【毕业学位论文】（Word原稿）两个水稻花器官突变体的遗传分析生物化学与分子生物学博士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 博士 学位论文 两个水稻花器官突变体的遗传分析 of he of I 摘 要 水稻是世界上最重要的粮食作物之一，也是单子叶植物发育分子生物学研究的理想模式植物。水稻花器官的结构明显不同于双子叶植物 ， 正常水稻的小花从外到内依次由 1 个 外颖、 1 个 内颖、 2 个浆片、 6 个雄蕊和 1 个雌蕊组成。 植物花发育突变体的获得和研究，在揭示花发育相关基因的作用及其相互关系， 探明植物生殖发育，特别是花发育的奥秘中起了十分重要的作用。水稻作为 粮食作 物的代表，研究 其 生 殖发育机制具有重要的理论意义和应用价值。 目前对水稻花发育的研究主要是利用双子叶植物 因的保守序列设计引物，在水稻基因组文库或 库中筛选与双子叶植物花器官发育相对应的 基因，然而大多数基因的确切功能因缺乏与性状的连接点而无法确定。显然，没有花器官异常发育的突变体是难以开展此项研究的；而且，利用突变体研究基因的表达与功能也是当前功能基因组学的发展方向。 水稻花器官的发育结果直接影响稻谷产量 。 因此，利用水稻颖花突变体研究单子叶植物花器官发育的分子调控机制是目前植物分子遗传学的研究热 点。 我们从突变体库中分别发现 3 份多颖突变体和 1 份凹陷内颖突变体。本研究对这两种突变体进行了花器官的解剖结构观察，突变性状遗传分析和相关基因的精细定位研究，主要结果如下： 1. 多颖突变体 研究 （ 1） 3份突变体的等位性实验： 对 3份多颖突变体 进行正反交，并对 果表明这 3个突变体是等位的，相应的突变体分别命名为 （ 2）突变性状的遗传分析：以水稻 本晴和 浙辐 802为母本配制杂交组合进行性状遗传分析。所有组合 的表型， 说明突变体性状是受隐性基因控制。 根据 2测验结果表明，正常株与突变株的比例符合 1对基因控制的分离比 3:1，即该突变性状是受 1对隐性基因控制的。 （ 3）花器官解剖结构观察：与正常水稻颖花结构相比， 3个突变体大部分小花表现为多出一个颖壳，同时还会 表现为 雄蕊和雌蕊数目的改变、浆片转变为类似颖壳的结构，但是有一小部分小花是正常的。 浆片和雌雄蕊基本无变化或变化很小； 但是 出一个颖壳外， 该突变基因 还影响到所有的花器官，雄蕊数目在 0蕊数目在 0些小花的中心还产生了无法分辨的分生组织，约 25%的小花中，浆片同源转化为类似颖壳状的结构，特别值得注意的是，在 少 20%的小穗在小花中心（ 3、 4轮）的花柄产生一至多个小花，这些额外的小花具有类似颖壳状的结构，偶尔含有 1外，一些 （ 4）突变体 基因精细定位：利用图位克隆方法， 从 2代中鉴定出突变体表型的植株用作定位群体，运用 染色体短臂上 物理距离为 31 在这一区域内，共有 2个开放阅读框。 2. 凹陷内颖突变体 研究 （ 1） 水稻凹陷内颖突变体的遗传分析： 在抽穗期，对 本晴 2个组合的 2代植株进行调查。结果表明， 2个组合的 明突变体性状是受隐性基因控制。对 2测验结果均为 2 c2 0 . 0 5=正常株与突变株的 比例符合 1对基因控制的分离比 3:1，进一步表明该突变性状是受 1对隐性基因控制的。 （ 2） 花器官观察：突变体颖花除了正常水稻颖花所具有的 1个外颖、 2枚浆片、 6枚雄蕊和 1枚雌蕊外，也具有 1个内颖，但是发育不良，致使整个小花呈弯曲状。 （ 3） 突变体 基因 精细 定位： 利用 图位克 隆 方法， 从 与 用 染色体短臂上 物理距离为 17 在这一区域内， 只 有 1个开放阅读框。 关键词 ： 水稻 ， 花器官 ， 发育 ， 遗传分析 ， 基因 ， 精细定位 .) is of in a of in an of A of as of in an a of on to an in of in in on is in in 0 by of of as or it is to of A of of is a in s on of of of of in We of of is In we of of of of as 1. of ( 1） as （ 2） of in 1 2 In 1 is in 2 of in a :1 is by （ 3） of No in of in to in an of of a ee In of in or no in of of as an or in , in , in of a of or in a of at 0% of or in c of , 4) of -3 （ 4） G1 To G1 by a G1 in .7 cM on by We G1 to a 31 kb by 13 F2 2. of ( 1） of of is （ 2） of in 1 2 In 1 is in 2 of in a 3:1 is by V （ 3） P2 P2 in .8 cM 45 on by We P2 to a 17 kb by 038 F2 录 摘 要 . I . 