高效毛细管电泳法在药物分析中的应用

2017/11/2,高效毛细管电泳法在药物分析中的应用,山东药品食品职业学院 任玉红,2010年执业药师继续教育,2017/11/2,该内容共分两部分进行介绍第一部分 概述第二部分 高效毛细管电泳技术的分离模式及应用,2017/11/2,第一部分 概述 高效毛细管电泳法(HPCE )又称毛细管电泳法(capillary electrophoresis，CE）。 是以毛细管为分离通道，以高压电场为驱动力，依据供试品中各组分之间淌度（单位电场强度下的迁移速度）和（或）分配行为上的差异而实现分离的新型液相分离分析技术。,2017/11/2,1937年，Tiselius(瑞典)将蛋白质混合液放在两段缓冲溶液之间，两端施以电压进行自由溶液电泳，第一次将人血清提取的蛋白质混合液分离出白蛋白和、球蛋白；第一次的自由溶液电泳； 一台电泳仪;,Tiselius建立了移动界面电泳，将电泳发展成分离技术。 1948年获得诺贝尔化学奖。,2017/11/2,1981年，Jorgenson和Luckas，用75m内径石英毛细管进行电泳分析，柱效高达40万/m，促进电泳技术发生了根本变革，迅速发展成为可与GC、HPLC相媲美的崭新的分离分析技术高效毛细管电泳。 19881989年出现了第一批毛细管电泳商品仪器。,目前，在生命科学、药物分析、以及从小分子、离子到单细胞分析的一系列领域得到了广泛的应用。,2017/11/2,一、高效毛细管电泳法的特点,高效毛细管电泳法是经典电泳技术和现代微柱分离相结合的产物。 与高效液相色谱法（HPLC）相比，其相同处在于都是高效分离技术，仪器操作均可自动化，且二者均有多种不同分离模式。二者之间的差异在于：HPCE用迁移时间取代HPLC中的保留时间，HPCE与HPLC相比，分析速度快；柱效高；所需样品量及流动相用量少；但HPCE仅能实现微量制备，而HPLC可作常量制备；同时，HPCE没有泵输液系统，因此成本相对较低，通过改变操作模式和缓冲液的成分，有很大的选择性，可以根据不同分子性质（诸如大小、电荷数、疏水性等）对极广泛的对象进行有效的分离。而HPLC为达到同样的目的，需要消耗价格昂贵的柱子和大量的溶剂。,2017/11/2,HPCE和普通电泳相比，由于其采用高电场，因此分离速度快；检测器则除了未能和原子吸收及红外光谱连接以外，其它类型检测器均已和HPCE实现了连接检测；一般电泳定量精度差，而HPCE和HPLC相近；HPCE操作自动化程度比普通电泳要高，与传统的电泳相比主要有四个特点，即高效、快速、微量和自动化。,2017/11/2,毛细管电泳技术兼有高压电泳及高效液相色谱等优点，其突出特点是:,1.仪器简单、易自动化 电源、毛细管、检测器、溶液瓶2.分析速度快、分离效率高 在3.1min内分离36种无机及有机阴离子，4.1min内分离了24种阳离子；分离柱效：105107/m理论塔板数3.操作模式多，开发分析方法容易 4.操作方便、消耗少 进样量极少，水介质中进行5.应用范围极广,2017/11/2,二、毛细管电泳的基本装置与操作,毛细管电泳的基本装置由高压电源、毛细管、检测器、电解质贮液槽、进样器、控制系统及数据处理系统组成。,1温度控制系统；2高压电源；3高压电极槽；4毛细管；5检测器；6低压电极槽；7铂丝电极；8记录/数据处理检测器,2017/11/2,几个主要部分的特点:,进样：最常用的进样方式为流体力学方式和电动方式两种。 分离：分离部件主要包括毛细管、毛细管恒温系统和电源。毛细管材料应具有化学和电学惰性、紫外可见光透光性、柔韧性、强度高和便宜等特性。熔融石英是毛细管的首选材料，最常用的是内径为2575m的毛细管。 检测：紫外可见光检测是最常用的检测方式，但是受到仪器、单波长等因素的限制，目前应用最广泛的是二极管阵列（PDA）检测器。 