生物工程生物技术专业英语翻译(四).doc

第四章 发酵技术4.1 发酵的本质发酵技术的起源是大量利用微生物生产食品和饮料，像奶酪、酸乳酪、酒精饮料、醋、泡菜、腌菜及sausages、酱油和许多其他Oriental fermentation（表4.1）。今天这些产品的大规模生产过程是过去家庭内部生产活动的放大版本。与产品形成的发展齐头并进的是对微生物在除去不喜欢的废物过程中所扮演的角色的认识，这使得大规模世界范围服务业的出现，包括水的净化、污水处理及垃圾处理。发酵技术新的扩展利用微生物（1）过量生产重要的特殊的代谢物像甘油、醋酸、乳酸、丙酮、butyl alcohol, butane diol,有机酸、氨基酸、维生素、多糖和黄原胶；（2）生产有用的次级代谢物（代谢物群体其在生产它们的微生物的生命中发挥的作用好像不能很快的被认识到）像青霉素、链霉素、土孢菌素、头孢菌素、赤霉素、生物碱、放线菌素；和（3）生产酶作为想要的工业产品像胞外酶淀粉酶、蛋白酶、果胶酶或者胞内酶像转化酶、天冬酰胺酶、尿酸氧化酶、限制性核酸内切酶和DNA连结酶。最近，发酵技术开始利用高等植物和动物细胞进行我们所知道的细胞或组织培养。植物细胞培养主要针对生产次级代谢物如生物碱、香水和调味品，而动物组织培养开始关注的是蛋白质分子形成如干扰素、单克隆抗体和许多其它的蛋白质。大大肯定了发酵产品的未来市场，由于limited exception, 通过化学方法不能经济的生产这些产品。而且，经济性也发生在基因工程有机体而具有独特的和更高的生产能力。发酵技术产品的商业市场是无限的但是最终要取决于经济与安全性方面的考虑。 商业发酵过程是in essence非常相似的不管选择的是什么有机体、用的是什么培养基及形成什么产物。在所有的情况下，大量的具有一致特征的细胞在限制的控制的条件下生长。同一个装置经过微小改动就可以用来生产酶、抗生素、有机化学试剂或者单细胞蛋白。发酵过程最简单的形式就是仅仅是with a nutrient broth微生物的混合，并使组分发生反应。更为先进和复杂的大规模生产过程需要对整体环境的控制从而使发酵过程能够有效地进行，更为重要的是，能够准确地进行重复，用相同量的原料、broth和cell inoculum生产出相同量的产物。所有的生物工程过程都是在一个容器或者生物反应器中进行的。在过去的三十年里，大部分共同的生物反应器的物理形式没有发生多大的改动。然而，近来，设计出了许多新型的生物反应器，它们将越来越积极的参与到生物工程中。生物反应器的主要功能是减少一个产品或这服务的生产成本，而位于设计和功能不断改进后面的驱动力是提高产品形成速度和产品或者服务质量的需求。研究开始考虑更好的aseptic 设计和操作、更好的过程控制包括计算机的使用及怎样去更好的理解一个系统尤其是热量和质量转移系统的速度控制步骤。在生物工程中，处理过程可认为是成本转化（conversion cost intensive）或者成本回收（recovery cost intensive）。对于conversion cost intensive，体积生产力Qp是重要的，而对于recovery cost intensive，产品的浓度P是减少成本的主要标准。表4.2列出了生物化工工业利用生物反应器生产出的各种不同的产品，而表4.3分辨了生物工程中所采用的各种培养方法。用于生物工程的生物反应器有三种主要的操作方式和两种形式的生物催化。生物反应器可在分批式、半连续（分批给料fed-batch）或者连续基础上进行操作。反应可以在稳定的或者搅动的（agitated）培养液中，在有氧或者无氧、水溶液或者低湿度（固体底物发酵）条件下进行。Biocatalyst可以是处于生长状态或者不处于生长状态的细胞或者是分离的酶用作可溶的或固定的catalyst。总体上，生物反应器中发生的反应是在温和的pH（近中性）和温度（20-65）条件下进行的。在大部分生物反应器里，反应过程是在水相中进行的，产品streams就相对被稀释了。对生物反应器过程的优化包括减少原料（例如，养分、前体、酸/碱、空气）和能量（能量消耗以平均每年16%的速度上涨）的使用，在回收前提高broth中产物的纯度和质量。过程优化是通过控制过程的物理和化学参数来实现的。表4.4列出了过程变化的范围它对于过程的发展是重要的并且在后面进行讨论。这章余下的内容将关注在生物反应器中微生物进行生长的原理，而且更为关注的用于产品形成的微生物细胞。不管酶是以水溶液还是固定化形式发挥作用的，针对于它所采用的生物反应器与特定类型的固定化微生物细胞系统一起将在第五章中讲述。4.2 水溶液系统中微生物培养的原理有机体的生长可以看作是以质量形式或是以细胞数目形式所反映的细胞物质的增加，而且是高度一致（coordinated）的一系列（series）以酶催化的生物步骤的结果。生长的最佳表达取决于必需养分传递到细胞表面（质量传递）与维持的最佳环境参数如温度和pH。