双向电泳小资料.doc

生命科学领域发生的革命性变化，对生命活动的研究正在从传统的还原式研究转向了整体性的研究以基因组学（功能基因组学）和蛋白质组学为基础的系统生物学。其中蛋白质组学包括表达蛋白质组学（expression proteomics）、结构蛋白质组学（structural proteomics）和功能基因组学(functional proteomics)。而双向电泳则是蛋白质组学，尤其是表达蛋白质组学的经典方法。 由于双向电泳对于许多研究人员来说是个陌生的技术，所以一旦在电泳染色后出现费解的电泳图是件令人头痛的事：不知道问题出现在哪，也不知道如何去改正。这里来自GE公司的专家列出了几种常见出错电泳图，虽然不是非常全面，但是如果您也在实验中遇到了这样的问题，希望能从这里得到参考。首先，来看看漂亮的2D电泳图问题1. 氨基甲酰化（Carbamylation trains）导致太多蛋白斑点串，不属于常规的磷酸化等修饰可能原因：尿素（urea）不纯建议：用更纯的尿素，避免样品加热，或者用Amberlite IRN-150L去异氰酸盐（isocyanate）问题2. 蛋白样品制备步骤错误导致蛋白丢失可能原因：样品制备TCA/丙酮沉淀后用预冷的丙酮洗涤沉淀，导致TCA残留建议：用90%丙酮/10%H2O洗涤,可以彻底洗去TCA问题3.不同的样品制备步骤导致完全不同的蛋白斑点图谱 对于样品制备而言，没有一个固定的方法，更多的时候要根据样品的特性，以及一些文献的参考进行优化，下面是一个植物样品的例子：若采用常规的标准裂解液，样品溶解不充分用甲醇沉淀后复溶，效果也不明显TCA/丙酮沉淀较适合这一样品4.正常情况正常情况，右边的垂直条带包含了所有pIs值pH7的蛋白。问题5. 样品含高丰度蛋白导致出现水平条带可能原因：高丰度蛋白聚集后，若采用胶面朝下的胶条槽，易造成水平条带。建议：采用杯上样胶条槽或manifold等胶面朝上的胶条槽。问题6. 出现水平条带（窄pH范围胶条）可能原因：聚焦不够，或者盐离子过多造成水平条带的其它原因：1. Detergent去污剂浓度过低 2. 尿素浓度过低 3. DTT浓度过低，或者用量过少 4. 上样位置不合适（比如cup loading） 5. 蛋白酶活性 6. 胶条溶胀时间过短 7. 样品中含有不溶的蛋白(centrifuge 1 hr / 40,000 g) 8. 空气中的CO2问题7. 试剂不新鲜可能原因：TEMED不新鲜。建议：尽管TEMED用量很少，还是建议每年更换一瓶TEMED。问题8.试剂质量影响蛋白斑点成像可能原因：Tris质量不好问题9. 步骤错误导致蛋白丢失可能原因：蛋白转移电压过高（400V，18cm胶）在开始的45分钟内不要超过2W/gel（Ettan size）问题10. 植物样品制备可能原因：多糖未去除干净，被考马氏亮蓝染色建议：样品用clean-up处理问题11. 蛋白斑点出现垂直条带可能原因：平衡过程中DTT不足，导致一些蛋白出现垂直条带。问题12 样品中含盐等离子过高可能原因：样品中含盐等离子杂质过高，导致等电聚焦失败。建议：避免过多盐，需除盐，如在洗细胞时要把PBS在离心后彻底移除，或在最后一步清洗时采用250mM蔗糖/10mM Tris 洗细胞。问题13 pH611的胶条Rehydration Loading Cup loading建议：对于碱性pH范围胶条，用杯上样效果更好问题14 保存第二向凝胶时温度太低可能原因：保存第二向凝胶时温度太低， SDS有沉淀建议：长时间保存（2days - 2weeks）在48oC， 在二向进行前应提前把凝胶取出，室温放置。