【毕业学位论文】（Word原稿）日本血吸虫膜蛋白SjTSP2研究预防兽医学硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 硕士 学位论文 日本血吸虫膜蛋白 究 on on I 摘 要 日本血吸虫病是我国一种危害严重的人畜共患寄生虫病。 由于中间宿主钉螺难以消灭，治疗药物吡喹酮不能解决重复感染难题，而且有可能诱导产生抗药性，因此有必要研制高效、安全的抗血吸虫病疫苗和新治疗药物。东方田鼠 （ 是迄今为止在日本血吸虫病疫区发现的唯一一种感染血吸虫后不致病的哺乳动物，具有天然完全抗日本血吸虫病特性。作者 曾 利用重复攻击感染日本血吸虫尾蚴的 东方田鼠血清免疫筛选日本血吸虫成虫 达文库获得 一个与曼氏血吸虫四跨膜蛋白 因同源性较高的 列 。 小鼠曼氏血吸虫病模型中诱导了较高的保护效果。本文开展了日本血吸虫四跨膜蛋白 1 利用 获得的 列和 功扩增获得 日本血吸虫 该基因 776 个碱基对 ，编码 215 个氨基酸。 生物信息学分析表明， 基酸序列 的 N 端 含有 信号肽，并有 4 个 跨膜区和 2 个膜外区，符合四跨膜蛋白家族的主要特征。该蛋白第二个膜外区（ 具有 多个功能位点，与 源，并有 4 个保守的半胱氨酸。抗原性分析表明 白 有较强的抗原性。在此基础上，成功构建了含 过优化实验条件在 成功表达未降解可溶的融合蛋白 子量分别为 156 2以看家基因 用荧光定量 因在日本血吸虫7d、 1432果显示相对于每百万个 本血吸虫 7d、 14d 和 23d 童虫及 32d 成虫的转录数分别为 18776、 22999、 18784、 6195 个拷贝，表明日本血吸虫 成虫中表达较低。应用免疫荧光技术进行组织定位分析，结果表明在血吸虫 10 童虫和 44 天成虫的体 表均可见强烈的荧光信号，在虫体内部和消化道肠管中均未见明显的荧光信号。结果表明 3大量表达纯化 组蛋白，并免疫昆明系小鼠进行了二批免疫保护试验。结果 与 空白 对照组相比，重组蛋白 分别 减虫率， 肝组织减卵率 。 重组蛋白 导的减虫率为 差异不显著，但该蛋白诱导了较高的 肝组织减卵率 ， 达 差异极显著。用 重组蛋白 组蛋白 导的免疫保护效果比单个重组蛋白均有较大提高，取得了 减虫率和 肝组织减卵率 ，和空白对照组比差异均极显著。应用 体水平变化，结果 组蛋白免疫组小鼠在 3 次免疫后均产生了高水平的特异性测 本 论文首次克隆了日本血吸虫四跨膜蛋白 通过生物信息学分析，详细预测了该蛋白的结构和功能。通过优化实验条件成功表达了未降解的可溶的 组蛋白。分析了因在日本血吸虫不同发育时间的表达和观察了 白的组织定位。初步研究了文较系统地开展了日本血吸虫四跨膜蛋白 筛选血吸虫病疫苗新候选抗原分子具有重要意义。 关键词： 日本血吸虫，四跨膜蛋白，克隆表达，组织 定位， 免疫 保护 by is in on it is to t of of to on it is to an is to in . to in ST to of , of as a in of . on in (D a on of RF 76 14 as a of by a in to . . IS ST 5KD 6KD by to in CR d, 14d, 23d 2d 8776, 22999, 18784 195 to of of by a IS in of no at of as In IS 06 of CA ST as in in ST by is of of gG by an on In as a to be an 录 摘要 . 错误 !未定义书签。 英文缩略表 . 一章 绪 论 . 1 本血吸虫病候选疫苗分子研究进展 . 1 畜在血吸虫病流行中的角色 . 2 吸虫疫苗研究 . 2 要日本血吸虫病疫苗候选抗原研究进展 . 3 望 . 7 方田鼠抗日本血吸虫病研究进展 . 