生物反应器中细胞物质（X）或者是生物体的数量由重量gravimetrically（用干重、湿重、DNA或者蛋白质）或者数量numerically（用细胞数）决定。倍增时间（td）指生物体重量倍增所需要的时间，而传代时间（g）指细胞数倍增所需要的时间。在平衡生长或者指数生长过程中，当生长过程只由细胞固有的intrinsic活性所控制的话，如果g= td，则每一个细胞都可以进行分裂。平均倍增时间随着细胞大小与复杂性的增加而增加；随后时间里值的范围可以进行实验获得：细菌为0.25-1、酵母为1.15-2、霉菌为2-6.9以及植物细胞为20-40。在理想条件下，微生物合成的潜力是非常巨大的，对于某些类型的细菌，倍增时间仅为15min。然而，最佳生长条件不适用于任意时间长度，而且实际中，生长过程取决于一个限制因素，例如一种关键养分。当这个因素的浓度降到0，那么这个有机体的生长潜力也就下降。Monod（1942）的经典研究得到表述生物反应器中微生物生长关键性质的数学方程。最初数学方程描述比生长速率由S的浓度而作用：（方程式1）这种情况下，S是培养基中一种底物的浓度，与其它重要的养分相比，这种底物的浓度是有限的，max是有机体的最大比生长速率，而Ks代表一个饱和常数。Ks为底物浓度，此时=max/2。这样，如果把底物浓度一直保持为一个合适的值（对于连续培养是重要的），就进行指数生长，比生长速率的值在0到max之间。对生长过程关键养分的鉴定和进行生长所需要的最佳条件来源于分批式与连续式生物反应器系统。有机体浓度的增加速率（dx/dt）就是生长速率，而比生长速率是有机体浓度的单位增加速率（1/x）（dx/dt）。微生物生长与底物利用之间存在一种简单的关系。在简单的系统中，生长速率是底物利用速率的一个恒定的部分，Y：（方程式2）Y是生长得率系数over生长过程的任何时间段。知道了三种生长常数max、Ks和Y的意义，方程式（1）和（2）就给出了一次分批式发酵生长周期的完整数量描述。在分批式发酵中，在最佳的温度、pH和混合条件下，把生长所需的inoculum与养分一同置于一个容器中。这代表了一个封闭的系统除了耗氧有机体，可以连续不断的向生物反应器供应空气。在分批式培养中，生长速率与比生长速率不是一个常数，反映了系统养分不断变化的特点。图4.1示意了微生物分批生长的复杂的本质。最开始的滞后期是没有可见的微生物生长的时期，但是化学分析表明有许多隐蔽的转向代谢暗示着细胞正在适应新的环境并且将要开始生长in due coure。inoculum的生理条件被认为不仅是滞后期持续时间的一个主要影响因素而且还影响未来生长过程和形成产物的特征，例如抗生素的合成。在inoculum 生长之后与指数生长发生之前，有一个过渡的加速期。这个时期无法从生理和数学上很好的理解，因为细胞群有不同的年龄结构和代谢过程。在指数生长期，在有过量养分和没有抑制剂存在的条件下，微生物生长是无限制的。比生长速率达到最大值，=max。然而，在大部分分批式培养过程中，指数生长是短暂的。由于养分被生长细胞群用光，无限制的生长就被有限生长所代替，同时，尽管细胞群仍在增加，但是任何特定点的比生长速率将变得越来越小，max。跟随这个降速期之后的是稳定期，在稳定期，由于养分已经耗尽，整体生长将不再进行。生物体平衡产生，因为生长速率= 死亡速率许多重要的生物工程产品是在生长周期的这个时期optimally形成的，例如抗生素。周期的最后一个时期是死亡期，此时比生长速率为负值（D，dx/dt为正值，细胞浓度升高；当D，dx/dt为负值，细胞洗出；当=D，dx/dt=0，且x是常数。在这种情况下，形成稳定状态，有机体的浓度随时间不发生变化。稀释率也影响生物反应器中底物的浓度。在生物反应器中，底物进入时的浓度为sR，被有机体消耗流出时的浓度为s。由另一个平衡方程获得底物浓度变化的net速率：增加=输入-输出-消耗=输入-输出-生长/生长得率系数dx/dt=DSR-Ds-x/Y当稀释率超过max时，有机体洗出。当一个连续培养系统被看作一个生产系统（例如SCP）过程的时候，它的performances用两个标准来评价：（1）单位时间产生的细胞数ouput速率；和（2）单位重量的底物生成的细胞数有效生长速率或产量系数。在稳定状态下，总的ouput等于产物流速和有机体的浓度。为了获得最大ouput细胞或者生物体，稀释率必须高但是它显然不能超过max。实际上，将高ouput与底物的有效利用相连的最大生产效率可以通过流出速度或低于最大ouput速率以及可用的最高底物浓度而获得。这样的最佳条件只与生物体生成相关。尽管当所想要的产物如乙醇是一个发酵产物的时候，可以利用相类似的条件，这个发酵产物的形成与所消耗的底物的量成比例，但是复杂代谢物如抗生素的生产所需要的条件是很不相同的。半连续培养是培养的一种形式，它涉及向初始批次中连续或者系列的添加培养基或者底物，而没有任何缺点。