【毕业学位论文】（Word原稿）饲料中二恶英测定的化学激活荧光基因表达系统动物营养与饲料科学硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 饲料中二恶英测定的 化学激活荧光基因表达系统 n 1 I 摘 要 二恶英类化学物质在环境中广泛存在，不易降解，毒性高且易于生物富集 /生物放大，能对环境、人和动物造成严重影响。 1999 年比利时肉鸡二恶英污染事件后， 起国际社会的广泛关注。 二 恶英分析是现代分析的一个重点和难点。目前二恶英类物质主要的检测方法有化学法（色谱法）、免疫法和生物法三大类。色谱法是目前国际通用的标准方法。但到目前为止，还没有一种能高通量、低成本进行二恶英检测的方法。 本研究的目的是利用二恶英类化学物质的毒理机制，建立一种能满足饲料及畜产品中二恶英监测的高通量、低成本需要的方法。本研究构建了一个受二恶英应答元件（ 控的，以增强型绿色荧光蛋白（ 为报告基因的表达质粒，将该质粒转染大鼠肝细胞瘤 选稳定转染细胞株。二恶英类化学物质与该稳定转染细胞株 接触可诱导 剂量依赖性的表达，通过检测 量即可反映二恶英类化学物质的量。 本研究内容分两部分： 一将载体质粒 动子去除后，用 接酶分步连接上 动子和 段，构成以 报告基因的，对二恶英起特异性应答的表达质粒 组质粒瞬时转染大鼠肝细胞瘤 导绿色荧光蛋白表达，以 导作阴性对照，结果表明 导绿色荧光蛋白表达为 导的表达量高出约 10 倍左右，表明重组质粒构建成功。 二将重组质粒 定转染大鼠肝细胞瘤 过 4 周培养筛选，得到 1 株具有强诱导活性的重组细胞系 后对该细胞株的检测条件进行了优化。 将 胞每孔约 150， 000 个加入黑色壁、透明底 96 孔培养板（ 603）中， 37培养， 33与 测物）共孵育进行荧光检测。制定了 导 标准曲线，确定该方法的最低检测限为 1为 5大诱导剂量为 500性范围为 1 500 实验还对一些可能对二恶英检测产生干扰的 物质进行了研究。结果表明， 激素及 此在样品处理时应除去这些物质。 该分析方法和以荧光素酶基因为报告基因的细胞分析方法比较，不但具有相同的灵敏度和特异性，而且更简单、快速、便宜，还可以实时检测，从而可满足饲料及畜产品二恶英监测的高通量、低成本需要。 关键词 ：二恶英，增强型绿色荧光蛋白，报告基因， 环芳香烃受体，荧光检测 he to in in 999. C/is it in of is of of of to a be as of in We a 4 of in in a so of in be by be 1. RE RE MV by RE by 4of 0 4in nM 4h). of to to we in 967 3 to in a 1 500 to it is be so a in 录 第一章 引言 . 1 恶英的结构、理化特性及来源 . 1 二恶英的结构及理化特性 . 1 二恶英的来源及污染 . 3 恶英的毒性及毒性机制 . 4 二恶英的毒性 . 4 恶英毒性及浓度的表示单位 . 7 恶英毒性作用机制 . 8 恶英在食品 /饲料中污染 . 10 恶英食品 /饲料污染事件 . 10 料及食品中二恶英指导原则 . 10 恶英生物检测方法 . 11 述 . 11 告基因法 . 12 疫分析法 . 13 外 合实验 . 14 试验研究目的意义 . 15 究目的 . 15 究意义 . 15 第二章 含绿色荧光蛋白报告基因质粒构建 . 16 验设计 . 16 验材料与方法 . 18 验材料与试剂 . 18 验方法 . 19 果与讨论 . 24 动子的制备 . 24 动子和质粒载体大片断连接 . 25 V 段的制备 . 27 段重组质粒的制备 . 28 第三章 重组质粒稳定转染及检测方法学研究 . 30 验设计 . 30 验材料与方法 . 30 验材料与试剂 . 30 胞培养及细胞瞬时、稳定转染 . 31 果与讨论 . 33 时转染细胞株 导荧光表达 . 33 定转染细胞株 导荧光表达 . 34 定筛选细胞株用于 析的特性及分析条件优化 . 35 结 . 41 第四章 全文结论 . 