番茄抗叶霉病基因Cf6的RAPD及SCAR标记.doc

7期 孟凡娟等：番茄抗叶霉病基因Cf6的RAPD及SCAR标记2197番茄抗叶霉病基因Cf6的RAPD及SCAR标记孟凡娟1，许向阳2，李景富2，黄凤兰3 （1东北林业大学生命科学学院，哈尔滨 150040；2东北农业大学园艺学院，哈尔滨 150030；3内蒙古民族大学农学院，内蒙古通辽 028300）摘要：【目的】寻找与番茄抗叶霉病基因Cf6连锁的分子标记。【方法】 以番茄抗叶霉病和感叶霉病亲本组合（0303603748）的F2分离群体为研究材料，采用BSA法和RAPD技术筛选与抗病基因连锁的分子标记。【结果】经F2单株分析，在后代群体中扩增出了两条长约500 bp的特异片段，该特异标记与叶霉病抗性基因Cf6紧密连锁，遗传距离为8.7 cm。测序结果显示，目标片段的大小分别为619 bp和559 bp，并将该标记转换为SCAR标记。【结论】SCAR标记，可用于番茄叶霉病抗性分子标记辅助育种。关键词：番茄叶霉病；Cf6基因；RAPD；SCARRAPD and SCAR Markers Linked to Fulvia fulva Resistant Gene Cf6 in TomatoMENG Fan-juan1, XU Xiang-yang2, LI Jing-fu2, HUANG Feng-lan3(1College of Life Sciences, Northeast Forestry University, Harbin 150040; 2College of Horticulture, Northeast Agricultural University, Harbin 150030; 3College of Agriculture, Inner Mongolia University for the Nationalites, Tongliao 028300, Inner Mongolia)Abstract: 【Objective】The study identified the molecular marker linked to Fulvia fulva resistant gene Cf6 in tomato. 【Method】 With a F2 population between a resistant and a susceptible parent (0303603748), the linked marker was screened by BSA method and RAPD technology. 【Result】 Two specific bands were found at the 500 bp region using F2-based bulked segregant analysis plants. An RAPD marker was tightly linked to Fulvia fulva resistant gene Cf6 in tomato, with a genetic distance of 8.7 cm, The RAPD marker was converted into SCAR marker. Sequencing of the fragment indicated that the length was 619 bp and 559 bp, respectively.【Conclusion】SCAR markers could be applied to identify the resistance to Fulvia fulva, and can be used in molecular marker-assisted breeding practice.Key words: Fulvia fulva; Cf6; RAPD; SCAR0 引言【研究意义】番茄叶霉病（Fulvia fulva Ciferri）是一种世界性病害，在荷兰、法国、加拿大、美国、日本、保加利亚、波兰、前苏联以及中国均有发生，给番茄生产带来了巨大损失1。防御番茄叶霉病最有效的方法是培育抗病品种。依靠常规方法耗时、耗力，同时由于人为鉴定标准的差异，会直接影响鉴定结果，延长育种周期。由于番茄叶霉病病菌生理小种分化速度较快，经过较长时间培育的抗病品种很可能在推广时已成为非抗病品种，所以要求育种工作者缩短育种周期。分子标记技术的发展为解决以上问题提供了可能。分子标记可被用于在苗期进行大量的抗病鉴定，不受时间、地域的限制，从而加速育种工作进程。分子标记辅助育种对于提高抗番茄叶霉病新品种选育效率具有重要实际应用价值。【前人研究进展】目前在利用各种分子标记技术寻找与番茄抗病基因连锁的分子标记研究方面已有很多报道。已经筛选到了与番茄根结线虫病2,3、番茄白粉病4,5、番茄斑萎病6,7、番茄烟草花叶病毒病8,9、番茄叶霉病10,11、番茄晚疫 病12、番茄褐根腐病13、番茄茎根腐病14、斑诊病15、黄萎病16、黄化卷叶病毒17等抗病基因连锁的分子标记。【本研究切入点】与番茄抗叶霉病基因Cf6连锁的的分子标记研究尚未见报道。【拟解决的关键问题】本研究拟利用番茄抗叶霉病和感叶霉病亲本组合构成的F2代，筛选出与该抗病基因连锁的分子标记，并将其转化为SCAR标记，提供番茄叶霉病抗性鉴定的分子手段，用于分子标记辅助育种，为该基因的最后克隆奠定基础。