这种系统产物的产量有可能（well）超过传统的分批培养。这个方法在工业中被广泛使用，例如，在面包酵母的生产中。实际中，分批、半连续以及连续培养系统用在工业中生物体的生产或者细胞产物的生产。出于很多的原因，分批培养技术代表了工业生产的主要形式。为了更加充分的理解进行微生物生长的各种技术的动力学机制，应当参考Pirt 和Fiechter所编的书。4.3 生物反应器设计生物反应器是生物工程过程中进行生物反应的容器系统。它为优化有机体的生长和代谢活动提供正确的环境条件；它必须阻止周围环境对生产培养物的污染，同时还要组织培养物释放到环境中，而且有辅助的工具或者探针对最优过程进行控制（表4.5生物反应器设计的基本标准）。许多生物反应器系统需要在aseptic condition 下进行操作。在许多具有工业重要性的系统中，使用的是生产有机体的纯培养物，而且，不需要的外来污染物的存在会以许多方式影响生产过程例如，用生物催化剂进行干扰，将破坏产物，产生破坏下游处理过程的物质，而且还将有毒物质引入到系统中。为了防止出现这个问题，培养基、生物反应器和所有附属工具（pipework）都要进行灭菌（常用高压蒸汽），而且通入的空气需要通过灭菌玻璃wool去除去污染物。在分批发酵培养基中，通常在生物反应器进行灭菌，而在连续系统中，进行外部灭菌。 在发酵工业中，会有污染微生物确实进入到生物反应器中并产生破坏的偶然情况发生。由于这个原因，在抗生素工业中，生物反应器很少有大于200m3的，原因就是当污染发生就会造成大量的损失。当采用连续过程，就需要更加严格的灭菌操作。基因工程微生物在工业中期望更大的利用就需要更为昂贵的除菌技术。对于耗氧过程，设计必须包括通入空气和混合物质的机制，并且所有的系统都必须提供接种和检样及charging and discharging the vessel。需要通过冷却机制除去来自搅拌、通气和氧化代谢过程的能量输入。能量输入的处理低于决定整个混合和通气速率是必要的。构造材料应该是无毒的、耐蒸汽压并能抵御化学和电子腐蚀。工业生物反应器常常用highly polished不锈钢建造。生物反应器有多种形状和大小，且高径比是重要的工作参数。工业生物反应器的大小受所需要的产物的浓度影响，无论选择的是分批还是连续操作。尽管连续培养技术在研究中使用广泛，但是发现它们在工业中的应用是有限的，例如，SCP和乙醇的生产过程及污水处理。几乎所有其他的工业过程采用的是分批或者半连续培养方法。分批和半连续培养技术在工业中的主导地位出于以下一些原因或者全部原因。（a） 在任意设定的时间内，所需要的产物相对数量较小。（b） 市场要求 can be intermittent（c） 某些产物的储存期限短。（d） 需要高的产物浓度以优化下游处理过程。（e） 某些产物只在生长周期的稳定期才产生。（f） 某些生产菌株的不稳定性需要regular renewal.（g） 连续过程有许多技术难题。尽管工业生物反应器有许多设计，但是建立已久的连续搅拌釜式反应器（CSTR）或者容器一直被广泛使用（图4.2(a)）。在没有机械搅拌的生物反应器中，例如，塔式或者环路式生物反应器，通过通入气体来实现搅拌（图4.2(b)）。在大规模的这些类型的生物反应器的液体发酵中，已经认为这样的设计可以经济性的与机械搅拌生物反应器相竞争。然而，在所有系统中，黏度的提高将产生关于通气的主要问题，由于小的气泡合并为大的气泡而表面积减少。总体上，发酵工业所要求的生物反应器应能满足不同的操作条件，包括变化黏度、通气速率、搅拌强度和发酵体积，而实践中，CSTR已被广为采纳。决定选择的一个进一步的考虑是许多工业需要处理一个植物体内不同的产物；因此，可以容易的进行改动的可变系统将是人们所喜欢的。CSTR最基本的设计发展于1940s和1950s工业生产青霉素。它常为一个完全直立的有挡板cylinder而且挡板的宽度为罐直径的10%。无菌空气由容器底部通入，通过一个打开的管或者环状鼓泡器。直立shaft with overhead drive 带有一个或者多个搅拌浆叶取决于径高比。搅拌浆叶常常位于中间位置与罐直径相等 along the shaft去防止流体湍流运动。大部分生物反应器采用平叶式透平搅拌器，一般3-5 are mounted进行良好的搅拌和分散于系统高度（图4.2(a)）。这种搅拌器系统需要输入高的动力，且进行大量的研究以寻找更为有效的设计。一个典型的工业CSTR如图4.3所示。搅拌浆叶的作用是在生物反应器中进行搅拌和混合并且使通气便于进行（图4.4）。搅拌和通气是CSTR操作成本的重要部分。搅拌的主要作用是使细胞和养分悬浮通过培养基，使养分包括氧气能够被细胞利用并且使热量转移。绝大多数的工业有机体是好氧的，在大多数发酵过程中，有机体是高氧需求。