灭活剂和佐剂

灭活剂和佐剂,第一节 灭活剂,灭活是生物制品中的一项非常基本技术！ 提高生物制品的安全性防止病原体扩散,一、灭活与灭活剂,（一）什么是灭活？,微生物学意义上灭活有两层含义：1、是指破坏或杀死微生物使其成为没有生命物质的过程。2、生物制品上的灭活还有灭能的含义，是指将一些活性物质（微生物及其代谢产物、激素、酶、血清因子和抗体等）丧失活力的过程。例如：经过56度加热30分钟处理，可破坏诊断血清和待检血清中的补体活性，从而避免补体对诊断的干扰作用。,生物制品意义上灭活的含义：是利用物理或化学的方法，破坏微生物的生物学活性，破坏病原微生物的繁殖能力和致病能力，但仍然保留反应原性和免疫原性的过程。,（二）灭活的类型,按照灭活作用的性质可分为两类：1.物理灭活2.化学灭活,1、物理灭活,热灭活：容易发生菌体蛋白质变性超声波灭活：应放在冰浴中间断进行紫外线灭活：不够好射线照射灭活：根据被照射物的容量大小选择照射距离和照射强度。,2、化学灭活,利用化学药品等使微生物、活性物质的某些某些结构位点发生改变，从而丧失生命力、感染性、毒性或活性。效能常受灭火剂种类、剂量和作用温度、pH、时间等因素的影响，使用时必须筛选最佳的灭活条件。方法简单、效果确实、最为常用。,（三）灭活剂,用于灭活微生物的化学试剂或药物1911年，Lowenstein DH用甲醛处理破伤风毒素而制成类毒素 1924年，Puntoni以苯酚或甲醛处理制成犬瘟灭活苗1934年，Morion Dorset等用结晶紫灭活猪瘟病毒制成猪瘟结晶紫疫苗。,是最古典、使用最广泛的灭活剂兽医生物制品制造及检验规程（2000）中的26种灭活疫苗，均以甲醛作为灭火剂。,二、常用灭活剂的灭活机理与应用,1、甲醛,甲醛的水溶液福尔马林 (含甲醛3640%) 灭活机理：还原作用,氨基 甲基胺,羧基 亚甲基二醇单酯,巯基 亚甲基二醇,甲醛 醛基,羟基 羟基甲酚,灭活浓度：需氧细菌0.10.2，厌氧细菌0.40.5，病毒0.050.4。 灭活原则：低浓度、短时间而又能达到彻底灭活目的。 必要时可在灭活后加入焦亚硫酸钠，以中断其反应。,N-乙酰乙烯亚胺（AEI)、二乙烯亚胺(BEI) 、缩水甘油醛（GDA）灭活机制： 1. 烷化DNA分子中的鸟嘌呤或腺嘌呤等，引起单链断裂或双螺旋链交联，因改变DNA的结构而破坏其功能，妨碍RNA的合成，从而抑制细胞的有丝分裂。 2. 与酶系统和核蛋白起作用而干扰核酸代谢。,2. 烷化剂（Alkylating agent）,优点：能破坏病毒的核酸芯髓，使病毒完全丧失感染力，而 不损害其蛋白衣壳，保留其保护性抗原。,（1）N-乙酰乙烯亚胺（AEI）淡黄色澄明液体，有轻微氨臭味，能与水或醇任意混合。04可保存1年，在-20可保存2年。AEI功能基团是乙烯亚胺基，可用于口蹄疫灭活苗。口蹄疫病毒液: 终浓度0.05，308h, 加2硫代硫酸钠阻断,（2）二乙烯亚胺（BEI）市购商品为0.2的BEI溶液，在04可保存1个月;口蹄疫病毒悬液：终浓度0.02%, 加入2硫代硫酸钠中断灭活。,大肠杆菌、噬菌体、新城疫病毒灭活效果优于甲醛。本品易挥发，水溶液含量为1531mg/ml。04 保存3个月后含量渐下降，约半年失效；20只能保存10 d。,（3）缩水甘油醛（GDA）,3. 苯酚,又称石碳酸。有腐蚀性，而且有毒！易溶于水及有机溶剂。灭活机制：使微生物蛋白质变性和抑制如脱氨酶、氧化酶等酶系统的活性，从而导致微生物死亡。