如有更多问题，欢迎到生物通bbs讨论。（以上胶片由GE Healthcare专家提供）生物通新技术专栏之蛋白质组学技术专题 开篇之际，首先来看看这两句话：“在制备中丢失的蛋白是永远不可能在后面的实验中弥补回来的”，“让我们把蛋白质看作是具有独特而奇妙性质的实体”。 在直击蛋白质组学研究技术全过程 一文中就提到过，目前蛋白质组学研究主要是两条互补的实验工作流程基于凝胶的工作流程（Gel-based workflow）和基于液相色谱的工作流程（LC-based workflow）。其中对于前者而言，双向电泳技术是核心，而这核心中的核心就是电泳的第一步：蛋白样品制备。这是因为不像双向电泳的其它过程有仪器，有大致相似的操作程序，蛋白样品由于其结构特性各异，又必须使其完全溶解和尽可能少的化学修饰，所以不可能有一个通用的技术，只能通过大量的实验来积累经验。正如开篇所引用的两句话中包含的深意：在研究蛋白的过程中，既需要严谨的技术流程，规范的操作手段来确保蛋白研究的完整性，也需要将其看成是独特而奇妙的个体，结合以往经验但又不拘泥于经验，才能真正揭开她神秘的面纱。为什么要进行样品制备 “为什么要进行样品制备？电泳的目的不就是分离吗？”刚接触双向电泳的小菜鸟有可能就会这么问。这个问题很好回答，这是由于目前双向电泳一般只能分辨到1000-3000个蛋白质点(spot)，而样品中的蛋白种类可达到10万种以上，因此样品的制备是必须的。另外比如像对临床组织样本进行研究，寻找疾病标记的蛋白质组学研究目的，由于临床样本都是各种细胞或组织混杂，而且状态不一，如肿瘤组织中，发生癌变的往往是上皮类细胞，而这类细胞在肿瘤中总是与血管、基质细胞等混杂。所以常规采用的癌和癌旁组织或肿瘤与正常组织进行差异比较，实际上是多种细胞甚至组织蛋白质组混合物的比较，而蛋白质组研究的通常是单一的细胞类型，因此需要进行有效的样品制备。 但是为什么要进行不同步骤的样品制备呢？这不仅仅是由于蛋白本身不同，所以需要不同方法来配合，而且在制备样品的时候，首先需要明确的是什么是实验的最终目的：是分离尽可能多的蛋白还是分离样品中某些感兴趣的蛋白，这些直接决定了你的制备方法，也决定了实验的成功与否。由于想要分离的蛋白必须是完全溶解的，溶解的效果取决于裂解、破碎、沉淀、溶解的过程以及去污剂的选择和各种溶液的组成，因此如果是只对样品中的一部分蛋白感兴趣，可采取预分离的方法，如欲分析的蛋白来自细胞器（细胞核、线粒体和原生质膜），则应先采取超速离心或其他方法将细胞器分离出来再溶解蛋白；如果是希望分离出尽可能多的蛋白，比如进行全蛋白质组分析，则可以将细胞或组织中的蛋白分成几部分，分级制备。样品制备的原则1. 应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括多数疏水性蛋白），且制备方法应具有可重现性。2. 防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。3. 防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰（如酶性或化学性降解等）。4. 完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。5. 尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证待研究蛋白的可检测性。 