液体的处理：该系统包括自动进样装置、缓冲液更换系统和缓冲液的水平系统等。,2017/11/2,完成典型的HPCE实验，一般包括以下操作步骤：,移开进样端的电解质贮液槽，换上样品管使用低压或电迁移方式进样换电解质贮液槽加上分离电压样品分离，用检测器进行检测,2017/11/2,电泳 是指在电场作用下，溶液中的带电粒子作定向移动的现象。单位电场下的电泳速度称为淌度或电迁移率。 离子所带电荷越多，解离度越大，体积越小，溶液粘度越小，有效淌度就越大，其电泳速度就越快。这也是电泳分离及其条件选择的根本依据之一。,物质离子在电场中差速迁移是电泳分离的基础。,三、毛细管电泳法的基本理论,2017/11/2,电渗 高效毛细管电泳操作中一个基本组成部分是电渗流（electroosmosis，EOF）。电渗流是毛细管内壁表面电荷所引起的管内液体的整体流动，来源于外加电场对管壁溶液双电层的作用。 CE所用的石英毛细管柱，在pH3的情况下，其内表面带负电，和溶液接触时形成双电层。在高电压的作用下，双电层中的水合阳离子引起流体整体向负极方向迁移的现象叫电渗。 电渗流是毛细管中的溶剂因轴向直流电场的作用而发生的定向流动。,2017/11/2,电渗流的方向,电渗流的方向取决于毛细管内表面电荷的性质： 内表面带负电荷，溶液带正电荷，电渗流流向阴极； 内表面带正电荷，溶液带负电荷，电渗流流向阳极； 粒子在毛细管内电解质中的迁移速度等于电泳和电渗流（EOF）两种速度的矢量和，正离子的运动方向和电渗流一致，故最先流出；中性粒子的电泳流速度为“零”，故其迁移速度相当于电渗流速度；负离子的运动方向和电渗流方向相反，但因电渗流速度一般都大于电泳流速度，故它将在中性粒子之后流出，从而因各种粒子迁移速度不同而实现分离。,2017/11/2,多数情况下，电渗流速度是电泳速度的5-7 倍。 因此，在毛细管电泳中利用电渗流可将正、负离子和中性分子一起朝一个方向产生差速迁移，在一次CE 操作中同时完成正、负离子的分离测定。由于电渗流的大小和方向可以影响CE 分离的效率、选择性和分离度，所以成为优化分离条件的重要参数。用来控制电渗流的方法主要有改变缓冲溶液的成分和浓度；改变缓冲溶液的pH 值；加入添加剂；毛细管内壁改性；外加径向电场；改变温度等。,2017/11/2,四、影响高效毛细管电泳分离的因素,1.缓冲溶液 CE中常用的缓冲试剂有：磷酸盐、硼砂或硼酸、醋酸盐等。缓冲液浓度升高，离子强度增加，电渗流减小，分析效率提高；同时，增强样品的富集现象，从而提高分析灵敏度。,2pH值 pH能影响样品的解离能力，样品在极性强的介质中离解度增大，电泳速度也随之增大，从而影响分离选择性和分离灵敏度。,2017/11/2,3. 分离电压 相对较高的分离电压会提高分离度和缩短分析时间，但电压过高又会使谱带变宽而降低分离效率。,4. 温度的影响,毛细管内温度的升高，使溶液的黏度下降，电渗流增大。5. 添加剂的影响6. 进样,2017/11/2,第二部分 高效毛细管法的分离模式及应用,2017/11/2,一、高效毛细管电泳的分离模式,1、毛细管区带电泳(CZE)2、毛细管凝胶电泳(CGE)3、毛细管等速电泳(CITP)4、毛细管等电聚焦(CIEF)5、胶束电动毛细管色谱(MEKC或MECC)6、毛细管电色谱 (CEC),2017/11/2,1、毛细管区带电泳 CZE,将待分析溶液引入毛细管进样一端，施加直流电压后，各组分按各自的电泳流和电渗流的矢量和流向毛细管出口端，按阳离子、中性粒子和阴离子及其电荷大小的顺序通过检测器。中性组分彼此不能分离。 