44 研究结论 . 44 待进一步研究和解决的问题 . 44 参考文献 . 46 致谢 . 52 作者简历 . 53 文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 香烃羟化酶 香烃受体 hR 香烃受体核转 运蛋白 速溶剂萃取 学激活荧光基因表达 学激活荧光素酶基因表达 恶英应答元件 联免疫吸附试验 氧基 脱乙基酶 盟 as 相色谱 效 谱 环芳香烃 氯联苯 氯代二苯并 二恶英 氯代二苯并呋喃 久性有机污染物 ,3,7,8， 3， 7， 8对 性当量因子 性当量 国环境保护总署 界卫生组织 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 1 第一章 引言 二恶英（ 一类持久存在的环境污染物，毒性作用剂量极低且易于生物富集(1980)。二恶英是世界卫生组织（ 出的 12 类最严重持久性有机污染物（ 一 ,也是类致癌物，其对环境、动物和人 的危害是近二十年来世界各国普遍关心的问题。 有史以来，人类活动一直影响着自然环境和野生动物。工业革命前，人类活动产生的影响主要是地区性影响，但随着工业活动急剧发展，人类活动在全球范围导致严重环境问题。 of s in 出了一些工业发展带来的负面后果，如水和大气污染、酸雨、臭氧层减少以及全球变暖等。我们过度使用自然资 源，这将导致严重后果。伐树可毁坏森林，但在保护树木时使用杀虫剂也可能引起深远影响：不仅影响森林，而且影响整个世界，如上世纪 60 年代广泛使用的有机氯杀虫剂 1,1,1 但杀死人们想杀死的有害生物，而且也影响到许多其他生物，如一些食肉鸟类因为摄食了含 虫子，繁殖能力大受影响（ 1997）。 1958 年， 到一封抱怨野生动物生存权力被剥夺的信。她因此写出一本名叫寂静的春天 (的书，书中讲由于环境中人为物质的影响，将来不再有鸟类歌唱。寂静的春天对人们的态度产生了很大影响，并在现代环境保护论的诞生中扮演一个主要角色。如今，人类越来越关注环境，采取了许多环境策略，如控制某些杀虫剂的使用量，控制废气排放，为环境有害物质制定指导限量。联合国环境署（ 定了三个公约（巴塞尔、鹿特丹和斯德哥尔摩公约），为环境有害物质的有效管理提供了一个国际框架。 2001 年 5 月 23 日在瑞典斯德哥尔摩，包括中国在内的 91 国家投赞成票通过斯德哥尔摩公约，该公约旨在控制和治理以二恶英为代表的 12 种在环境中具有高残留性、高生物浓缩性和高生物毒性的物质，即持续性有机污染物（ 这 12 种化学物质中，二恶英类物质（二恶英、呋喃、多氯联苯）和 六六）是农药和多氯联苯生产中的伴生物，其他 8 种为人工合成的含氯农药和工业化合物，其生产都能产生二恶英，所以该公约的一大重点就是遏制和消除二恶英类物质。 尽管已经采取措施控制有害物 质排放，但 将在环境中长期存在。因此在保护环境及保障人和动物健康时，首先要具备有害物质的相关知识，如它们的产生、命运、毒理作用，以及在生态系统中的生物作用过程。在此对二恶英类物质的结构、理化性质、环境和食品 /饲料中的暴露水平、在各国的立法以及检测方法作一综述。 恶英的结构、理化特性及来源 二恶英的结构及理化特性 二恶英（ 一类具有相似化学结构、理化性质和生物学特性的多氯代三环中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 2 芳香族化合物的总称，包括多氯代二苯并 二恶英（ 多氯代二苯并呋喃（ 类（ 1984）。所有二恶英因为具有芳香环，都形成一个共平面结构。因其分子中氯原子有不同取代位置和数目，可生成 75种 135 种 恶英名称中的数字代表氢原子被氯原子取代的位置，中文数字（希腊字母代表氯原子个数）。毒性较高的二恶英物质侧位往往都被氯取代，即 2， 3， 7， 8 位。二恶英类似物包括 209 种共平面多氯联苯（ 以 及多溴代二苯并呋喃（ 多溴联苯（ 其混合卤代化合物。表 1出了 系物及异构体数目。二恶英及其类似物总称为二恶英类化学物质（ 从生物学效应上讲，即是那些能与芳香烃受体（ 合，并导致机体生物化学变化的一大类物质 (1996)。 