以上这五项原则是根据北大人类疾病研究中心讲座内容改编而来，基本上可以说是囊括了样品制备过程中的抽象注意事项，之后还会提到具体的注意事项。样品制备流程 蛋白样品制备过程简而言之就是三步：破碎、沉淀蛋白和去除杂质。虽然说出来不过寥寥的十个字，但是这几个过程经过这么多年，还没有那位研究人员可以说自己已经完全掌握，面对任何蛋白制备手到擒来。破碎最小限度的减少蛋白水解和其它形式的蛋白降解原则 样品制备的第一步当然是细胞或者其它样品的破碎，这一步看似简单，但是操作中一旦方法不当，就有可能会丢失样品中的蛋白和导致蛋白被修饰。要想毫发无损的通过这一关，首先就要分析样品的来源，是易碎的细胞还是坚硬的组织？是植物细胞还是真菌？要做到有的放矢，才能事半功倍。 破碎的方法有许多种，包括循环冻融法、渗透法、去污剂法、酶裂解法、超声波法、高压法、液氮研磨法、机械匀浆法和玻璃珠破碎法等（可以归纳为机械法、化学法和物理法），这些方法有不同的应用范围，但基本的原则都是要以最小的限度减少蛋白水解和其它形式的蛋白降解，这也就是在样品制备破碎这一步的关键所在。 就这些方法具体而言，选择的时候如果是较易破碎的细胞组织，就可以采用渗透法，这种方法十分温和，适用于血细胞和组织培养细胞。而对于细菌细胞，则可以采用冻融法，利用液氮一次或者多次反复冻融来裂解细胞。去污剂法适用于组织培养细胞，将样品悬浮于含有去污剂的裂解液中，可以溶解细胞膜释放内含物，如果裂解液中含有SDS，为了不干扰等电聚焦，可以将裂解的样品用含有过量的非离子或者两性离子去污剂的溶液稀释，或用丙酮沉淀法去除SDS。另外酶裂解法适用于植物组织、细菌和真菌细胞。 除了这几种较温和的方法，一些较剧烈的方法也有自己的适用范围，如超声波法适用于细胞悬浮液，高压法常用于有细胞壁的微生物，研磨法适用于微生物和组织，而机械匀浆法是机体软组织破碎最常用的方法之一，玻璃珠破碎法则用于细胞悬浮液和微生物的破碎。 为了确保在这些方法过程中减少热量的产生，可以在低温（冰浴或者液氮）下操作，并且由于在破碎过程中会产生蛋白酶，使蛋白水解，因此也要注意在含有蛋白酶抑制剂的裂解液中进行。沉淀蛋白 可溶性是关键 一般而言，在破碎样品获得蛋白之后常常需要通过蛋白沉淀去除干扰物质和浓缩样品，在这个步骤中重点是要获得可以重新溶解的蛋白，因此对所研究的具体蛋白的特性需要有详细的掌握，这也是体现研究人员工作能力的“check points”。常见的蛋白沉淀方法有以下几种：沉淀方法原理方法优点缺点硫酸铵沉淀法高盐浓度的缓冲液促进蛋白聚合沉淀在蛋白终浓度大于1mg/mL并含有EDTA的缓冲液（50mmol/L）将硫酸铵加至饱和，搅拌10-30分钟，离心分离预分离不能得到全部蛋白，并且残留的硫酸铵和核酸会影响等电聚焦三氯醋酸（TCA）沉淀法在蛋白溶液中加入TCA，使其终浓度为10%-20%，冰浴30分钟。被沉淀的蛋白难再溶解，并且长时间将样品置于这种低pH溶液中会引起蛋白降解和修饰丙酮沉淀法在蛋白溶液中加入3倍体积的预冷丙酮，20沉淀2小时，离心收集蛋白。TCA-丙酮沉淀法用含20mmol/L DTT或0.07%-巯基乙醇的10%TCA溶液20沉淀45分钟以上，离心收集，再用20mmol/L DTT 0.07%-巯基乙醇清洗，空气（冷冻）干燥。双向电泳常用方法醋酸铵沉淀法用醋酸铵的甲醇溶液沉淀，再用酚抽提，0.1mol/L甲醇清洗，再用丙酮清洗。