文缩略表 . 1 第一章 绪论 . 2 言 . 2 等植物花序和花器官发育的分子生物学研究 . 3 花序形成的分子生物学 . 4 器官发育的 分子生物学 . 5 双子叶植物花器官的区别 . 10 稻花发育研究进展 . 10 稻花分生组织特征基 因 . 10 稻花器官发育基因的研究 . 12 子标记及其在水稻遗传研究中的应用 . 15 子标记的研究 进展 . 15 于分子杂交的分子标记 . 15 于 分子标记 . 16 酶切相 结合的分子标记 . 17 型分子标记 . 18 子标记在水稻遗传研究中的应用 . 19 稻分子遗 传连锁图谱的构建 . 19 稻基因定位和克隆 . 20 子标记在水稻育种上的应用 . 20 稻基因 的图位克隆 . 21 位克隆的技术环节 . 22 建遗传作图群体 . 22 选与目标基因连锁的分 子标记 . 23 部区域的精细定位、作图 . 24 色体步行、登陆 . 25 定目标基因 . 25 位克隆技术在水稻中的应用 . 26 研究的目的和意义 . 30 第二章 水稻多颖突变体的鉴定、遗传分析及基因 的精细定位 . 31 料和方法 . 31 验材料 . 31 间杂交及 传群体的构建 . 31 常用分子生物学试剂 . 31 验方法 . 32 份突变体的等位性分析 . 32 颖突变体的遗传分析 . 32 态解剖学观察 . 32 稻 取 . 32 应体系 . 33 泳检测 . 33 定位的 记 . 34 过新发展的 记精细定位 因 . 34 据分析 . 35 果与分析 . 35 稻多颖突变体的等位性测定和遗传分析 . 35 份突变体的等位性实验 . 35 颖突变体的遗传分析 . 35 稻多颖突变体 形态特征 . 36 变体的植株形态 . 36 花的解剖结构 . 36 稻多颖 因的精细定位 . 38 因的初步定位 . 38 用新发展的 记精细定位 因 . 38 论 . 40 第三章 水稻凹陷内颖突变体的鉴定、遗传分析及基因的精细定位 . 42 料和方法 . 42 验材料 . 42 间杂交及 传群体的构建 . 42 用分子生物学试剂 . 42 验方法 . 42 果与分析 . 42 稻凹陷内颖突变体的遗传分析 . 42 稻凹陷内颖突变体 形态特征 . 43 稻凹陷内颖 因的精细定位 . 44 因的初步定位 . 44 用新发展的 记精细定位 因 . 44 论 . 45 第四章 结论及进一步的研究设想 . 47 论 . 47 颖突变体 研究 . 47 凹陷内颖突变体 研究 . 48 一步的研究设想 . 48 参考文献 . 49 致 谢 . 60 作 者 简 历 . 61 中国农业科学院博士学位论文 第一章 绪论 1 英文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 细菌人工染色体 局部排列搜索工具 bp 基对 割扩增长度多态性 补 摩 溴化十六烷三甲基铵 氧核糖核酸 DH 倍单倍体 脱氧核糖核苷三磷酸 乙二胺四乙酸 基磺酸乙酯 表达序列标签 kb 碱基对 等基因系 1质粒人工染色体 聚合酶链式反应 量特性定位 糖核酸 组自交系 转录聚合酶链式反应 二烷基硫酸钠 单序列重复（微卫星） 列标签位点 中国农业科学院博士学位论文 第一章 绪论 2 第一章 绪论 言 水稻 (.)是人类赖以生存的 主要粮食作物，全世界约有 1/2 的人口以大米为主食。水稻不仅是重要的粮食作物，而且还是单子叶植物分子生物学研究的模式植物。水稻的基因组是禾谷类作物中最小的，有 38995%完成测序(2005)；水稻中已经建立了高密度的分子标记连锁图 (水稻基因组与其他禾本科作物如小麦、玉米等有很高的共线性和基因间的同源性，在比较基因组研究中有较大的利用价值 (1998； 2003)；水稻中建立了比较良好的遗传转化系统 (et 1994)，目前已成为遗传学和基因组研究的模式植物。 双子叶植物的花从外到内依次花萼、花瓣、雄蕊和心皮四轮花器官组成。