2， 3， 7， 8对 2,3,7,82,3,7,8研究最多，也是最典型和毒性最强的二恶英物质（ 1982）。 二恶英以 2 个或 1 个氧键连结 2 个苯环构成三环化合物。 构式如图 1 图 1）和 构式 -1 表 1 同系物及异构体 系物（缩写） 异构体数量 M) 3 2 4 D) 12 10 16 24 14 28 T) 42 22 38 46 14 28 42 10 16 24 2 4 O) 12 1 1 3 1 总计 209 75 135 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 3 二恶英的分子量在 300 左右，物理性质相近，如果是纯物质，常温下应为固态晶体。二恶英具有相对稳定的芳香环，无色无味，亲脂性极强。低挥发性，蒸汽压极低，除了在气溶胶颗粒有吸收外，在大气中分布极少，而在地面可以持续存在。无极性，难溶于水，在强酸、强碱及氧化剂中仍能稳定存在，可溶于大部分有机溶剂。自然界中的微生物降解、水解及光解作用对其结构影响很小，在高温 下仍很稳定， 750以上才会分解，要大量破坏则需超过 1000（ 1993；1990）。二恶英在土壤中的半衰期为 12 年。气态中的二恶英在空气中光化学分解的半衰期为 恶英在体内稳定，半衰期达 。表 1列为 s 典型理化性质。 2， 3， 7， 8分子量为 色结晶，熔点 302 305， 500开始分解， 800时 21s 完全分解（罗少初， 2000）。 表 1s 典型理化性质 s 同系物蒸汽压 (25 ) 解度 (mg l1, 25 ) s 07 04 03 010 04 04 011 06 03 011 06 04 013 08 04 08 04 04 09 04 04 010 05 04 011 06 04 012 06 05 二恶英的来源及污染 环境二恶英污 染的来源有人类来源和自然来源两种。人类来源包括焚化、造纸工业、垃圾焚烧、农药、建筑物起火、汽车尾气排放、含 料的生产和使用、含氯及二恶英制品的回收利用等。自然来源有森林失火和火山爆发，以及森林土壤和沉积物形成过程等。二恶英的产生是一个非常普遍的化学过程，其形成机理非常复杂，目前尚不十分清楚（ 1986）。现在认识到各种医疗和城市垃圾的焚烧、炼铁、酮溶解和 料生产是全球二恶英污染的主要部分（杨小芳， 2000）。对于不同的国家和地区，各个来源所占的比例各不相同。对于欧美等发达国家，是以燃烧过程为主要污染源。而在我国则由于工业生产技术的限制，工业生产过程是主要的污染源。随着城市化和工业化的发展，二恶英产生亦呈增加趋势。 二恶英主要由含氯有机质燃烧时形成，各种工业生产也微量产生二恶英（ 2003）。 二恶英在所有媒介物质 (包括空气、水、沉积物和食物，尤其是奶制品、肉、鱼和贝类 )中广泛存在。因为食品消费是人类接触毒物的主要途径，几乎所有二恶英类物质都是通过摄食进入人中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 4 体。尤其肉、奶和鱼的脂肪内容易富集二恶英。一些土壤、沉积物和动物内二恶英含量高，而水和空气中含量低。 产生的二恶英可通过 空气、饮水及食物直接经呼吸道或口腔进入人体，也可以通过皮肤进入人体。但人类主要因为二恶英在食物链的富集作用而直接暴露于二恶英。通过食物链传递，二恶英在生物体内可高度蓄积，造成对人和环境的危害（ 。 超过 90%的二恶英是通过膳食进入人体，其中大部分膳食为动物产品。由于二恶英的脂溶性和在环境中的极高稳定性，环境污染通过水生植物、浮游生物 食鱼鱼类 鱼体、家禽及禽蛋富集。动物因为摄食用污染的动物性脂肪和工业用油生产的饲料，也会造成二恶英蓄积。因此，鱼、家禽及禽蛋、肉类 等为主要污染食品。 全球范围内储存了很多高二恶英含量的工业废油。长时间储存这种废油可能导致二恶英释放到环境中，并污染人和动物的食物供给。二恶英不易在不污染环境和人类的情况下被处理。 恶英的毒性及毒性机制 二恶英的毒性 目前发现的无意识合成的副产品中毒性最强的化合物。