适用含有大量干扰物质的植物样品步骤繁琐去除杂质 关键是尽量不丢失蛋白和减少蛋白修饰 在样品中常常会含有像核酸、多糖、去污剂和代谢物等非蛋白质杂质，需要去除，否则会影响双向电泳的结果，这个过程有时会造成蛋白的丢失以及蛋白的化学修饰和解聚，特别是后者会导致双向电泳图谱中蛋白点的增多（由于电荷的改变），所以操作中要多加注意。1. 核酸的清除 对电泳的影响：增加样品粘度、与蛋白质形成复合物后会出现假象迁移和条纹。 解决的方法：用适量纯的不含蛋白酶的核酸内切酶进行降解，或是利用合成载体两性电解质（SCA）同核酸结合形成复合物的能力，再通过超速离心来去除复合物。2. 多糖的清除 对电泳的影响：带负电的多糖会与蛋白形成复合物，导致拖尾和影响聚焦。 解决的方法：利用超离心和高pH，高离子强度，和TCA等沉淀法。3. 去污剂的清除 对电泳的影响：SDS能与蛋白形成带负电的复合物，对等电聚焦影响大，需要清除。 解决的方法：用含载体两性电解质或两性离子去污剂（CHAPS、Triton X-100或NP-40）的溶胀液稀释，或者丙酮沉淀法。4. 盐离子和外源带电小分子的清除 对电泳的影响：样品中的盐会增加凝胶条的电导，使其无法达到设置的电要，从而影响蛋白质聚焦，带电小分子会引起水的流动，使胶条的一端肿胀而另一端变干，导致两端的酸、碱性蛋白无法聚焦，造成拖尾或丢失。 解决的方法：常用透析去除盐成分，TCA-丙酮沉淀法可以清除小分子。样品制备注意事项1. 蛋白质水解 当细胞破碎的时候，蛋白水解酶就会被释放出来或被激活，使双向电泳结果复杂化，影响最终结果分析。为了避免这些情况的出现，建议在样品制备时尽可能在低温下进行。此外，许多蛋白酶在pH9以上就失活了，因此Tris碱，碳酸钠或碱性载体两性电解质往往能抑制蛋白水解。但是有些蛋白酶在上述条件下仍然保持着活性，此时应当使用蛋白酶抑制剂。每一种蛋白酶抑制剂只对某一类蛋白酶起作用，因此建议复合使用蛋白酶抑制剂，如广谱蛋白酶抑制剂“鸡尾酒”，见下表（来自蛋白质电泳实验技术）。蛋白酶抑制剂有效抑制的酶PMSF(Pheylmethylsulfonyl fluoride)是很常见的抑制剂，使用浓度为1mmol/L不可逆抑制丝氨酸水解酶和一些半胱氨酸水解酶。AEBSF 丝氨酸抑制剂，使用浓度为4mmol/LAEBSF的抑制活性与PMSF相近，但它更易溶于水而且毒性低EDTA，EGTA，使用浓度为1mmol/L通过鳌合蛋白酶维持活性所必需的金属离子来抑制金属蛋白酶。多肽蛋白酶抑制剂，使用浓度为2-20ug/ml亮肽素（Leupeptin）能抑制多种丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶；抑肽素（pepstatin）抑制天冬氨酸蛋白酶；抑肽酶（aprotinin）能抑制许多丝氨酸蛋白酶；苯丁抑制剂（bestatin）能抑制氨基酸多肽酶TLCk，TPCK，使用浓度为0.1-0.5mmol/L不可逆的抑制丝氨酸和半胱氨酸的蛋白酶苄脒（Benzamidine）使用浓度为1-3mmol/L抑制丝氨酸蛋白酶2. 特殊样品的制备 低丰度蛋白的分离：尽管增加上样量和提高总蛋白的溶解度能增加分离时的低丰度蛋白的量，但同时增加了高丰度蛋白的负荷，且造成蛋白的叠加效应而影响分离。现常用预分级窄pH胶的微制备技术进行分离：即将总蛋白组分成蛋白质组亚群，再用pH梯度小于2个pH单位的IPG胶进行窄pH范围的分离。 强碱性蛋白质（如核糖体 ）的处理：先将蛋白预处理以富集，再用特殊pH梯度的IPG胶条（如pH312、4-12或10-12）进行等电聚焦。