通常：生物制品的常用量为0.3%-0.5%, 另外，芽孢、真菌和病毒对苯酚的耐受性很强。,4. 结晶紫,是甲基紫、龙胆紫的纯品。灭活机制：是结晶紫阳离子与微生物蛋白质带阴性电荷的羧基形成弱电离的化合物，从而干扰微生物正常代谢和氧化还原作用，主要干扰细胞壁肽聚糖的合成，导致革兰氏阳性菌生长繁殖受阻。,5. -丙内酯,又名丙内酯。灭活机制：破坏病毒的核酸芯，但不损坏衣壳蛋白，因此保护性抗原成分得以保留，主要用于狂犬病灭活苗的制备。然而研究表明，丙内酯是一种潜在的致癌因子。,6. 硫柳汞,常用做生物制品的防霉和消毒剂，对霉菌、细菌和病毒都有一定的灭活作用，百日咳菌苗作为灭火剂。 常用浓度为0.01%-0.02%。,1、灭活剂特异性：如石炭酸对真菌和病毒效果差，但对细菌效果好。结晶紫能杀死多种革兰氏阳性菌和阴性菌，但对绿脓杆菌和细胞芽孢作用弱。2、微生物种类和特性：,三、影响灭活作用的因素,3、灭活剂浓度（一定要适合）4、灭活温度：通常同一浓度的灭活剂在不同温度的灭活速度与温度成正比，但温度太高，对微生物的抗原性将有不利影响。（具体不同病原体或毒素，其灭活时间和温度不一致）。,5、灭活时间：一般采用低浓度、低温和短时间处理为最佳。6、灭活pH值：7、微生物含氮量：一般微生物或毒素的总氮量和氨基氮含量越高，灭活剂的消耗量就越大、灭活脱毒越慢。8、有机物存在：,第二节 佐剂,佐剂是免疫学和生物制品学中的一个重要内容,对增强机体对抗原的免疫应答，提高生物制品的免疫效应发挥着重要作用,什么是 “佐剂”呢？,1. 佐剂（新概念）：凡是可以增强抗原特异性免疫应答的物质均称为佐剂。 佐剂（旧概念）：当一种物质先于抗原或与抗原混合或同时注射于动物体内，能非特异性地改变或增强机体对该抗原的特异性免疫应答,发挥其辅佐作用的物质。 也称免疫佐剂、抗原佐剂。注意: 佐剂和免疫增强剂的关系?,一、佐剂概念与作用特点, 明显增强抗原性微弱的物质诱导机体产生特异性免疫应答。 用最少的抗原和最少的接种次数，产生足够的免疫应答。,作用特点：,二、 研究历史,1、起始阶段,1916年Moignar最早用羊毛脂与石蜡油制成伤寒沙门氏菌乳剂苗；继后Prevet用羊毛脂加琼脂为佐剂制出炭疽菌苗。 1925年，Gaston Ramon证明了明矾的佐剂作用。,2、1950年代,为提高兽医生物制品的免疫效果，在兽医领域对佐剂进行了广泛的研究。,用氢氧化铝胶吸附再加油佐剂制成的猪丹毒菌苗，免疫乳猪后的免疫力可持续9个月，比铝胶佐剂苗提高1倍。,3、1960年代以后,矿物油佐剂的研究发展迅速,布氏杆菌油佐剂苗（1966） 魏氏梭菌油佐剂苗（1966） 流感油乳剂苗（1977） 禽支原体+新城疫油乳剂二联（1978） 链球菌+葡萄球菌乳剂二联苗（1984）,4、我国的佐剂的研究,佐剂的研究和佐剂苗的生产，始于1950年代。,1958年曾用羊毛脂和液体石蜡油制造猪丹毒油乳剂苗，但效果不理想。 1980年代以来，对白油佐剂的研究和应用发展极快，尤以禽病白油佐剂疫苗的种类更多，使用效果也比较满意。,WHO认为佐剂除具有免疫增强效应外，尚必须具备下列标准，否则不得用作佐剂。,三、佐剂标准,1、无致癌或辅助致癌性,不能诱导或促进肿瘤形成。,2、安全无毒性,通过肌肉、皮下、静脉、腹腔、滴鼻、口服等各种途径进入动物体后无任何副作用。,3、纯度高、杂质少,杂质往往是副作用的诱发物。因此，佐剂必需符合质量标准。