叶绿体色素含量的测定.doc

叶绿体色素含量的测定 -分光光度法中文摘要：本实验利用菠菜叶作为原料用80%的丙酮提取叶绿体色素，应用分光光度计在某一特定波长下所测定的吸光度，带入公式计算出色素溶液中各色素浓度。英文摘要：In this experiment , we used spinach leaves as raw material and used 80% of acetone to extract pigments from them ,and apply spectrophotometer at a particular wavelength to determine absorbance, then take the absorbance into the formula to calculate concentration of each pigment.实验原理：利用80%丙酮提取叶绿体色素，叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素最大吸收峰的波长分别是663nm、646nm和470nm。根据分光光度计测定的吸光度值，可以计算出丙酮提取液中叶绿体色素含量。实验目的：掌握分光光度法对叶绿素a、叶绿素b、叶绿素总浓度和类胡萝卜素总浓度测定和计算的方法。实验器材和试剂：1、材料：菠菜叶片2、 用具：分光光度计、天平、研钵、漏斗、剪刀、容量瓶、烧杯、滤纸、滴管等3、试剂：80%丙酮、石英砂和碳酸钙实验步骤：1.叶绿体色素的提取取新鲜菠菜叶片0.5克,擦干,去中脉,剪碎放入研钵;加入少许石英砂和CaCO3,再加入80%丙酮3ml,研磨成匀浆,再加80%丙酮10ml,静置10分钟;用漏斗滤去残渣,用丙酮反复冲洗研钵、残渣至无色;用容量瓶定容至50ml 。2.吸光度的测定取光径1cm比色杯，注入上述叶绿素提取液,以80%丙酮注入另一同样的比色杯内作为空白对照,在波长663、646和470nm下测定吸光度。3.结果计算依据下列丙酮提取液中色素浓度计算公式,分别计算出叶绿素a、b的浓度及其叶绿素总浓度和类胡萝卜素的浓度。计算公式80%丙酮提取液中色素浓度的计算Ca（叶绿素a）=12.2A663-2.81A646Cb（叶绿素b）=20.13A646-5.03A663CT（叶绿素）=Ca+Cb=17.32A646+7.18A663Cx.c（类胡萝卜素）=(1000A470-3.27Ca-104Cb)/229叶绿体色素含量=实验结果：波长吸光度平均值663nm0.8190.8160.8170.817646nm0.4140.4240.4210.420470nm0.8280.8460.8470.840Ca（叶绿素a）=12.20.817-2.810.420=8.7872mg/LCb（叶绿素b）=20.130.420-5.030.817=4.3451mg/LCT（叶绿素）=Ca+Cb=13.1323mg/LCx.c（类胡萝卜素）=(10000.840-3.278.7872-1044.3451)/229=1.5693mg/LCa（叶绿素a）含量=8.7872mg/L0.05L1/0.5g=0.8787=87.87mg/gCb（叶绿素b）含量=4.3451mg/L0.05L1/0.5g=0.4345=43.45mg/gCx.c（类胡萝卜素）含量=1.5693mg/L0.05L1/0.5g=0.1569=15.69mg/g实验讨论：1. 叶绿素a、b在蓝色区也有吸收峰，能否用这一吸收峰波长进行叶绿素的定量分析？为什么？定量分析的吸收峰必须要稳定，还要有强的吸收。另外，还需要考虑干扰的问题。光合色素除了叶绿素外还有类胡萝卜素，类胡萝卜素主要吸收蓝光，为了排除干扰，要选用红光。2为什么提取叶绿素时干材料一定要用80%的丙酮，而新鲜的材料可以用无水丙酮提取？在植物缺水时，植物体中的叶绿素含量会降低。干材料与新鲜材料相比水分含量较少，用无水丙酮提取不如80%丙酮下提取效果好。叶绿素的提取除了丙酮也可以用其他的提取试剂，石油醚乙醇、乙醚乙醇、乙醚。从菠菜叶中提取叶绿体色素时，用丙酮研磨法提取叶绿素的效率比石油醚乙醇萃取法高，乙醚研磨法提取叶绿素的效果明显不如丙酮，用石油醚研磨法的效果最次，这表明最佳的提取剂为丙酮，其次为石油醚一乙醇。但用混合溶剂提取的叶绿素的纯度要比用单一溶剂提取的高，生产中可根据实际需求进行合理选用。不同有机溶剂用直接浸提法和Arnon法从菠菜叶片中提取叶绿素的效率不同。有人做过此类提取实验，结果表明,用丙酮、乙醇浸提法提取叶绿素的效率比丙酮、乙醇Arnon法高,甲醇、乙醚浸提法提取叶绿素的效果明显不如丙酮-乙