正离子在负极最先流出；中性粒子：无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流出；阴离子在负极最后流出，在这种情况下，不但可以按类分离，同种类离子由于差速迁移被相互分离。,CZE最基本的操作模式，应用最广泛，是其它各种操作模式的母体。用以分析带电溶质，如多种蛋白质、肽、氨基酸的分析。,2017/11/2,2、毛细管凝胶电泳 CGE,将聚丙烯酰胺等在毛细管柱内交联生成凝胶。 其具有多孔性，类似分子筛的作用，试样分子按大小分离。能够有效减小组分扩散，所得峰型尖锐，分离效率高。 蛋白质、DNA等的电荷/质量比与分子大小无关，CZE模式很难分离，采用CGE能获得良好分离，DAN排序的重要手段。 特点：抗对流性好，散热性好，分离度极高。 毛细管凝胶电泳分凝胶和无胶筛分两类。无胶筛分技术：采用低粘度的线性聚合物溶液代替高粘度交联聚丙烯酰胺,称为毛细管无胶筛分。柱便宜、易制备。,2017/11/2,CGE 是毛细管自由溶液区带电泳派生出的一种电泳方式 ，用多孔性的凝胶或其它筛分剂作介质，网状结构，按分子的大小分离,2017/11/2,1） 将两种淌度差别很大的缓冲液分别作为前导离子(充满毛细管)和尾随离子，试样离子的淌度全部位于两者之间，并以同一速度移动。 2）负离子分析时，前导电解质的淌度大于试样中所有负离子的。所有试样都按前导离子的速度等速向阳极前进，逐渐形成各自独立的区带而分离。阴极进样，阳极检测。,3、毛细管等速电泳 capillary isotachophoresis ，CITP,2017/11/2,3）不同离子的淌度不同，所形成区带的电场强度不同(=E)，淌度大的离子区带电场强度小，使溶质按其电泳淌度不同得以分离。 4）特点：界面明显，富集、浓缩作用；常用于分离离子型物质，目前应用不多。,2017/11/2,1)缓冲溶液中加入离子型表面活性剂，其浓度达到临界浓度，形成一疏水内核、外部带负电的胶束。,4、 胶束电动毛细管色谱（MECC，MEKC）,在电场力的作用下，胶束在柱中移动。被分离物质在水和胶束相之间发生分配并随电渗流在毛细管内迁移，达到分离。,2)电泳流和电渗流的方向相反，且电渗流 电泳 ，负电胶束以较慢的速度向负极移动；,2017/11/2,3)中性分子在胶束相和溶液（水相）间分配，疏水性强的组分与胶束结合的较牢，流出时间长； 特点：1）可用来分离中性物质，扩展了高效毛细管电泳的应用范围；2)色谱与电泳分离模式的结合。,2017/11/2,1） 根据等电点差别分离生物大分子的高分辨率电泳技术； 2） 毛细管内充有两性电解质（合成的具有不同等电点范围的脂肪族多胺基多羧酸混合物），当施加直流电压（68V）时，管内将建立一个由阳极到阴极逐步升高的、稳定的、连续的、线性的 pH梯度； 3）氨基酸、蛋白质、多肽等的所带电荷与溶液pH有关，在酸性溶液中带正电荷，反之带负电荷。在其等电点时，呈电中性，淌度为零；,5、毛细管等电聚焦 CIEF,2017/11/2,4）聚焦：具有不同等电点的生物试样在电场力的作用下迁移，分别到达满足其等电点pH的位置时，呈电中性，停止移动，形成窄溶质带而相互分离；,5）阳极端装稀磷酸溶液，阴极端装稀NaOH溶液； 6）加压将毛细管内分离后的溶液推出经过检测器检测； 7）电渗流在CIEF中不利，应消除或减小。 毛细管等电聚焦电泳已经成功用于测定蛋白质等电点，分离异构体等方面。,2017/11/2,是将细粒径固定相填充到毛细管中，或在毛细管内壁涂覆固定相，以电渗流驱动操作缓冲溶液（流动相），使试样组分在两相间进行分离的电动色谱过程。此模式兼具电泳和液相色谱的模式。CEC可分为开管CEC（即管壁涂渍固定相）和填充CEC。