单子叶植物的花分生组织及花器官组成的许多特征明显不同于双子叶植物。水稻等在单子叶植物的花具有与双子叶植物类似的雄蕊和雌蕊繁殖器官， 但它们没有明显的双子叶植物所具有的花萼和花瓣结构，围绕雄蕊和雌蕊繁殖花器官的是外颖、内颖和浆片。水稻的花器官在禾本科单子叶植物中具有代表性。水稻花序分生组织的单位是小穗，小穗由小花和两个颖片组成，小花从外到内依次由外颖、内颖、2个浆片、 6枚雄蕊和 1个雌蕊 (包括 1个子房和 2个柱头 )组成 。 禾本科植物的花器官雄蕊和雌蕊是保守的 (Ma 2000)；浆片被认为是双子叶植物花瓣的同源器官也已得到许多实验结果的证实（ et 000； et 1998）。然而外 颖和内颖与双子叶植物和其他单子叶植物的花器官之间是怎样的关系，目前仍不清楚。最简单的解释是：外颖和内颖都是与双子叶植物花萼一致的器官。然而外颖和内颖在形态上存在差异，而且排列上也不同 (即不是在同一轮中形成的 )。在水稻中，还没有表明外颖和内颖不是同一器官的报道。因而，水稻中外颖或内颖突变体的发现及其深入的研究对了解单子叶植物花器官外轮形态结构建成机制 具 是非常有意义的。近年来，花器官的发育受到人们的广泛关注并成为现代分子生物学研究的焦点之一。这不仅是因为花在植物的生长发育中处于中心位置，而且花器官的发育过程为研 究基因表达调控与器官的形态发生之间的关系提供了一个非常独特的系统。通过对花发育遗传机制的理解，中国农业科学院博士学位论文 第一章 绪论 3 我们就能通过基因工程的手段改变花分生组织和花的发育，控制作物的开花时间。 我们在水稻中发现了两个花器官突变体，一个表现为内颖发育不完全，并且造成小穗和谷粒形状的不正常，命名为凹陷内颖（ ， 另一个表现为除内颖和外颖外多出一个颖壳，有的还出现多重颖壳，命名为多颖（ ， 这二者都是水稻颖壳突变体，对它们进行研究，对了解水稻花器官发育的分子调控机制， 外颖和内颖之间以及二者与双子叶植物花器官之间的对应关系， 完善水稻花器官发育模型， 拓宽人们对单子叶植物花器官外轮形态结构建成机制 具有十分重要的理论意义 。 导师钱前研究员长期从事水稻经典遗传、分子遗传和育种研究。 他所领导的创新小组在水稻优异种质资源的发掘、创新和利用、遗传学研究群体的构建和基因定位、生物技术的实用化和产业化等领域开展研究，许多研究已处于国内外同类或相关研究的前列 。在 刊物上 发表了多篇文章，积累了宝贵的经验和方法。作者在此基础上，广泛查阅国内外的相关文献资料，结合实际情况，研究了 凹陷内颖和多颖水稻花器官突变体的形态解剖结构、突变性状的遗传分析及突变相关基因的分子标记精细定位，为突变相关基因的克隆和进一步的基因功能研究奠定基础。对这 2个水稻花发育 突变体材料的研究将有助于我们深入了解水稻花器官发育的分子机理。但限于博士学位论文有限的研究时间、作者有限的知识积累，本文对这 2 个水稻花发育 相 关突变体材料的研究只 是一个初步的工作，离导师的要求和期望相距甚远，并且有些问题在 博士论文期间还没有 得到很好地解决，尚需要今后从各方面进行进一步的深入研究。 等植物花序和花器官发育的分子生物学研究 花是植物中最复杂、最吸引人的器官。千百年来，人们一直寻求揭示植物开花潜在的奥秘。 20 世纪 80 年代以前，对开花的研究多限于形态及纯生理方面的研究。 20 世纪 80 年代后期，随着分子生物学和分子遗传学研究方法和技术的发展，借助于现代生物技术结合模式植物的开花突变体，开花遗传研究在短短的十几年内获得了突飞猛进的进展，成为发育生物学研究中最引人瞩目的热点。 花的发育是显花植物生殖生长期最明显的特征，植物开花是一个 高度受控的过程，近十多年来，利用模式植物拟南芥和金鱼草的花发育突变体，已经分离了大量的与花序和花器官形态有关的基因，伴随着这些基因的分离及分析，人们对以拟南芥为代表的植物开花的分子机制有了深入的了解，提出了一些试图系统解中国农业科学院博士学位论文 第一章 绪论 4 释有关基因控制的假说，已取得令人瞩目的进展。 花序形成的分子生物学 花序的形成，即茎端分生组织 (花分生组织的转变，由花分生组织特性基因 (制，这类基因在成花转变中 被激 活， 又控 制着下 游花 器官 特性 基因和 级联 基因 的表 达 (et 1998)。 是拟南芥中控制茎向花转变的一个主要基因，其强突变体基部花完全转变为叶芽，顶部花表现出部分花的特性 (1991)，即使在 因失活的情况下，最终还是会成花，表明还有其他基因促进花序向花的转变。 的功能与 分冗余，其表达时期晚于 者具有加性效应，能相互