1 材料与方法1.1 试验材料1.1.1 植物材料 采用抗病材料03036（LA2448，ontario7818）和感病材料03748（不含任何番茄叶霉病抗病基因），以及二者杂交获得的F1代、利用03036以及03748为父本与F1回交获得BC1和BC2两个回交世代和F2代（F1代自交获得）作为试验材料。1.1.2 病原材料 采用番茄叶霉病病菌主流生理小种1.2.3.4，由东北农业大学番茄课题组提供。1.2 试验方法1.2.1 接种鉴定及抗、感池建立 在4片真叶期喷雾接种，孢子浓度为107ml-1，接种前、后均保湿24 h，温度2225，湿度90%以上，15 d后调查发病情况。将发病情况分为抗病和感病两种18，具体方法参照李树德的方法19如下：0级：无症状；1级：接种叶出现褪绿至黄色病斑；3级：接种叶病斑上产生一薄层稀疏的霉层；5级：接种叶病斑上产生明显的霉层；7级：接种叶病斑上产生浓密的霉层，而且上部叶也受到侵染（仅指整株幼苗接种）；9级：除接种叶病斑上生有浓密的霉层外，上部叶的霉层也很明显（指整株幼苗接种）或病叶开始发黄。其中发病级别为0级、1级、3级为抗病株，5级、7级、9级为感病株。分别从抗病、感病植株中各选取10株，利用Michelmore 和 Paran提出的BSA法建立抗病池和感病池20。为了增强试验的准确性，尽可能减少人为因素造成的误差，在试验中设置了感叶霉病品种作为对照，进行观察鉴定。1.2.2 叶片DNA提取 DNA的提取采用王关林等21提出的方法，稍加改动。1.2.3 RAPD体系 利用210条随机引物对建立的抗病池和感病池进行扩增。采用20 l的反应体系：2 l反应缓冲液；0.2 mmolL-1 dNTPs；1.5 mmolL-1 MgCl2 ；1 U Tag DNA聚合酶（宝泰克公司）；0.15 molL-1引物（210条，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成）；20 ng DNA模板。反应程序：94，5 min；94，1 min；36，1 min；72，5 min；35个循环后于72延伸10 min；4，保存。反应在梯度PCR仪9700上进行。扩增产物在1.4%琼脂糖凝胶、120 V电压、1TAE缓冲液中电泳，经EB染色后在紫外灯下观察结果并照相。1.2.4 RAPD特异片段的克隆、测序和SCAR引物的设计、扩增 利用上海生工 UNIQ-5柱离心式 DNA胶回收试剂盒回收特异片段，纯化后用pGEM-T-Easy载体连接，测序由上海生工完成。根据测序结果，利用Primer 5.0软件设计SCAR特异引物。反应条件为：在20 l反应体系中使用20 ng模板DNA，1.5 mmolL-1Mg2+，0.25 mmolL-1dNTPs，1 molL-1随机引物，1.0 U TaqDNA聚合酶。反应程序为：94 2 min；94 30 s；62 2 min；721 min；终延伸72 4 min，共35个循环。扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶电泳检测结果。同时利用所合成的SCAR引物对亲本及F2分离群体进行扩增验证。1.2.5 数据分析 利用抗、感池寻找多态条带，再用所有的F2分离后代单株，验证该多态性条带与目标基因连锁程度。利用MAPMAKER3.0软件，并用Kosambi函数将重组率转换成图距单位厘摩（cM）。2 结果与分析2.1 抗性鉴定进行抗病鉴定的F1代均表现为抗病；184株F2代群体中，其中145株表现抗病，39株表现感病，F2群体抗病与感病株数的分离比为：3.721.00，进行卡方检测实得c2=1.4520.05,2= 3.84，符合31的分离比例，回交的分离比率分别为1.131.00和1.251.00，进行卡方检测结果c2=0.0920.05,1=3.84和c2=0.2820.05,1=3.84，符合11的分离比例（表1）。从以上的分析结果表明：Cf6基因对番茄叶霉病菌1.2.3.4生理小种的抗性表现为单基因控制的显性性状。20.05,1=3.84；P0.052.2 与Cf6连锁的RAPD分子标记用210条随机引物对抗性亲本、感性亲本、抗病池、感病池进行扩增筛选，其中3个RAPD引物在亲表1 不同世代对番茄叶霉病菌1.2.3.4号生理小种的抗性表现Table 1 Resistance to race 1.2.3.4 of Fulvia fulva in different progenies世代Generation 株数 No. of plants实际比例Reality ratio理论比例Theoretical ratio2抗病株数 Resistant plant感病株数Susceptible plant03748 (P1)10 003036 (P2) 0 10F1 (2003年夏) F1 (Summer, 2003)10 0F2 (2003年冬) F2 (Winter, 2003)145 393.721.003.001.001.45BC1 (2003年冬) BC1 (Winter, 2003)26231.131.001.001.000.09BC2 (2003年冬) BC2 (Winter, 2003)25 201.251.001.001.000.28本和抗、感基因池之间扩增表现稳定、可重复。将以上3个引物对184个F2代单株进行RAPD扩增，并进行连锁分析，结果发现，引物S374的多态性产物与Cf6抗性基因具有连锁关系。