,4、应有一定的吸附力 最好吸附力强,5、在动物体内易降解 不宜长时期留存而诱发组织损伤,6、不含与动物有交叉的抗原 以避免诱发自身免疫反应，防止发生自身免疫性疾病。,7、不应诱发自身超敏性 也不应与抗体结合形成有害的免疫复合物。,8、应性质稳定 佐剂抗原混合物储存1年以上，必须不分解、不变质和不产生不良物质。,四、免疫佐剂作用机理, 改变正常免疫机能，吸引大量巨噬细胞以吞噬抗原； 改变抗原的构型，使抗原物质降解，并加强其免疫原性； 延长抗原在组织内的贮存时间，使抗原缓慢降解和缓释，并发挥免疫系统的细胞间协同作用（巨噬细胞与T细胞，T细胞与B细胞）。,作用方式, 抗原递呈（antigen presentation） 抗原寻的（antigen targeting） 免疫调节（immune modulation）,作用机理,抗原递呈： 指抗原分子递呈给T细胞的方法。佐剂与疫苗联合使用，有助于抗原性物质在胞内被加工，被MHC分子特异性的结合、保护、运输并递呈给效应细胞。, 抗原寻的（antigen targeting） 指抗原传递给免疫系统中适当效应细胞的效率。包括吸引巨噬细胞到达组织部位、活化吞噬细胞、促进抗原与细胞受体的结合等。, 免疫调节（immune modulation） 是指任何可以修饰的免疫效应细胞对抗原或表位进行加工的机制。通过这种机制，可以改变特异性免疫应答的本质或强度。T细胞有Th1和Th2两个亚类。同一抗原和不同佐剂一起使用能够引起不同的免疫反应。因此，通过筛选特定的佐剂，可以达到诱导正确的免疫应答的目的。,1. 按佐剂物理性质 颗粒型佐剂 非颗粒型佐剂2. 按佐剂的生物学性质（即Ballanti分类法） 微生物及其组分佐剂 非微生物物质佐剂3. 按佐剂在体内存留的时间 贮存型佐剂（depot type adjuvant） 非贮存型佐剂（non-depot type adjuvant）,五、佐剂的分类,六、常见的兽用免疫佐剂,1、矿物质类佐剂 矿物质佐剂是传统佐剂中的一类。 在兽用疫苗的制备中广泛使用。,氢氧化铝胶,磷酸铝胶,特点 主要诱导体液免疫应答，可刺激机体迅速产生持久的高抗体水平。 比较安全。,缺点 皮下注射时常有肿胀或结块；不能有效刺激保护性T细胞免疫。,2、油类佐剂,主要有,弗氏佐剂,弗氏不完全佐剂,弗氏完全佐剂,白油佐剂,是指一类由油类物质、水溶液和乳化剂按一定比例混合形成的佐剂。 该类佐剂主要在抗原寻的过程中起作用，使抗原在注射部位保持稳定，为抗原在淋巴系统中转运提供载体，增加单核细胞的形成和积聚。 油乳剂疫苗的免疫效力高低，直接与乳化作用的好坏及油、乳化剂质量有关。,油乳佐剂,分为,单相乳化佐剂,双相乳化佐剂,单相乳化佐剂,（1）油包水（ W/O） 较粘稠，在机体内不易分散；但佐剂活性优良，为生物制品所采用的主要剂型,（2）水包油 （O/W） 较稀薄，在机体内易于分散；但佐剂活性很低，生物制品中不采用。,双相乳化佐剂,又分为水包油包水和油包水包油 型,粘度小，注射局部反应轻微， 易吸收和佐剂效应高,一种液体或粉末微粒（分散相或内相）借助乳化剂、机械力的作用，分散悬浮于另一种不相溶的液体（连续相或外相）中从而形成稳定的分散体系。,油乳佐剂原理,乳化剂,指油乳剂中内相与外相间的界面活性物质，具有促进和稳定两种互不相溶物形成乳剂。,如羊毛脂、Span-80、Arlacel-80、Tween-80、AtlsG-1471等。