其中窄范围碱性IPG胶（如pH10-12）的挑战是克服反向、阴极向阳极、电渗流和水平条纹模式，而宽范围的碱性IPG胶（如pH3-12、4-12）等消除了窄范围胶所需要的专门水化液。 极端分子量的蛋白质：小于8kD和大于200kD的蛋白在常规IPG-2D上不易看到，这可能是在Tris/glycine缓冲液中，样品和游离的dodelcyl sulfate ions持续积累浓缩，与小分子量的蛋白质发生对流混合，产生茸毛状的或模糊的带，从而降低小蛋白的分辨率；在胶底端，高浓度的十二磺酸使蛋白固定致染色困难。至于高分子量蛋白少的原因可能是在变性条件下，蛋白质复合物变成了多肽，或者可能是大分子。 除了以上这些，在纯化和浓缩了蛋白样品之后，许多研究人员就会直接进行电泳了，但实际上还有一个重要的步骤不容忽视，那就是定量，这对于蛋白表达量的研究尤为重要。（生物通：张迪）双向电泳可不是一件容易的差事，花银子花时间不说，结果还很难重复。想要搞定双向电泳，关键在于建立一套有效、可重复的样品制备方法。方法是多种多样的，不过都基本遵循以下的原则：1.样品缓冲液中离子浓度的控制2.溶解包括疏水蛋白在内的所有蛋白质3.防止聚焦过程中已溶解蛋白质的聚焦和析出4.防止样品制备过程中及其后蛋白样品的酶或化学降解等的修饰反应5.去除或完全降解核酸及其他干扰分子6.去除高丰度或不相关的蛋白质，提高低丰度蛋白的浓度，使其达到检测要求提高分辨率和确保重复性是双向电泳实验最重要的两个目标。蛋白样品制备在实现这两个目标的过程中起到了核心作用。Bio-Rad公司的ReadyPrep试剂盒通过试剂增溶或差异溶解来减少脱尾或降低样品复杂性，从而成为用户可靠的实验工具。ReadyPrep 产品线包含一系列2-D 样品制备试剂盒，不仅适用于通用样品（总蛋白）处理，而且可以将复杂样品按特定方法分级。处理通用样品的试剂盒包括总蛋白抽提和蛋白净化（clean-up）。样品分级试剂盒可用来降低样品复杂程度，同时有助于低丰度蛋白的富集和鉴定。这类试剂盒又分为两种，一种是基于蛋白不同的亚细胞定位来分离，另一种是对细胞总蛋白进行分级，从而适合于总蛋白质组分析。从血清或血浆中提取的低丰度蛋白经常会受到白蛋白和IgG的干扰。白蛋白在血清总蛋白中的含量约为60-70%，IgG虽小，也不可轻视，占了总蛋白的约10-20%。这两种蛋白异军突起，常常掩盖了其它类似大小的蛋白，使我们无视低丰度蛋白的存在，也降低了双向电泳的分辨率。因此，在分析目的蛋白之前，我们一定要先干掉白蛋白和IgG这两个家伙。样品中的核酸会对等电聚焦的结果产生干扰：DNA复合物在变性条件下发生解离而使溶液的粘稠度增加，可阻碍蛋白质进入IPG胶条，并减慢蛋白质在胶条中的移动速度。DNA也会与样品中的某些蛋白质结合，出现人工假象和条纹。具体的解决方案如下：去除盐分、去垢剂、脂类、酚类ReadyPrep 2-D 净化试剂盒ReadyPrep 2-D 净化试剂盒可去除蛋白样品中的去垢剂、盐分、小肽、脂类和酚类化合物。这些物质会干扰双向电泳。本试剂盒含有不受去垢剂、离液剂或其它实验中常用试剂干扰的沉淀试剂，可充分沉淀样品蛋白，并保证了蛋白样品的回收效率和浓度。 去除白蛋白Aurum AffiGel 蓝胶小型试剂盒和层析柱通过亲和层析，AffiGel 蓝胶能去除血清和血浆中90%的白蛋白。去除白蛋白/IgGAurum 血清蛋白Mini试剂盒Aurum 血清蛋白Mini试剂盒包含了Micro Bio-Spin层析柱，其中填充了Affi-Gel 蓝胶和Affi-Gel Protein A填料。