理论和现实意义。首先，物种或居群的遗传多样性大小是长期进化的产物，是其生存和发展的前提，一个居群（或物种）遗传多样性越高或遗传变异越丰富，说明这一居群（或物种）对环境变化适应的能力越强，越容易扩展其分布范围和开拓新的环境。研究证明生物居群中遗 传变异的大小与其进化速度成正比，因此可以通过对一些物种遗传多样性的研究推测其起源与进化的历史。其次，生物起源与进化知识，为动植物的分类进化研究提供有益的资料，进而为动植物育种和遗传改良奠定基础。再次，遗传多样性是保护生物学的核心之一，通过对物种遗传多样性的研究了解种内变异的大小，时空分布以及与环境条件的关系，从而制定有效的措施保护人类赖以生存的遗传资源，挽救濒于灭绝的物种，保护受威胁的物种。 自 19 世纪达尔文的物种起源发表以来，遗传多样性的研究就在世界范围内发展开来，检测遗传多样性的方法也随着生物技术的 提高和实验手段的改进而不断的发展，总的来说遗传多样性的研究方法主要有以下几种。 态标记 形态标记是指那些在生物的生长发育过程中，遗传力较高的容易被识别的质量性状和差别较大的数量性状，是最直观的、可以进行描述的形态学特征特性（王志峰， 2003）。如植物的果实形状、株高、花的性型等等。由于简单直观，容易观察记载，长期以来形态学标记被广泛的应用于植物的分类和种质资源鉴定，一些植物的形态学指标也是植物分类的重要依据。 形态学标记分为质量性状的标记和数量性状的标记，对于质量性状，由于不易受到环境条件中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 7 的 影响，遗传力较强，可以明显的用简单的方法加以区分鉴别；对于数量性状而言，由于数量性状易受到环境条件的影响，不同的栽培条件会产生不同的调查结果，所以，在以数量性状为标准调查植物的性状时，必须在相似的环境条件下进行，并且要先设计一套严格的调查标准，力争使调查结果客观。在注意到这一点之后，许多的研究者利用形态学标记对于植物的分类以及形态标记辅助选择育种方面取得了很多的成果（栾非时， 2001；王志峰， 2003）。 形态学的缺点是数量较少，往往不足以区分所研究的材料，并且数量性状的遗产机制比较复杂，遗传表达易受到基因 互作及环境条件的影响，遗传力较低，遗传不稳定，所以形态学标记的应用受到一定的限制。 胞学标记 1903 年， 遗传因子同染色体结合起来，形成了细胞遗传这一学科。染色体数目及结构的变化常常引起表型的变化，因此染色体的变化可以作为一种遗传标记。 细胞学标记(要是指利用染色体核型 (染色体数目、大小、随体、着丝点位置等 )及带型 (带、带、带等 )为指标进行的遗传标记。 核型指染色体总数、染色体组数、每条染色体的大小和形态及着丝点的位置等 。人们可以通过染色体的变化 (诸如缺体、单体、三体、缺失、重复、易位等 )来了解物种起源和生物进化。染色体分带 (借助于一套特殊的处理程序，使染色体显现出深浅不同的带纹，常见染色体带型有 C 带、 G 带、 R 带、 Q 带等（李竟雄，1997）。染色体的数目、位置、大小与染色深浅具有相对的稳定性。因此它完全可以作为一种遗传标记来区分不同物种和同一物种的不同种群。 细胞学标记的缺点在于 染色体分带技术的技术性较强，易受实验条件的影响，且大多数染色体具有这种细胞学标记数目有限，导致细胞学标记对 某些不具有特异性带型的染色体或片段进行鉴定时结果的可靠性略差（李柱刚， 2001）。 细胞学标记在以往的研究中也发挥了重要的作用。彭正松等（彭正松等， 1998）通过对圆锥小麦高亲和种质的 C 带分析，证明染色体重排是小麦属植物进化中可遗传变异的来源之一。另外，关于利用细胞学标记的研究还有很多（彭正松等， 1997；黄荣福等， 1996；贺昌锐等， 1996），这些研究在物种遗传变异和进化关系上提供了可靠的依据。 化标记 生化标记 (主要是指同工酶标记，是鉴定外源 研究物种起源进化的有效工具，与形态学标记相比，生化标记能够提供更多的差异信息， 1952 年， 次获得两种类型的乳酸脱氢酶的结晶体，并证明它们为同工酶，即来源相同、催化反应性质相同而分子结构不同的蛋白质分子。蛋白质是遗传物质表达的产物，因此同工酶可以作为遗传标记（李柱刚， 2001）。同工酶也与特殊的生理功能和细胞代谢有关，它作为生理指标的同时，也可以探讨基因的进化和物种的演变，以及生物发育过程中基因的表达与调控。同工酶标记有以下优点： 1. 表现为共显性，可区分杂合、纯合、隐性基因； 2. 所 需材料少，简便，在种子或幼苗期就可以进行检测； 3. 表现稳定，不受人工和自然选择的淘汰（ D,1983）。同工酶标记的缺点在于：同工酶的表达存在阶段特异性和器官特异性，这就给同工酶资料的收集增加了难度 （ 沈法富 ,1997;张鲁刚， 1998）。所以，同工酶标记真正可以利用的位点很少。 