既然氧气是一种在水溶液中sparingly可溶的气体，那么发酵过程可由vigorous aretation of the broth 来支持。搅拌以三种方式影响氧传递系数（KLa）：（1）搅拌浆叶将空气打碎为小的气泡增大气体与液体之间的接触面积，（2）搅拌延缓了空气从生物反应器中的流失，和（3）turbulent shear 可以减少气体与液体接触面的film厚度。 塔式生物反应器可定义为加长的搅拌容器，径高比大于6:1（图4.2(b)）。塔式生物反应器没有机械搅拌；空气由塔的底部通入，只能依靠气泡的上升进行混合。由于这个原因，有机体受shear的影响很少。环路式生物反应器在特定的方向引入了一个强大的、可控制的liquid bulk flow（图4.2(c)）。这通过引入draft或者挡板tubes 产生一种液体“内部循环”或者通过使用循环管的“外部循环”来实现。大量来自生活和工业用的废水通常用厌氧和耗氧生物反应器系统来处理。在没有氧气的情况下，某些专门化的微生物能够将可生物降解的有机物质转化为甲烷、二氧化碳和新的新的微生物细胞。初始有机物质中，大约90%化学键合的能量以甲烷的形式回收，5-10%的能量用于新微生物的形成，而约有3%作为热量而浪费掉。这与好氧降解过程形成鲜明的对比，好氧过程中，大约有60%的可利用的能量用于新细胞的生长，而约40%作为过程中热量而损失。最为典型的厌氧生物反应器或者消化器是CSTR（图4.2(d)），以连续或者半连续方式进行操作。利用这个系统，浓缩的废水例如，城市污水处理的sludge与厌氧微生物大约在30下混合，选择the hydraulic retention time (反应器中水滞留的平均时间)使废水有效的稳定而获得高的甲烷产量。对于食品和发酵工业的强的培养基废水，技术设计要能在连续操作系统中，维持微生物生物体较长的时段。由此，固体retention time与液体retention time无关（uncouopled from），在消化罐中可以获得高的微生物浓度，而产生高的降解速率。对于非常稀的废水，例如，城市污水，需要非常长的固体retention time，而且这只能通过流动床过程来实现（见第五章）。甲烷发酵最杰出的例子就是中国的生物气生产过程，建立了几百万个家庭规模的厌氧生物反应器。这种生物反应器处理粪肥、人类排泄物和秸秆，产生生物气用来做饭和照明，以及垃圾的净化，其后来成为一种很好的肥料，每立方米生物反应器每天的体积载量为4kg，mean停留时间小至10天，整个规模的甲烷生物反应器可期望每立方米生物反应器生产1立方米气体。激活的污水sludge处理过程广泛用于污水及其他工业垃圾的氧化处理。这些过程采用的是分批或者连续搅拌生物反应器系统以增加空气的通入来优化有机物质的氧化分解（图4.2(e)）。这些生物反应器是很大的，为了使其发挥最佳的功能，有一些或者许多的搅拌单元使容易的进行混合及许多处理城市污水的植物摄取氧。由于它们开放式的本质，有时候会出现气味的问题。工业废物废水的厌氧生物处理较为采纳的原因是：（1） 通气时不需要能量；（2） 有机物质高效的转化为生物气，用来作为燃料；（3） 没有气味问题；（4） 产生很少的surplus sludge；（5） 经过显微操作，可以生产出高附加值的产物。4.4 培养基设计培养基设计要满足生产有机体、生产目的和操作规模的营养要求。对于许多大规模的生物工程成本，培养基组分的可利用性和处理特点是决定选择的主要因素。对于异氧微生物来说，最基本的营养要求是能量或者碳源、一种可利用的氮源，无机物组分及对于某些微生物还要有生长因子。对于大多数生物工程过程，碳源及氮源常常来源于廉价的天然产物或者副产物的复杂的混合物（表4.6），而自来水中或者主要的初原料中常含有足量的稀有金属。当需要生长因子的时候，供应的应是纯品，但是出于经济原因，常常以植物或者动物的提取物来供应。所需要的生长因子的主要的类型是B族维生素或者相关化合物，特定的氨基酸和某些脂肪酸。如果不进行pH控制，碳源及氮源的合适的平衡对于过程的pH类型是重要的。对大多数过程而言，营养物质必须溶于水。在分批系统中，初体积中常常含有所有的营养物质。以特定的速率为基础通过添加某些营养物质的方式（半连续培养），对分批培养中的发酵反应进一步进行调控。通过这种方式，维持了关键的诱导物溶液。可利用的营养物质将对发酵反应和产物形成过程进行强大的生理控制。由于原料占到可变的发酵成本的60-80%，那么在按配方配制培养基时，经济性是要paramount考虑的。一个发酵过程摄入的原料主要取决于特定时期原料的成本，因为商品的价格随着季节和其他变化而上下浮动的。原料的选择也取决于处理和储存成本、配制过程的容易性及灭菌，同时还需要考虑到健康和安全性。发酵过程中培养基的配制和特定养分的可利用性对产物的优化有着极大的影响。因此，如果发酵的目的是生物体或者是一种生长产物（growth-asscoiated）的话，培养基就必须能进行最大潜能的生长。