这两种树脂混合物能同时选择性地结合白蛋白和IgG，处理过的样品无需额外纯化，就能立即用于2D的分析。一次纯化就能搞定两个东西，操作步骤减少了，效率也提高了。去除DNA最简单的方法就是酶解。当样品用高pH溶液裂解后，在溶液中加入核酸内切酶，既能有效降解核酸，又能使内源性蛋白酶的活性最低。也可以在冰浴环境中，通过超声处理的方法将大片段的核酸打断成小片段后，直接进行双向电泳。总蛋白抽提ReadyPrep 蛋白抽提试剂盒 (总蛋白) ReadyPrep 蛋白抽提试剂盒 (总蛋白) 是一种操作简单、快捷、重复性好的试剂盒，用来抽提适合于双向电泳的细胞全蛋白。试剂盒中离液性超强的抽提溶液含有兼性去垢剂ASB-14，从而使该溶液能溶解各种细胞的全蛋白。根据亚细胞定位分步抽提ReadyPrep蛋白抽提试剂盒 (膜I)本试剂盒是利用Triton X-114在一定温度下可与水相分层的原理将蛋白分离。经过最后一步的离心步骤，溶液被分级成上层的水相和下层的高去垢剂相。此外还有一些难溶的沉淀，这些沉淀主要是更加复杂的膜蛋白。进入上下两相的蛋白再用ReadyPrep 2-D 净化试剂盒(含在本试剂盒中)净化，以去除抽提过程中混入的可能干扰IEF的物质。ReadyPrep蛋白抽提试剂盒 (膜II)膜II试剂盒做为其它膜蛋白分离试剂盒的补充，是专门为有效分离较为复杂的膜蛋白而优化的。抽提的过程用到了碳酸钠和超速离心机。试剂盒中的2-D水化/上样缓冲液含有强离液性的兼性去垢剂ASB-14。ReadyPrep 蛋白抽提试剂盒(信号)绝大多数细胞的胞浆膜都有富含神经鞘磷脂和胆固醇的微区域（酯筏）。与这些脂筏相联系的蛋白往往是参与物质跨膜转运或信号转导的蛋白质。这类蛋白包括GPI锚订蛋白、caveolin、caveolae (caveolin-associated proteins)、酰化酪氨酸激酶、G蛋白异三聚体，以及一些含跨膜结构域的蛋白 (Simons and Ikonen 1997, Brown and Rose 1992, Parton and Simons 1995, Anderson et al. 1992) 。与胞膜当中这些富含酯类的微区域相结合的蛋白质在4C Triton X-100的溶液中难溶。ReadyPrep 蛋白抽提试剂盒(信号) 利用这一原理将信号蛋白有选择性地加以回收。ReadyPrep蛋白抽提试剂盒(胞浆/核)ReadyPrep蛋白抽提试剂盒(胞浆/核)使用一种专门配制的缓冲液和差速离心将细胞核完整地分离出来(Dignam et al. 1983, Zerivitz and Akusjarvi 1989)。本试剂盒包含一种强离液性的缓冲液，可有效溶解膜蛋白，并可直接用于双向电泳分离。如要对胞浆组分进行分析可以将蛋白样品先用试剂盒中带的ReadyPrep 2-D 净化试剂盒处理。根据不同的溶解度分步抽提ReadyPrep 顺序抽提试剂盒ReadyPrep 顺序抽提试剂盒是为全蛋白质组分析而设计的。本试剂盒将初始蛋白样品根据溶解性的不同分成三个组分。当蛋白的亚细胞定位不能确定时，本试剂盒还可以用来搜寻特定的蛋白。 依照溶液溶蛋白能力的增加将蛋白样品进行顺序抽提可以溶解更多的蛋白，从而使蛋白质组的信息更全面。ReadyPrep 蛋白抽提试剂盒 (可溶/不可溶)ReadyPrep 蛋白抽提试剂盒 (可溶/不可溶) 可将细胞全部蛋白分为两个组分以亲水性蛋白为主的可溶性组分和以疏水性蛋白为主的不可溶组分。这种简单的分级方法可有效降低样品的复杂性，提高低丰度蛋白的检测效率，从而在总体上改善总蛋白质组的分离效果。