9 方田鼠抗日本血吸虫病特性 . 10 方田鼠抗日本血吸虫病机制研究 . 10 用东方田鼠血清免疫筛选抗血吸虫病的可能靶抗原基因 . 11 望 . 12 第二章 日本血吸虫 因的克隆、表达 . 13 料 . 14 验动物 . 14 本血吸虫（中国大陆株）成虫 . 14 种、质粒及主要试剂 . 14 物 . 14 要仪器设备 . 15 法 . 15 因克隆 . 15 因生物信息分析 . 20 因原核表达质粒的构建 . 20 因表达及纯化条件的优化 . 23 果 . 25 因的克隆 . 25 因编码蛋白分析 . 29 组原核表达质粒 . 30 因在大肠杆菌中表达和纯化条件的优化 . 30 达产物抗原性的鉴定 . 30 论 . 36 第三章 日本血吸虫 因表达时相和组织定位 . 39 料和方法 . 39 验材料 . 39 V 本血吸虫（中国大陆株）童虫和成虫 . 40 验方法 . 40 果 . 44 因在虫体不同发育时间的表达分析 . 44 因在虫体表达定位观察 . 44 论 . 45 第四章 组融合蛋白的免疫保护效果评估和机制研究 . 48 料与方法 . 48 验材料 . 48 疫抗原制备 . 49 鼠免疫保护试验 . 49 据处理 . 50 果 . 50 疫保护效果 . 50 鼠血清抗 异性抗体 测 . 51 论 . 51 第 5 章 全文结论 . 63 参考文献 . 64 致 谢 . 70 作者简历 . 71 文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 l 升 m r 微米 苄青霉素 本的碱基配对搜索软件 bp 基对 血清白蛋白 补 d 氨基联苯胺 碳酸二乙酯 甲基亚砜 氧核糖核酸 硫苏糖醇 EB 化乙锭 二胺四乙酸 联免疫吸附测定 达序列标签 s 氏完全佐剂 s 氏不完全佐剂 酸 氨酸标签 根过氧（化）物酶 等电点 免疫球蛋白 G 丙基硫代半乳糖苷 那霉素 B 培养基 mg 克 钟 升 使 国农业科学院博士学位论文 第一章 绪论 酸钠 美生物技术信息中心 OD 密度值 放阅读框架 丙稀酰胺凝胶电泳 酸盐缓冲溶液 合酶链反应 000 聚乙二醇 8000 糖核酸 每分钟转速 转录 s 二烷基硫酸钠 二烷基硫酸钠 NA 热水生菌 合酶 , N, N,N, N, N,N,3,5,5,3,5,5（羟甲基）胺基甲烷 维网 43中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪论 1 第一章 绪 论 本血吸虫病候选疫苗分子研究进展 血吸虫病（ 由血吸虫尾蚴感染人和其它哺乳动物导致的 人畜共患寄生虫病 ， 分布广泛、危害严重。据世界卫生组织 2001 年 统计，目前全球仍有 74 个 发展中 国家和地区流行血吸虫病，有 6亿人受到威胁， 2亿人感染血吸虫病 ，约 80%的感染者居住在非洲的南撒哈拉地区，其中有症状的约 严重感染者达 2000万（ 001）。 2002年全世界由于血吸虫病死亡的病人约 15000人，疾病负担约： 176万伤残调整生命年 ( 002）。血吸虫病是 血吸虫又称裂体吸虫 ，隶属于 扁形动物门 （ ，吸虫纲 （ ，复殖目 （ ，裂体科 （ 裂体 亚 科（ 裂体 属（ 感染人的 主要病原 有 6种：埃及血吸虫（ 1852）、曼氏血吸虫（ 1907）、日本血吸虫（ 1904） 、 间插血吸虫（ 1934） 、 湄公血吸虫（ 978） 和马来血吸虫（ 988）（赵尉先，1983） 。 我国流行的是日本血吸虫中国大陆株。 日本血吸虫病（ 一种 在我国南方流行的 严重危害人、畜健康、影响社会和经济发展的人畜共患 寄生虫 病。 2005年全国共有血吸虫病病人约 80万例 ,当年发生急性感染 564例。全国各流行区共有存栏耕牛 176万头 ,年内共检查耕牛 91万多头 , 查出病牛 头 ,阳性率为 表明耕牛传染源依然较多（郝阳等， 2006）。