从图1中可以看出：利用引物S374进行扩增，抗病亲本03036和感病亲本03748分别具有两种特异条带，分别命名为S374-1和S374-2，扩增长度为500 bp左右，抗病池同时具有2条特异带，感病池具有1条特异带，所以此标记表现为共显性。其中F1代同时具有这两种带型，F2代具有3种带型，分别为抗病亲本纯合带型（S374-1）、抗病亲本杂合带型（S374-1和S374-2）、感病亲本纯合带型（S374-2）（图2）。统计表明：在145个抗病植株上，137株为有效扩增，8株为无有效扩增；在39株感病植株中，33株无带、6株表现有带，即有14株发生重组（表2）。采用Mapmarker 3. 0软件对所得RAPD标记和Cf6抗性基因之间的遗传关系进行连锁分析，结果表明，该标记与Cf6抗性基因存在连锁关系，其连锁距离为8.7 cM。2.3 共显性RAPD标记的分子特征及SCAR标记的转化对S374-1和S374-2两片段进行序列测定，大小分别为619和559 bp（图3），上部带阴影部分的为M：DNA标准；1、2、3、4分别为抗亲、感亲、抗池和感池M: DNA marker; 1, 2, 3, 4 are resistant parent, susceptible parent, resistant bulk and susceptible bulk图1 S374在抗亲、感亲、抗池、感池间的扩增结果Fig. 1 Amplification results using primer S374 in resistant and susceptible parent, resistant and susceptible bulkM：DNA标准DL2000；1：抗病亲本；2：感病亲本；3：F1个体；49：纯合抗病F2单株；1017：杂合抗病F2单株；1824：纯合感病F2单株M: DNA Marker; 1: Susceptible parent; 2: Resistant parent; 3: F1 individuals; 4-9: F2 resistant homozygous individuals; 10-17: F2 resistant heterozygous individuals; 18-24: F2 susceptible homozygous individuals图2 S374在部分F2单株中的扩增结果Fig. 2 Amplification results using primer S374 in F2 plants1 CCCGCTACACCTTAAACTTGAGTGCAATGAATCATTGCCTCCTTGGAGCTTCACTTGAAC |1 CCCGCTACACCTTAAACTTGAGTG?TTGAATCATTGCCTCCTTGGAGCTTCACTTGAAC引物1 Primer 1 5-CCCGCTACACCTTAAACTT-361 CATTCGGTTGAACTTTCTCCTTCCCTTTAACTCGAGCTCTCATATACAGACAATCCTTCA | | | |61 CATTCGGTTGAACTT?TTCCCTTTAACTCGAGACCTCAAATACAGACAATCCTTCA121 TCATGTGACC?CGTTCTCTACAACTGTAAATTGCGTTAGAGCCCCTCCTA?CTATCCTC | | |121 TCATGTGACCTCGTTCTCTACAACTGTAACAAGCGTTAGAGCCCCTCCTACACTATCCTC181 CATGAAGTT?TCACACTTCCTACAAGGTGGCCTCTCCCGAGGTTTATCAACTTTACTGT | | |181 CATGAAGTTTGTCACACTTCCTACAAGG?CCTCTCCCGAGGTTTATCTACTTTACTGT241 TTCTCTTAAAATCTGGGCTCAGAATTCCATTGTGTGGATTTGACTATAGACATGATTCAA | | | |241 TTCTCTTAA?A?CTGGGCTCAGAA?CCATTGTGTGGATTTGACATTAGACATGATTCAA301 CAACTTTGTCTGGATCAGAAAGTAATACCAAATTTTAATTAAGTTCTAACATCCTTGGAT | |301 CAACTTTGTCTGGATCAGAAAGTAATACCAAA?AATTAAGTTCTAACATCCTTGGAT361 GAGACTGTTATTGATCATGTGATGTTTAAATGCATAAAGAGAGAGTCATAGTTCGAAATT | |361 GAGACTGTTATTGATCATGTGATGTTTAAATGCATAAAGAGAGAGTCATAG?AAATT34个碱基的插入或缺失 Insertion or deletion of 34 bases421 GTTTGAGGCTATATTGCATTTGCTAGGATGACTTTGATACTGGTGATGGTTTGATAGTAA |421 GTTTGAGGCTATATTG TTGATAGTAA481 GATAATTGGATGGTGTGGACTTGATGTCTGTTGATATTAGGAGCGTCGACTTCCATGGAG | |481 GATAATTGGATGGTGTGG?TGATGTCTGTTGATATTAGGAGC?TCGACTTCCATGGAG541 TACTGTGAGAAGCATGTTGAGGGTTTGATAACGTAGTGTATGTGTGTAATGAGGATCCGT | | |541 TACTGTGAGAAGCATGT?AGGGTTTGATAACGTAG?GTATGTGTGTAATGA?TCAGT601 GCTTGGGAGATTGTGTGTAGCGGG|601 GCTTGGGAGATTGTGTGTAGCGGG引物2 Primer 2 5- GCTTGGGAGATTGTGTGTAGC-3图3 S374-1和S374的序列比较Fig. 