,6、毛细管电色谱 capillary electroosmostic chromatography ，CEC,2017/11/2,二、高效毛细管电泳法在药物分析中的应用,高效毛细管技术在药物分析中的应用大致可以分为两部分：一是原料药的定量、原料药中杂质的测定、药物制剂分析以及对它们稳定性的评价等以药品质量控制为目的的测定方法。二是对进入人体内的药物或代谢物的吸收、分布、代谢、排泄等体内动态的研究，即临床药物分析。,2017/11/2,（一）HPCE在药品质量控制方面的研究应用,1HPCE在中药分析中的应用 具有分离效率高、分析速度快、分析时间短、样品前处理简便、进样量少、有机溶剂消耗少、操作简便、分析成本低等优点。另外，HPCE在中药复方制剂复杂成分分析中还具有以下优越性：(1)毛细管柱易于全面清洗，可保持高柱效而使复杂成分较好分离；(2)分离模式多，适合于中药制剂中各类化学成分的分析；(3)不同电泳技术之间及HPCE与NMR、MS等多种技术联用可提高分析的精密度，更可拓宽其应用范围。,2017/11/2,目前已有报道，采用HPCE对丸剂、胶囊剂、片剂、合剂、口服液、颗粒剂以及注射剂等中药制剂或中药中有效成分进行分析。例如，用胶束电动毛细管色谱（MECC）法测定牡丹皮、白芍、赤芍及其不同炮制品的牡丹酚、芍药甙的含量；选择毛细管区带电泳（CZE）分离模式，以麻黄素为内标，建立了适合莨菪类生物碱一阿托品、东莨菪碱、山莨菪碱、樟柳碱优化分离与颠茄酊剂及片剂定量分析的方法，可用于莨菪类生物碱中药制剂的质量控制等。 由此可见，HPCE在中药制剂质量控制及中药现代化进程中必将发挥巨大作用。,2017/11/2,2HPCE在天然产物分析中的应用（1）蛋白质、DNA、多肽、氨基酸的分析： 主要包括肽、蛋白的鉴别、结构分析、微量制备以及蛋白的定量测定、纯度检测；测定氨基酸的组成、序列和一些物化常数（如分子量和等电点等）、鉴别结构和种类不同的蛋白质。在肽和蛋白质的鉴别分析中应用最多的是CZE。对扩散系数小的生物大分子而言，CE还可以作为收集非常纯的单一馏分的微量制备的手段。 例如分离多聚核苷酸并对产物进行纯度测定等，结果使人满意。,2017/11/2,采用MEKC模式，在25分钟内分离了23种丹酰化氨基酸；HPCE可取代传统的氨基酸分析仪,实例1：,2017/11/2,DNA排序,实例2：,2017/11/2,（2）糖及其缀合物的分析 糖分析的难点是糖类物质一般为电中性，且亲水性强，多数没有吸光基团，检测上存在困难。 各种新的糖衍生化反应和检测技术的应用，使CE成为分析单糖、寡糖、糖肽、糖蛋白等糖类化合物的有效手段。单糖的解离常数值一般大于11，需选用pH11强碱性的缓冲液，直接进行电泳分离后紫外检测。这种方法也能用来测定简单寡糖。多糖一般利用酸解或酶解的方法将其转化为寡糖后进行分析。,2017/11/2,在糖的检测方面，UV，EC和LIF（激光诱导荧光）是主要手段。例如：葡萄糖、果糖、绵子糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖、水苏糖等单糖可以利用CZE，胶束电动毛细管色谱（MECC）结合UV进行检测；寡糖和多糖主要采用CZE结合EC的方法进行检测；其他糖类（氨基糖等）则选择LIF（激光诱导荧光）检测。,2017/11/2,3HPCE在药物制剂分析中的应用,CE法具有能排除高含量复杂基体干扰、检测痕量成分的能力，且样品只需经简单预处理即可分析其有效成分含量，现已广泛应用于片剂、注射剂、糖浆、滴耳液、乳膏剂及复方制剂等各种剂型中主药成分的定量测定。 如有文献报道用低pH值的缓冲液测定糖浆中碱性主药的含量时，因赋形剂呈中性，将停留在进样端不迁移而在清洗时被冲走，故可将糖浆样品稀释后直接进样，无需前处理。,2017/11/2,例如，采用此方法，经过筛选比较，确定缓冲液pH3.0，在HPCE柱上富集测定福莫特罗干糖浆；采用CZE技术测定