对不是生长限制性的化合物，例如有机酸、抗生素等等，在初生长期后，培养基要成为一种或者多种养分的缺陷型。根据所研究的生产过程的本质，尤其是如果需要的是次级代谢产物，那么成功采用对磷、氮、，碳水化合物或者痕量金属的限制而实现。某些过程需要培养集中含有一种诱导物，而其他过程可能被培养基的一种组分所阻遏。分解代谢物阻遏在酶的生产中是特别普遍的问题，且证实常常发生在含有葡萄糖的培养基中。阻遏可通过用慢发酵的碳水化合物或者特别是水解淀粉取代葡萄糖而避免。在特定的发酵过程中，也采用递增或者连续的补加一种浓缩的组分的方式。一种工业培养基的组成不仅基于发酵时期的需要而且基于后续的纯化步骤。培养基配制也应该以生产a final fermentation broth 为目标，这个final fermentation broth要黏度低，具有易分离的细胞质量( mass)，且影响终产物特性（specifications）的残余化合物少。培养基的灭菌方法应以对培养基组分或者参与的矿物质的最小程度的温度损害实现最大程度的杀死污染微生物。细菌内生孢子对于稳定培养基构成一个严重的问题，因为它们在超过100才能被杀死。在这些温度下，许多培养基组分是脆弱的（laible）而且会被破坏。在这种情况下，其他可采用的灭菌方法包括过滤或者射线照射。对于多数培养基，分批灭菌仍是所选择的方法，尽管连续灭菌已被广泛采纳。连续灭菌过程在超过120的温度下经过短时间处理可有效的杀死孢子，而对培养基养分不产生有害的影响。实际中，连续灭菌是通过给培养基中穿过一个热交换器来进行的，在那里（where）热交换器在短时间内升至所要求的高温度。接着培养基穿过一个线圈（holding coil），在这个温度下维持所预定的时间，最后通过反向循环的冷培养基的输入或者冷水迅速冷却。高温/瞬时灭菌过程提高了生长因子的保存时间且产生很少的颜色变化。热量的回收是额外的优点。直接通入蒸汽也被用来灭菌。4.5 仪器化（instrumentation）和生物反应器的过程控制所有的生命有机体都受到大范围的（a wide range of）细胞内和细胞外调控因子的作用，像温度、pH及O2。这些每个因子的鉴定和作用都源于传统的生理和生化研究。在所有的生物工程过程中，关键的是优化生产力。这只能依靠鉴别和控制这许多已知的调节有机体活性的因子来实现。控制生物活性的环境特征参数可以是物理的、化学的和生物化学的，而且不总是那么容易的辨别和处理（见表4.4）。生物反应器的仪器化对于控制特定参数、对它们进行记录、然后用这些信息提高和优化过程已经越来越重要了（表4.7）。实际中，过程控制的一种措施是利用传感器，它然后与固定值进行比较。这两项值之间的差异（discrepancy）用来改动对过程进行操作的激励器的位置，这样确保改动的值更接近于固定值。实现这种改动（measurement）与固定值进行比较的物理设备是控制器，而且通过这样的方式，由传感器、控制器和激励器组成的可以调节特定因子的控制环路就构成了。生物反应器控制措施可以以在线或者离线方式进行。对于在线控制，传感器直接安装在过程流（process stream）中，然而对于离线控制，一个样品从过程流中取出并进行分析。一种理想的传感器是经过蒸汽灭菌的、可产生可靠的连续的信号并且能进行在线操作。它应该容易进行标定、智能的而且对过程无影响。缺乏有效的用于控制的传感器是发酵技术发展中的一个主要的障碍（bottleneck）。在线控制的比较典型的传感器类型有那些用于温度、pH、压力、液体和气体流速、CO2及O2测定的传感器。完整的生物反应器过程仍由于缺乏能够对像DNA、RNA、酶及生物体这些重要的变量进行控制的可靠工具而受到严重限制。离线分析对这些化合物仍为重要，而由于这些分析结果常常在检样几小时后才可以利用，所以它们不能用来进行快速控制。一些已证明比较好的在线系统将通过某些未来的工程化在线控制技术来进行检验。4.6 控制技术温度 温度通过对反映速率的动力学作用和对酶活性和稳定的催化作用影响生物过程。有许多能调节生物反应器温度的传感器类型包括thermocouples, resistance thermometers, thermistors and capillaries.他们都是通过产生一个输出信号而发挥作用，这个信号用在控制环路中。大体积的生物反应器需要一些温度传感器以确保发酵体积中合理的温度分配。pH 大多数有机体的生长对于pH的变化是敏感的，每群有机体有特定的最优的pH值。产物形成的最佳pH值与生长最佳pH值不同。pH确信它主要影响细胞壁的通透性及有键合于细胞壁外的酶参与的反应速率。pH传感器或者离子-选择性电极在生物反应器中广泛应用。现代pH探头可以耐受蒸汽灭菌和某些高程度的处理。溶解氧 生物反应器中应用的多数有机体需要氧的连续供应。溶解氧（DO）探针测量过程中液体中溶解的氧的含量。