3 Comparison of S374-1 and S374-2 sequences表2 RAPD标记与抗病基因的遗传距离Table 2 Identification of genetic distance between RAPD markers and resistance geneCf6F2植株数 F2 individuals obtained重组株数 No. of recombinant individuals重组率 Recombination frequency (%)遗传距离 Genetic distance (cM)S374+137147.6098.7 -8+33-6“+”：代表有；“-”：代表无 “+”: Yes; “-”: No片段S374-1序列，未带阴影部分的为片段S374-2序列。结果表明，两个片段两端10个碱基的序列与引物S374序列（5-CCCGCTACAC-3）完全相同。两个序列之间存在34个碱基（CATTTGCTAGGATGACTT TGATACTGGTG-ATGGT）的插入（或缺失）的区域，同时还存在个别碱基的替换或缺失。根据测序结果以及引物设计原则，进行SCAR引物的设计，引物1（5-CCCGCTACACCTTAAACTT-3）包括一段S374引物序列，而引物2（5-GCTTGGGAG ATTGTGTGTAGC-3）只包括一段RAPD引物序列。此对引物在抗病亲本、感病亲本F1和F2代个体中的扩增结果与S374有类似的共显性特点。将这个标记命名为SCAR374，它由SCAR374-1和SCAR374-2两个特征带组成。在感病亲本和感病的F2代单株中可检测到SCAR374-2的特征带，而在F1和抗病的F2代杂合单株中则可同时检测到SCAR374-1和SCAR374-2两个特征带（图4）。M：DNA标准DL2 000；1：抗病亲本；2：感病亲本；3：F1；412：感病单株；1323，抗病单株M: DNA ladder; 1: Resistant parent; 2: Susceptible parent; 3: F1; 4-12: Susceptible plants; 13-23: Resistant plants图4 SCAR引物对亲本及部分F2单株的扩增结果Fig. 4 Results of SCAR amplification of parents and some F2 plants3 讨论在对F2代群体进行抗病分析及PCR扩增的对比时发现：绝大多数植株的抗病性和S374-1表现出共分离。但有些RAPD标记为感病亲本带型（S374-2）的植株却表现为抗病，标记为S374-1带型却表现感病。这是因为RAPD标记是在分子水平上对基因型进行分析，所得到的结果不受接种条件和发病程度的限制，因此，F2代群体中表现抗病的单株而RAPD标记为感病亲本带型的原因，除去基因之间可能产生的交换重组外，还应考虑到接种发病情况和抗病调查标准等人为因素的影响，这可能是导致分子检测结果与田间鉴定出现符合程度下降的主要原因。例如：在对F3代鉴定为抗病的32份植株进行分子检测时发现，有4株出现感病带型，符合率为87.5%。RAPD的标记通常是显性的，然而如果在某些区域发生插入或缺失，就可能检测到共显性的RAPD标记。这种具有相同的引物位点，大小却不同的RAPD条带，除在扩增区域的插入和缺失部分不同以外，大部分序列非常相似。此类共显性标记不但象RFLP那样可区分杂合带型和纯和带型，而且所需DNA量较少，检测程序简单快速，在遗传作图和标记辅助选择上表现得更为有用 17。在本研究中，由于S374引物扩增区域内碱基的插入或缺失而形成了共显性的标记，而此类标记由于可以区分后代的杂合型及纯合型，所以在番茄抗叶霉病育种工作中显得更为有用。4 结论本试验分析了03748（感病品种）03036（抗病品种）的杂交后代对番茄叶霉病菌1.2.3.4生理小种的抗病反应。经鉴定表明：F2群体抗病与感病株数的分离比为：3.721.00，符合31的分离比例，回交的分离比率分别为1.131.00和1.251.00；卡方检测结果分别为c2=0.10520.05,1=3.841和c2=0.20820.05,1=3.841，符合11的分离比例。所以，Cf6基因对番茄叶霉病菌1.2.3.4生理小种的抗性表现为单基因控制的显性性状。运用群体分组分析法（BSA）筛选到1个与番茄叶霉病抗病基因Cf6连锁的共显性标记，该标记与Cf6抗性基因存在连锁关系，其连锁距离为8.7 cM。并在序列分析的基础上，将RAPD标记转化成稳定的SCAR标记。 References1韩文华, 许文奎, 刘石磊, 刘永丽. 番茄叶霉病生理小种分化及抗病育种研究进展. 辽宁农业科学, 2005, (5): 35-37.Han W H, Xu W K, Liu S L, Liu Y L. 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