,乳化原理,降低分散物的表面张力，在微滴表面上形成薄膜或双片层，以阻止微滴(粒)的相互凝结。,佛氏不完全佐剂,是由低引力和低粘度的矿物油及乳化剂组成的一种贮藏性佐剂。,佛氏完全佐剂,在不完全佐剂的基础上加一定量的分支杆菌而成。,虽然具有一定的副作用，但其佐剂活性是其它物质难于相比的。,佛氏佐剂的特点,可使在正常状态下缺乏免疫原性的物质成为免疫原。 先作用于Th1细胞，后是Th2细胞，并能启动细胞免疫而发挥作用。,国外常用白油：Drakocel-6VR、Marcol-52和Lipolul-4国内常用白油：7号或10号白油质量标准: 无色无味； 50运动粘度7m2s左右； 紫外吸收值（250-350）0.1，紫外消光系数12108； 单环芳烃与双环芳烃含量低于0.5，无多环芳烃； 小鼠腹腔注射0.5ml 观察160d 或家免皮下注射2.0ml白油观察60d，表现正常。,白油佐剂,（1）剂在水中法： 将乳化剂直接溶于水中，在激烈搅拌下将油加入，可直接生成O/W乳剂。若欲得W/O型，可继续加入油，直到发生变型。该法通常用匀浆器或胶体磨，高速搅拌而得到较好的乳剂。,油乳佐剂乳化方法,（2）剂在油中法： 将乳化剂溶于油相，将油相直接加入水相中得O/W，如水相直接加入油相，得到W/O型，如欲得O/W，继续加入至变型。该法制成的乳剂，一般均匀颗粒直径在0.5m左右，比较稳定。,免疫实验动物用的佐剂配制: (1)弗氏佐剂：矿物油75%85，乳化剂1525%，混合后经除菌过滤而成为FIA；如向其中加入0.5mgm1死结核杆菌即为FCA。使用时，将含抗原的水相，与上述任一佐剂等量混合，用力振摇即可成为均匀的乳剂。(2) 白油佐剂：9份油和1份Span-80混合后加2Tween-80和12%硬脂酸铝，经高压灭菌后备用，注射前将配好的油佐剂与抗原水相1：1混合，强力振摇，可配制成性状良好的乳剂疫苗。,大量生产白油乳剂疫苗: 油相: 94白油、6Span-80、1%2硬脂酸铝，灭菌即可； 水相：抗原液加24% Span-80; 乳化：将油相与水相按3：12：1比例配制，先缓速混合，再通过胶体磨充分乳化，可获得稳定的油包水乳剂苗。或者将粘稠的W/O乳剂疫苗，再加2 Tween-80 生理盐水，通过搅拌或胶体磨乳化，可制成双相乳剂疫苗。,（1）粘度测定：流出法、Saybolt粘度计法吸管内口直径为1.2 mm，室温下吸满l ml乳剂，垂直放出0.4 ml所需时间作为粘度单位。以 2-6 S为合格，不得多于10-15 S。（2）乳剂稳定性测定： 加速老化法：疫苗于37贮存10-30 d不破乳。 离心加速分层法：于半径10 cm离心管装油乳剂，3000 rpm离心15 min不分层，相当于保存1年以上不破乳。,油乳佐剂检验,3、蜂胶佐剂,是一种优良的天然药物； 具有广泛的生物活性和药理作用（抗菌、抗病毒、抗肿瘤、消炎）； 具有免疫增强作用：能保持抗原特性，增强巨噬细胞的吞噬能力，促进抗体的产生，提高机体的特异性和非特异性免疫力。,（1）蜂胶的处理： 蜂胶（4以下贮存） 粉碎过筛 按1：4（W/V）加95乙醇 室温浸泡2448h 冷却 过滤或离心取上清 透明栗色纯净蜂胶浸液 4以下保存备用 除去干渣计算出浸液中含蜂胶量。（2）蜂胶佐剂疫苗的制备： 灭活菌液或病毒液，加入蜂胶乙醇浸液，使每毫升菌液中含蜂胶10mg，边加边摇荡，成为乳浊状，即可。