有机体活性与溶解氧之间的关系常常作为多数生物工程过程最终成功与否的主要决定因素。有两种DO探头，原电池型和质谱型。设计上两者没多大的区别，每种探头都带有两个位于玻璃或者不锈钢中的电极。DO探头的最大的问题是它们应变慢而且在低DO浓度下非常不稳定。需要耗掉大量的时间而且不耐受反复的灭菌。生物反应器的摄氧速率可采用顺磁氧分析仪或者质谱仪来测定输入与输出气流氧的浓度而获得，质谱仪速度很快但是非常昂贵。溶解CO2 fermentation broth 中CO2的溶解水平提供了这个过程的大量的信息。膜包裹的酶电极现在用于溶解的CO2的测定，但它们昂贵而且不稳定。对气相CO2的测定可以采用spectrophotometric, 气相色谱或者质谱的方法。固定化酶探头 这些新一代的探头是将酶固定于靠近一种电化学传感器的表面上而制造出来的，常常是DO或者CO2探头。酶可以与一种特殊的分子反应产生能被电化学传感器检测的应答。酶电极原型样品反映了许多化合物包括葡萄糖、sucrose、urea、丙酮酸、青霉素、乙醇、乳酸盐、甲烷、胆固醇及一些氨基酸。这些酶电极是高度专一的，不受其他化合物的影响，容易校准且敏感性高。然而，它们应答时间长，不能进行蒸汽灭菌、难用于在线控制环路。但是，确定的是，酶探头的专一性与无限的应用空间使它成为未来发酵技术发展的一个令人振奋的领域。生物体 在现有成本基础上，还无法实现对生物体的在线自动分析。考虑采用基于氧气与二氧化碳物质平衡的间接方法。实际中，生物体包括蛋白质、DNA和RNA仍是耗时的离线测定。数据处理 从各种在线和离线处理获得的数据最初存储在笔记本或者记录表里，而现在常常存储在电脑或是磁带和磁盘中。一个特定的发酵过程的数据以文件的形式存储在电脑里，它实际上涵盖培养基的配制、发酵过程及复杂的下游处理过程。数据的存储和组织现在是多数工业发酵生产中一个主要的操作步骤。计算机已经成为一种有价值的、确实必不可少的了解和控制发酵过程的手段。这样，一个作用单元就可能包括过程调控、顺序控制、连续控制、计算、数据的储存、数据的供应与报告。计算机在生物技术中的进一步应用还包括核酸和蛋白质序列分析、限制性图谱的绘制、分子过程的加速及实验设计和调试。4.7 质量和能量传递在生物反应系统中，有机体的生长和代谢需要连续供应和摄入重要的养分，同时排除有毒的代谢废物。有机体表面和它的内环境之间发生的物质交换是我们所知道的质量转移。质量转移和相伴随的（concomitant）生长及有机体的生物活动只有向生物反应系统中供应或者从其中排除一定形式的能量才能进行。由此，灭菌和过程温度控制就需要热量，而对生物反应中物质的搅拌和混合就需要机械能：生物活动的结果是产生代谢能。质量和能量的传递过程是一切发酵过程的主要部分。促进（furtherance）对它们的理解对于扩大生物工程过程是非常重要的。控制质量和能量转移的原则来源于化学工程实践。质量传递 一切生物反应过程的中心是供给适量的养分以满足微生物代谢的需要，达到最适生长和产物形成。（倒装） 一种营养组分在从原料相（例如氧气鼓泡器、养分给料输入口）进入到微生物相的过程中，需要穿越一些障碍（resistances）。这些相将是连续的或是分散的。连续相常常是液体（水溶液或者非水溶液） 但也可以是气体的，而分散相可以是气体（空气、CO2、甲烷等等）、液体（碳水化合物）或者固体（微生物pellets、絮凝物、固定化细胞或者固体基质），质量传递的障碍位置如图4.5所示。在生物工程中应用的微生物大多是需氧微生物，因而在设计生物反应器时，氧的质量传递是一个重要的应当考虑的问题。气体与液体之间质量传递速率受气体组分在液体中溶解性的重要影响。不幸的是，氧只微溶于水，这就意味着要发展氧的分散技术以增大生物反应中氧对于微生物的可利用性。控制水溶液与气相中溶解的氧的方法已经得到了很好的发展而且认为同样适用于其他地方。kLa或溶氧浓度的测定对于获知过程中氧对于微生物的可利用性是重要的。采用orifice 产生气泡的方式将空气或者氧气导入到生物反应器中，气泡的大小与发酵液中它们上升的速度（velocity）一同决定了氧的传递速率。在没有机械搅拌的系统中，例如塔式反应器，气泡的直径决定了接触表面的区域及气泡上升的速度。相反的，在机械搅拌反应器中（CSTR），气泡的大小由bulk湍流程度及液体的物理性质而不是设计的orifice或鼓泡器而决定。液体的过度粘稠将反作用于氧的传递。发酵过程中，穿越固/液间阻碍的质量传递不受到整个系统水解动力学的严重影响。所有的传递过程都是经过分子渗透（diffusion）实现的，氧分（包括氧）渗入细胞的速率及细胞代谢物渗出细胞的速率将限制生物活动的速率。渗透过程一直伴随有反应的发生，像渗透分子的消耗与产生。需氧发酵可视为气/液间质量传递步骤、液/固间质量传递步骤及化学或生物化学反应步骤。混合作用对于气/液间质量传递步骤的影响大于液/固间质量传递步骤。