全国现有钉螺面积 中新增钉螺面积 均在历史无螺区内发现 ,钉螺 扩散明显。患病人数居高不下 ,传染源种类多 ,散养家畜数量大 ,人、畜粪便对环境的污染还比较严重 ,钉螺面积继续扩大 ,一些已经达到传播控制和传播阻断标准的县 (市、区 )疫情出现回升态势。 目前我国血吸虫病防治的主要难点是： 中间宿主钉螺 （ 难以消灭 。 人畜 重复感染严重 。 保藏宿主种类多， 数量 大 ，活动范围广，难以控制， 牛等大家畜的粪便 是最重要的传染源。 新的社会、经济和气候因素使我国血吸虫病的防制 又面临新的问题，如： 三峡大坝和南水北调工程的建设、“退田还湖、平垸行洪、移民建镇”治水 方针的实施和全球气候变暖等 （ 张世清 等 ,2000； 汪天平等， 2005； N 2002） 。这表明，我国人畜日本血吸虫病防治工作是一项长期、艰巨、复杂的任务。 我国血吸虫病防治的严峻形势得到党中央、国务院的高度重视，胡锦涛总书记对血防工作做出重要批示：“做好血吸虫病防治工作关系到人民的身体健康和生命安全，关系到经济发中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪论 2 展和社会稳定”，要“确保各项防治措施的落实，确保有效控制血吸虫病流行目标的实现”。国务院专门召开全国血防工作会议，提出了防治规划，明确了目标和措施。但血防任务相当艰巨，防治实践表明 ，由于中间宿主钉螺难以消灭，治疗药物不能解决重复感染难题，要在中国控制和最终消灭血吸虫病，亟待加强科学研究 ,开拓疫苗等防治新途径。 畜在血吸虫病流行中的角色 流行区中的耕牛等家畜是疫区血吸虫病的主要传染源。 戴卓建 等 对四川山区动物血吸虫病流行病学调查、分析 的结果 表明 3 8岁的牛 较高 ，牛的 别是 戴卓建 等 ,1992） 。牧区的马、羊、猪在血吸虫病流行病学上 占有重要地位。以牛粪为主的野粪是此病流行的重要传播因素 ， 病牛是此病流行的主要传染源 。 张绍基 等对 鄱阳湖区血吸虫病易感地带野粪污染指数和感染螺季节性变化 的 调查 表 明了家畜在传播血吸虫病中的重要地位 （ 张绍基 等， 1993） 。石耀军 等也 通过对湖南、江西等省家畜血吸虫病流行病学调查资料查实 ,在我国当前血吸虫病流行最严重的江湖洲滩地区 ,散布在有螺草洲的野粪 95%以上是家畜粪便 ,阳性野粪全部是畜粪 ,导致家畜血吸虫病感染率居高不下 ， 患病家畜是血吸虫病传播的源头 （ 石耀军 等， 2004）。 专家估计，在湖区， 80% 90% 的 血 吸 虫 感 染 是 由 于 牛 粪 中 的 虫 卵 所 造 成（ ）。 2005 年在中国个省血吸虫病流行区共有存栏耕牛 176 万头，年内共检查耕牛 91 万多头，查出病牛 头 , 阳性率为 虽然感染率较 2004 年有所下降 , 但耕牛传染源依然较多。散养家畜数量大，家畜粪便对环境的污染还比较严重（郝阳等， 2006）。散放的家畜缺乏有效的管理和治疗，反复感染，反复污染环境。由此可见，研究发展耕牛等家畜用日本血吸虫病传播阻断疫苗，必将极大地促进我国血吸虫病防治工作。考虑到生物伦理、生物安全，人的疫苗 研制 道路比较漫长，研制动物特别是牛的血吸虫病疫苗是可行的，也更快捷。加强血吸虫病疫苗研究，首先在家畜用疫苗上取得突破，对保护家畜的健康，提高家畜的使役能力，促进畜牧业和农业的发展，保障人类健康都有重要的意义。 吸虫疫苗研究 血吸虫病疫苗研究已成为我国血吸虫病防治研究的重要发展战略，世界卫生组织等也将血吸虫病疫 苗研究置于血吸虫病防治研究的优先地位。 早期的血吸虫病疫苗研究主要致力于射线致弱的血吸虫尾蚴或童虫苗、不同生活史阶段虫体裂解物及纯化虫体抗原苗等的探索。其中 以 60 80%减虫率，说明血吸虫病疫苗研制是可行、有发展前景的。但由于批量虫体的获取、疫苗的保存、运输及安全性等问题，这一类疫苗难以在现场大规模推广应用。