根据美国环境保护署 (994 年 9 月的报告，其中四氯代二苯并 二恶英 (2， 3， 7， 8， 迄今为止所发现的毒性最强的物质，被称为“地球上毒性最强的毒物”，其毒性相当于氰化钾 ( 1 000 倍、氰化钠的 130 倍、砒霜的 900 倍、马钱子碱的 500 倍以上，比黄曲霉素高 10 倍，比 3,4氯联苯和亚硝胺还要高数倍（张洁， 2000）。 有极强的急性毒性，机体接触少量就会有明显的中毒反应。因此，国际癌症研究署 ( 1997 年 2 月 14 日的报告中将 2， 3， 7， 82000）。美国 1995 年对全球二恶英危险的评价报告指出，癌症病人中万分之一受二恶英侵害。美国环境保护局（ 经把 为“人类易感致癌物质”。 各种二恶英毒性差异大 ，有的毒性相差达万倍以上。造成毒性差异的原因是氯原子取代数目和位置不同。二恶英化合物中，含有 4 至 8 个氯原子， 2、 3、 7、 8 位置被氯原子取代的同系物毒性大，这样的二恶英化合物共 17 种，而其他 1代二恶英的毒性当量因子低于 际纯粹化学和应用化学联合会（ 经对所有 209 种 号 (1994)。在这 209 种 3 种具有二恶英样毒性，这 13 种 有 4 个或 4 个以上氯原子。邻位没有氯原子取代的共平面 毒，其中尤以双对位和多于两个侧位氯取代的 毒，如 们的结构最接近 2， 3， 7， 8雯， 2001）。 二恶英具有广泛生物毒性作用，有些毒性作用具种特异性（ 1989）。其毒性大小受动物种属、品系及年龄影响，其中豚鼠对其最为敏感。二恶英大部分实验动物半数致死量（ g/平。不同种属急性经口毒性的 ug/验结果如下：豚鼠 2，鸡 25 50，恒河猴 30 300，小鼠 114 284，田鼠 505（刘燕群， 2004）。比如对豚鼠的死亡时间为 1 2 周，大鼠为 2 3 周，小鼠为 3 4 周，猴为 6 8 周（ 1991）。 鉴于二恶英毒性巨大，部分国家于上世纪 90 年代陆续颁布了二恶英安全摄入量标准（ 重），其数值分别为：瑞典 5；荷兰 4；德国 10；意大利 1；美国 本 4。中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 5 有些国家对食品中二恶英作了最高残留限量（ ng/定，对于奶制品：比利时 5；荷兰 6；德国 5；对于脂肪为 5；鸡蛋为 20； 定的相应食品中二恶英最大含量限量标准为：牛肉 1；鸡肉 4；鸡蛋 7。美国环境保护局 规定日允许摄入量为 重， 则规定为1坚， 2000）。另外，国的排放标准则为 1.0 大多数关于二恶英对健康的影响信息来自对实验动物的研究。一些影响已经在意外暴露人群和暴露于二恶英的工作者观察到。科学家已经确认了二恶英类物质产生这些影响的几个步骤。 二恶英对环境的危害特别是对人类健康的影响超过了 20 世纪 60 年代的 恶英主要通过改变机体及细胞内平衡发 挥毒性效应。二恶英的毒性表现为急性、慢性和次慢性效应。急性作用时，肝脏是主要受害器官。但普通人群不可能接触到高纯度二恶英，也就不大可能急性中毒致死，只可能受到长期低剂量的暴露。由于二恶英特有的物理化学性质，二恶英广泛存在于环境中，通过食物链的富集作用，对动物和人类造成直接或间接的影响。人类二恶英慢性中毒症状包括：氯唑疮、脱发、卟啉病、神经麻木、肝损伤、体重减轻、身体衰弱、生殖发育、智力障碍、免疫抑制以及“三致”作用等。 二恶英的毒性作用呈多样化。典型如： 体重在死亡之前通常急剧下降。实验动物的体重在死亡前 一般减少三分之一至一半。二恶英急性作用时，动物淋巴组织萎缩，如胸腺和脾。 某些上皮组织增生和 /或异生化。在很多生物，肝脏是二恶英的靶组织（ 1979）。相对低剂量时，可导致肝肿大，此时诱导酶量增加，且肝脂肪含量也改变。在豚鼠，可观察到二恶英对肝脏的明显作用（ 1984）。也有胃粘膜、胆管、膀胱上皮细胞增生的报道。眼睑会出现鳞状上皮化生，引起眼睑炎，耳道腺鳞状上皮化生，引起耳道蜡样化脓。 氯痤疮是二恶英毒性的典型表现（ 1984）。这是一种急性囊性痤疮，皮肤发生增生和角质化改变，以及色素沉着。皮肤或机体系统二恶英暴露均可在敏感生物引起氯痤疮，包括人、猴、无毛鼠和兔等。氯痤疮持续