随着生物反应体积的不断增大，要使生物反应中培养基组分达到完全一致的分散和混合也变得越来越更为复杂。分散于整个生物反应体积的机制涉及液体的bulk流动伴随着混合过程，通过经由机械搅拌或者液体湍流运动而产生的湍流eddies而进入来完成混合过程的。混合作用对于在半连续培养与连续培养中添加空气与养分尤为重要。混合作用的目的是优化axial and radial dispersion以确保完全保留所有生物反应部分中的发酵组分（培养基和微生物）。很少能够完全的保留这些组分，而且在大规模的发酵过程中，快速和近乎一致的（uniform）分散添加的组分要通过许多次输入至生物反应器的过程才能实现。利用甲醇为基质的大型ICI Pruteen 生物反应器涉及了2600个单独的entry points。当broth is non-Newtonian（牛顿型）且高黏度，就一直会有生物反应的部分体积是stagnant而且不能充分参与整体的发酵过程。当axial dispersion 近于零而radial dispersion为无限大（infinite）时，所谓的plug flow 生物反应就发生了。发酵broth的充分混合会产生良好的质量传递速率和随后高的生产力。实际中，在大多数工业发酵中，高的生产力必须paralleled通过降低操作成本以增大经济回报。传统的CSTR设计需要输入高能量（power），由此，许多新的生物反应器设计尝试降低特定的能量的摄入，且优化能量的输入与生产力。这些新型生物反应器中，某些可以在低的能量输入下提供大的接触面积（气泡柱等等），并且能够对用一个插入的通流管（环路反应）hold up的气体的流动形式进行有力的控制。能量传递 生物反应过程中能量由四种主要的来源而产生。（1） 机械搅拌能：电力的输入或者搅拌将会转化为液体运动的动能，其通过各种途径而消散最终以热量的形式体现出来。（2） gassing and 通气能量：某些能量在鼓泡器的洞口处消散，并产生湍流eddies，尽管许多这种类型的能量是当气体向上运动时，所受液体静压头减小而膨胀的结果。（3） 代谢能：生物反应中的微生物氧化有机物分子并且某些这样的能量以热量的形式消散。（4） Enthalpies：生物反应中可以产生热量如果在比生物反应器中的物质更高的温度下输入stream。在一个生物反应中产生热量就会引起发酵broth的温度超过最适的生产温度。因此，必须将热量从生物反应器中除去。跨越固体边界将热量排除到周围空气中或者内部线圈、外壳或者外部热交换器的冷水中。生物反应器的冷却系统的例子如图4.6所示。当生物反应器在超过ambient的温度下运行的时候，甚至允许通过上述机制产生热量，也要求热量维持一个最适的温度。4.8 放大多数发展的生物工程过程都是实验室规模的，商业化成功主要取决于将过程首先放大到pilot 植物水平而后是商业规模的能力。过程放大的成功实现必须遵守物理和经济规则。到现在为止，还没有建立起一个统一的设计程序或者一种简单的方法来进行过程放大。对于多数有着商业兴趣的产品，生产有机体（微生物、动物细胞等）将对生产进行优化，在限制某种养分的情况下或者根据不利的环境条件。微生物培养系统常常是异种的，而且过程中的问题主要来自养分的传递及小范围的来自产物的传递（图4.7）。通常可以采用实验室规模的生物反应器（5-10L）对某些控制因子进行鉴定，而另一些则需要pilot 规模的生物反应器。在从一种规模的操作转变到另一种规模的操作的过程中，某些方面将保持恒定（表4.8）；另一些则因规模增大的直接结果而发生变化（表4.8），而另一些则可以由工程人员进行控制。现实中的pilot plant 就是一个大规模的实验室，它能弹性的容纳仪器设备（生物反应器、泵、热交换器、储存设施、电的和piping 服务，等等） 并且适于过程操作。工程设计标准包括操作简便、经济且容纳空气和废水废物。每一种pilot plant都有各自的特点和设计要求。pilot plant 生物反应器的总体积由100到10000L，而且较大一些的pilot 生物反应器有时候被用作生产单元。完全工业化规模的生物反应器的体积范围是40000到400000L。当从实验室规模转到工业规模的时候，出现的主要问题有热量的排除、氧的传递及培养基中组分的可利用性与不充分的渗透，例如，养分、有毒代谢产物、酸或者碱。解决放大过程中出现的问题需要在混合和通气、调控设备及严格的保持无菌过程中投入大量的资本。4.9 固体基质发酵固体基质发酵是微生物在不含自由水和几乎不含自由水的固体物质上进行生长（表4.9）。固体基质发酵的最高阶段（例如，在明显的出现自由水之前）是吸收作用，由此含水量就由底物的类型决定。当一种底物的含水量约为12%的时候，生物活动停止进行，因此当靠近这个值的过程中，微生物活动被大大减缓（retarded）。固体基质发酵不是浆状物的发酵（像含有大量不溶性固体的液体）也不是在液体培养基中固体物质的发酵。