,蜂胶佐剂疫苗制备方法：,1、细胞因子类佐剂,细胞因子的概念 是机体的各种细胞在其生命周期中所释放的具有不同生物学效应的物质，是免疫细胞间相互作用的调节信号。该类物质相互诱生，相互影响，构成一个巨大的细胞因子网络（cytokine network）系统，各种细胞借助自己所释放的细胞因子完成各自的功能，在免疫应答中发挥作用。,七、新型佐剂,细胞因子的分类（根据生物活性）经典的细胞因子： 淋巴毒素（LT）、肿瘤坏死因子（TNF）、干扰素（INF）2. 对体液免疫和细胞免疫具有调节作用的因子： 白细胞介素（IL）和集落刺激因子（CSF）,1作为免疫佐剂，提高疫苗的免疫效果2作为免疫治疗剂，预防和治疗某些病原感染3通过基因重组，构建新型基因工程疫苗 IL-2-AIV-HA重组痘病毒,细胞因子的应用,几种重要的细胞因子,白细胞介素-2（IL-2） 白细胞介素-4（IL-4） 白细胞介素-12（IL-12） -干扰素（IFN-）,刺激物为抗原或促有丝分裂原（ConA）； T细胞分泌； 无抗原特异性。 糖蛋白，含133aa ，分子量15-35kDa； 70 30 min及pH值2-9范围内稳定。,IL-2,刺激物：抗原或丝裂原；由Th细胞产生分子量1520kDa，有23个糖基化部位，140个氨基酸一种强有力的佐剂候选因子,IL-4,是目前发现的唯一主要由B细胞产生的细胞因子，与IL-2有协同作用，所以曾被称为细胞毒淋巴细胞成熟因子（CLMF）和天然杀伤细胞刺激因子（NKSF）。 糖蛋白，分子量75kDa，由40kDa（P40）和35kDa（P35）两个亚单位构成，两个亚单位完全由不同的基因所编码，只有结合为一个完整的分子时才能发挥生物学活性。 IL-12活性高于IL-2和IFN，在极低浓度时就有显著活性，对灭活疫苗、肿瘤和寄生虫抗原具有有效的佐剂活性。 IL-12诱导产生的Th1应答反应尤为引人注目，可望用于主要诱导细胞免疫应答的疫苗佐剂。,IL-12,由致敏T细胞在活的或灭活的病毒等干扰素诱生剂和某些细胞因子作用下所产生； 有抗病毒、抗肿瘤、免疫调节和免疫佐剂等免疫生物学活性。 主要诱导MHC-II的表达。 目前IFN-与抗原杂合的融合分子的研究是个热点，期待其成为一个有效的佐剂。,IFN-,2、CpG DNA,CpG DNA：指含有非甲基化CpG（胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸）基序的脱氧核糖核酸DNA。 CpG基序（ motif）：指以非甲基化的CpG为基元构成的回文序列，其碱基排列大多为5-Pur-Pur-CpG-Pyr-Pyr-3，具有较强免疫活性，称为免疫刺激序列（ISS，immunostimulatory DNA sequences）。 CpG OND：含有非甲基化CpG基序的寡聚脱氧核苷酸 。,细胞因子的分泌和细胞的分化,CpGDNA的免疫刺激效应（作用机制）,温度能量,酸化内体小泡,DNA-PK,TLR-9,胞质内受体蛋白,有丝分裂原蛋白激酶和转录因子等信号通路,引起B细胞分化，分泌IL-6、IL-10等细胞因子和表达MHCII、B7-1、B7-2等表面分子，并阻止B细胞的凋亡。 直接激活单核细胞、巨噬细胞和树突细胞，分泌IL-12、INF-r等Thl样为主的细胞因子，并刺激MHCII、B7-1、B7-2的表达。,CpG DNA对多种免疫细胞有激活作用,在IL-12协同下激活NK细胞，杀伤活性增强，并分泌IFN-r