子标记 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 8 分子标记分广义和狭义两种。广义的分子标记是指可遗传的并可检测的 列或蛋白质 ,包括生化标记在内。狭义的分子标记只包括 记。随着分子生物学的发展 ,人类发明了一些基于 标记。 1974年 是最早发展的分子标记。 1987年 传图谱（ ，1980） ,开创了分子标记应用的新纪元。 近 20年来 ,特别是在人类基因组研究计划的推动下 ,分子标记的研究与应用得到了迅速发展。 与形态标记、细胞标记、生化标记相比 ,分子标记有以下优点 :直接以 形式表现 ,在植物的各个组织、器官及整个发育时期均可检测到 ,不受阶段特异性、器官特异性和环境的限制；表现为共显性 ,可以能 够鉴别出纯合基因型与杂合基因型 ,对隐性的农艺性状选择有利；数量多 ,覆盖整个基因组；表现为“中性” ,目标性状与不良性状无必然的连锁；多态性高 ,自然中广泛存在着变异 ,不需要遗传材料进行特殊的处理（贾继增， 1996）。 瓜遗传多样性研究 南瓜所属的南瓜属是一个大的族群，全世界的南瓜属植物中栽培南瓜及其野生近缘种共有 27个 (983)，它起源于美洲，但在世界各地广泛栽培，经过长期的进化形成了很多的栽培种，目前与人们的生活密切相关的共有四个栽培种：即中国南瓜 (印度南瓜 (美洲南瓜 (黑籽南瓜 (并且每一个栽培种又有许多的类型和品种。就其所含物种的数量而言，超过了蔬菜中的两大家族芸苔属 (番茄属(因此南瓜属蔬菜拥有十分丰富的基因库，从而也导致了南瓜属蔬菜在表型性状上的多样性，如：南瓜的果实形状有长、圆、椭圆、扁圆、长颈、曲颈、梨形甚至还有皇冠型、飞蝶形；果实的颜色有黑、绿、墨绿、红、白、橙红、金黄等等；南瓜的种子也具有多种多样的特征，种 子大小、形状、色泽以及种皮的的厚度等都有其他物种无法比拟的多态性。 南瓜遗传的多样性直接带来了其用途的多样性，南瓜因其丰富的营养价值被制成各种制品供人们食用，因其高产性被用于家畜的饲料，因其果实不同的形状和丰富的颜色被用于观赏，黑籽南瓜因为抗病抗逆性强而被用作砧木，另外，随着人们对南瓜营养成分认识的加深，其医疗价值和保健作用越来越多的被人们关注。 在生物学领域关于南瓜遗传多样性的研究也在逐渐展开，主要集中在不同南瓜中亲缘关系的探讨方面， 用 术分析了非洲南部本地中国南瓜资源的遗传多 样性（ 2000）；李海真等用 术对南瓜属三个种中 23 个品种（系）的起源关系进行了鉴定（李海真， 2000）；孙正海等用过氧化物同工酶标记对南瓜属三个种 41 份种质的遗传多样性进行了研究（孙正海， 2004，）。这些研究，不仅对供试的材料之间的亲缘关系进行了鉴定，也为不同南瓜品种之间起源、进化关系提供了可靠的证明，对于南瓜的杂交育种提供了可靠的依据。 子标记技术在植物起源、演化及分类上的应用 要分子标记技术的类型及基本原理 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 9 分子标记是指以生物大分子的多态性为基础的 遗传标记（张海英 ,2002）。分子标记技术因其不受环境条件的影响，多态性高，信息量广而在生物技术领域广泛应用。广义的分子标记技术包括两类，即：同工酶标记和 记，狭义的分子标记只是指 记，以下部分对主要分子标记的类型、特点及应用作简要概括。 工酶标记（ 同工酶是指一个以上基因座位编码的酶的不同形式，同工酶作为一种直接的基因产物在作物遗传育种中得到了广泛的应用。同工酶的分析方法是从植物组织的蛋白粗提物中通过电泳和组织化学染色法将酶的多种形式 转变成肉眼可辩的酶谱带型。现在已开发出酯酶同工酶、过氧化物同工酶等几十种同工酶系统。与形态标记、细胞学标记相比，同工酶标记有以下的优点： 1. 受环境因素的影响较小，表现出相对的稳定性； 2. 表现近中性，对植物经济性状一般没有大的不良影响。 同工酶标记的主要原理是：同工酶的差异主要由决定酶蛋白本身的等位基因或非等位基因的不同造成的，因此只要酶的变异上存在明显的差异，就可以对同一物种内不同种、变种、品种、品系间的遗传变异进行有效的检测，从而确定它们彼此间的亲缘关系。目前，已经通过比较不同同工酶酶谱带之间的差异， 对很多物种的亲缘进化关系进行了比较。 同工酶标记探讨了 12 个桃栽培种之间的亲缘关系（ 2001） , 利用同工酶标记对几个早花姜的品种进行了分类；曹辉庆利用同工酶和 记对葡萄亲缘关系进行了研究（曹辉庆， 2002），郑晓鹰对大白菜（郑晓鹰， 1997）的亲缘关系进行了研究。 由于等位基因的同工酶受共显性等位基因的控制，互补性及杂种性酶谱可以在杂种中表现出来，因而同工酶标记也是检测杂种种子纯度的有效方法。漆小泉 用两种同工酶对甘蓝与大白菜一代杂种及双亲幼苗纯度进行了分析（漆小泉， 1993）；郑晓鹰等用过氧化物酶及酯酶同功酶鉴定了大白菜杂交种纯度（郑晓鹰， 1994）；此外，纪颖彪对黄瓜