进入八十年代初期，国外开始以曼氏血吸虫、日本血吸虫菲律宾株为研究对象，探索血吸虫基因工程疫苗。迄今，已有上百个编码血吸虫抗原的基因被克隆和鉴定，其中 一些基因已被表达，应用部份基因重组抗原免疫动物，诱导了 20 40%的 减虫率。 1995 年世界卫生组中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪论 3 织总结了抗曼氏血吸虫基因工程疫苗的研究成果，推荐 胱甘肽 、肌球蛋白 )、 3蛋白 )、 、 球蛋白多肽片段 )、 肪酸结合蛋白 )六种重组抗原可作为候选疫苗抗原作进一步研究和发展 （ R,1998） 。近几年国外还构建了血吸虫不同发育阶段虫体的 库，通过 达序列标签）技术、差异显示和扣除杂交技术等鉴定、分离与不同发育阶段虫体生长、发育相关的基因，期望获得能阻断血吸虫生长、发育、性成熟、产卵的高效疫苗 （林矫矫等， 1998） 。 1995 年世界卫生组织启动了血吸虫基因组计划，最终目标在于构建血吸虫基因物理图谱，鉴定新候选疫苗和新治疗药物的靶目标。国内于上世纪九十年代 启动 抗日本血吸虫病 基因工程 疫苗研究，最初几年主要是追踪世界卫生组织推荐的六种侯选疫苗抗原等其它重要抗原的研究成果，针对在我国流行的日本血吸虫（中国大陆 株） ,克隆、鉴定、表达相关的抗原基因，并评估这些基因及基因产物的生物学功能；随后，在国家 “863” 计划和总理专项基金等项目的引导支持下，我国该项研究发展迅速，先后构建了不同生活史阶段的虫体 隆了 30多个日本血吸虫中国大陆株抗原基因， 10多种血吸虫基因重组抗原候选疫苗或 苗 ， 开展 了 实验动物免疫保护试验，还以牛、羊等大家畜为试验模型，评价 几种重要候选疫苗的免疫保护效果，获得了 40%左右的减虫率或减卵率。 要日本血吸虫病疫苗候选抗原研究进展 1谷胱甘 肽 谷胱甘肽 20 多年前， 授（ M 987）等首次应用 29/6胱甘肽 抗体水平比 c、 和 小鼠高。国内外的一些实验室也均分别纯化了天然的日本血吸虫 白分子，并在动物试验中诱导了相当的保护效果。 (X 993)应用亲和层析和免疫 化学分析免疫化学分析证明日本血吸虫 (大陆株 )有 2种 即 268对两者抗原性及免疫原性进行研究 ,认为 26疫原性较强。 ( 995)用日本血吸虫天然 或 3次，在攻击感染后第 10周解剖动物分别获得了 粪便减卵率和 减虫率。 M 987)等首先在大肠杆菌中表达了重组曼氏血吸虫病 28子，并在大鼠、仓鼠和猴子中呈现强烈的细胞毒性抗体反应和显著的免疫保护作用。从此揭开了血吸虫重组蛋白疫苗研究的新篇章。 X 995)和 田锷 (田锷 等， 1996)等先后在大肠杆菌系统中表达了日本血吸虫 26 28X 995）用纯化的重组 原 (中国大陆株 )能够诱导显著的减卵率 (肝脏 :肠 :。同时肝脏肉芽肿明显减小。证明以重组 疫小鼠 ,不仅对攻击感染有减虫作用 ,而且肝、 肠组织内虫卵数明显减少 ,表明对血吸虫具有抗感染和抗生殖免疫作用。继而以铝佐剂免疫猪 ,攻击感染后 ,发现减卵率达 54%(认为补体参与杀伤童虫的可能性不大。 多种免疫效应细胞参与了东方田鼠抗血吸虫的免疫反应。 刘金明等 （ 刘金明等 ,2001）在体外杀伤试验 中 发现东方田鼠巨噬细胞和嗜酸性粒细胞可大量粘附于童虫体表，但似乎与童虫死亡率的关系不大。在体外 验中，张新跃等 （ 张新跃等 ,2001） 发现东方田鼠脾细胞对血吸虫童虫的杀伤效果明显，校正死亡率达 （野生鼠）和 繁殖鼠），并且与血清对童虫的杀伤作用具有协同效应。 东方田鼠天然血清中的含量显著高于昆明鼠天然血清，是后者的 。日本血吸虫尾蚴攻击感染后 9 天，东方田鼠血清中 升了 K 等， 1999） ，这与东方田鼠体内童虫发育停滞开始的时间（约 11 天）接近。 用东方田鼠血清免疫筛选抗血吸虫病的可能靶 抗原 基因 东方田鼠具有天然抗日本血