固体基质发酵中最普遍应用的是cereal grains, legume seeds, 麦麸，木素纤维素物质像木头和秸秆以及许多其他植物和动物物质。这些化合物是不可变的多聚分子，不溶于水或微溶于水，但是便宜而且容易获得，是浓缩的养分原料。固体基质发酵有着悠久的历史，在东方已经进行了几百年。许多东方食品的发酵像酱油、日本豆面酱和豆豉，都包含重要的固体基阶段，而其他固体基质过程用来生产酶和化学物质像柠檬酸。在西半球，固体基质发酵主要以植物和动物垃圾、ensiling、蘑菇培养和奶酪的生产为中心。木素纤维素的固体基质发酵将会成为未来的重要工业，生产生物体、乙醇、甲烷和许多其他商业价值的产品。大多数基于微生物的生物工程产品可以通过固体基质发酵而生产。这种实际生产过程的决定因素取决于当于液体发酵相比时的经济性。在固体基质发酵下生长良好的微生物类型主要由水活度因子（aw）决定。底物的aw从数量上反映了进行微生物活动所要求的水分。（公式） 式中 = 形成的离子数，m = 溶液的摩尔浓度， = 摩尔渗透系数，而55.5 = 纯水溶液的摩尔浓度。纯水的aw = 1.00，aw随着溶液的加入而下降。发现细胞的aw值大多较高，而某些真菌和少数酵母在值为0.6-0.7间进行生长。在低aw水平下能够耐受和繁殖的微生物总体上是出现在固体基质发酵中的主要微生物。微生物类型 固体基质发酵以多种不同的形式进行，取决于应用的微生物是本地生长的，还是纯培养物或者是混合培养物。应用本地生长的微生物区系进行的发酵主要是ensiling and composting。Ensiling是涉及农作物的厌氧过程，而且在25-30下进行1-2周。Lactobacillus bulgarius 是主要的微生物，生产乳酸，随后抑制潜在的引起腐烂的细菌，而且由于没有氧气，厌氧霉菌无法生长。50-65%的湿度是关键的，这样保证耐渗透的乳酸杆菌是活跃的并且占主导地位。相反的，composting 涉及从嗜温细菌、酵母和霉菌到thermophilic actinomycetes及真菌的一系列微生物。生物活动产生的热量是一个严重的问题，compost应该转为避免进行灭菌。蘑菇生产的Composting是最为成功的创造性的应用木素纤维素物质的手段之一。利用真菌的纯培养物进行的固体基质发酵最好的说明是用真菌Aspergillus oryzae发酵谷物和黄豆这个古老的Koji过程。于煮过的基质上接种A. oryzae，并在trays 窄层中进行生长或者在一种特殊的旋转生物反应器中生长以生产出淀粉酶和蛋白酶分解基质中的多聚物分子。Koji过程是其他类型发酵的基础包括商品酶的生产、有机酸和乙醇。Koji过程也正在寻求新的应用以从淀粉类物质（Raimbault/Alazard process）和纤维素类物质（Waterloo process）生产生物体。某些固体基质发酵能够巧妙的利用混合培养物接种以实现优化的终产物形成。这样利用Chaetomium cellulolyticum and Candiada lipolytica的混合培养物而不是单独应用其中一种真菌，就能将秸秆有效的转化为真菌。认为这种发酵对于木素纤维素物质的低技术转化有巨大的潜力。许多固体基质发酵的一个特征是需要对原料进行预处理以提高养分的可利用性，或者减小微粒的大小来优化发酵过程的物理参数。多聚物分子要进行部分水解以利于微生物的生长，而通过大量形式的物理处理而获得适宜的微粒大小，例如ball milling。预处理的成本要与产品的价值相平衡。固体基质发酵过程的设计进一步受到创建良好的质量和热量传递特点的需求的控制。微粒间的质量传递和微粒内部的渗透是限制固体基质发酵的两种主要的质量传递步骤。微粒间的质量传递 在固体基质发酵过程中，微粒的大小决定基质中可被空气占据的空间的数量（有效空间）。多数发酵应用的是厌氧微生物并且把氧运送到有效空间是控制着顺利进行生长和产物形成的关键参数。氧传递到有效空间与湿度水平密切相关，由于受赶出空气影响的高的自由湿度水平确保了低的有效空间。实际中，令人满意的微粒间氧的传递 通过小心的混合和通气来实现。基质中氧的水平可以进行调控，当需要的时候就进行混合和通气。在有效空间中防止CO2的形成也是关键的。微粒内的质量传递 微粒内的质量传递涉及发酵基质中养分和酶的传递过程。在利用真菌进行的固体基质发酵过程中，菌丝在渗入到基质中的同时也在微粒表面进行生长。厌氧菌丝需要氧的渗入以支持它们的连续生长。氧在这些复杂的固体基质载体上的渗入动力学机制还远远无法被了解。微粒内的质量传递还涉及将不溶于水的多聚物水解为能被生长的真菌利用的可溶性物质过程中酶的作用。因此这些水解酶在基质的降解和利用中有着重要的作用。有着开放的、空隙（porous）结构的基质比那些有着较少空隙表面的基质更容易被降解。纤维素类物质酶的水解已经用固体基质系统进行密集的研究，而且已经表明依赖酶复合物纤维素酶的作用，包括三种类型的反