保持蛋白的还原状态ReadyPrep还原/烷化试剂盒ReadyPrep还原/烷化试剂盒首先将半胱氨酸残基之间的二硫键还原，然后将还原出来的巯基烷化，使得这些基团永久保持还原状态。这样做有助于防止假蛋白点的出现并能让IPG胶条中更多的蛋白质转移到第二向的SDS-PAGE胶中。本试剂盒对分析碱性蛋白质特别有效。因为胶条碱性部位的DTT容易电离，在电场作用下迁移出IPG胶条，从而使胶条中DTT减少，蛋白质二硫键重新形成。绝大多数生物含有较多数量的碱性蛋白，这类蛋白的pI值高于pH 7。要想得到好的双向电泳结果，绝大多数样品都需要通过多次实验才能摸索到最适宜的条件。所以革命尚未成功，同学仍需努力！1。我在提取组织的裂解液里已经加了2%的两性电解质，如果在水化液再加的话聚焦时电压就很难升到目标电压，一般只能升到一半，请问各位高手水化液不加两性电解质可以吗？样品中原有的两性电解质在聚焦时应该还会起作用的吧？2。聚焦后胶条两端靠近电极处的几厘米会比中间薄很多，但是颜色没有变，这是什么原因呢？是烧焦了吗？谢谢大家！ ajkzw wrote:1。我在提取组织的裂解液里已经加了2%的两性电解质，如果在水化液再加的话聚焦时电压就很难升到目标电压，一般只能升到一半，请问各位高手水化液不加两性电解质可以吗？样品中原有的两性电解质在聚焦时应该还会起作用的吧？2。聚焦后胶条两端靠近电极处的几厘米会比中间薄很多，但是颜色没有变，这是什么原因呢？是烧焦了吗？谢谢大家！两性电解质的作用是形成连续的pH梯度，使蛋白在泳动到等电点时便停止。合适的两性电解质浓度，会在聚焦初期的1-2个小时很快在胶条内形成pH梯度。如果两性电解质浓度低，形成的pH梯度不充分，会出现聚焦不完全的的结果。相反，两性电解质浓度过高，会使形成的pH梯度得时间延长，影响蛋白的聚焦，升压速度变慢的等等。通常，2%的浓度已经是上限了。一般保证终浓度在0.5-2%的范围内。建议你可以试试1%，甚至更低的浓度。此外，胶条中间厚，两端薄不是烧胶。而是你的蛋白和其他一些物质由聚焦前的均匀分布，变成聚焦后的定向分布。胶条两端一般没有蛋白和两性电解质等物质的聚集，因此略有些薄是合理的。但如果厚度不均的现象非常明显，就不正常了。祝实验顺利。 谢谢DIGE，因为我的模型很难做，所有的模型都是按这个条件取材的，不可能重新再做了，还有两个问题想请教，你说的2是w/还是/呢？即使水化液不加两性电解质，原来样品中的两性电解质在聚焦的时候是不是也会起作用呢？ 非常感谢！ ajkzw wrote:。还有两个问题想请教，你说的2是w/还是/呢？即使水化液不加两性电解质，原来样品中的两性电解质在聚焦的时候是不是也会起作用呢？ 非常感谢！2是/。而且是指上样总体积的0.5-2。此外，原来样品中的两性电解质在聚焦的时候是会起作用，但问题在于，你的样品体积很小，而水化液的体积较大。当样品被水化液后，两性电解质的浓度大大降低，肯定远远小于2了。 哦，那水化液再加点就可以了，十分感谢！ “两性电解质的作用是形成连续的pH梯度，使蛋白在泳动到等电点时便停止。合适的两性电解质浓度，会在聚焦初期的1-2个小时很快在胶条内形成pH梯度。如果两性电解质浓度低，形成的pH梯度不充分，会出现聚焦不完全的的结果。相反，两性电解质浓度过高，会使形成的pH梯度得时间延长，影响蛋白的聚焦，升压速度变慢的等等。”DIGE，恕我孤陋，第一次听说两性电解质还有这样的作用，可有出处？两性电解质是如何形成连续的PH梯度的呢？如果不加，等电聚焦是不是无法完成？那么我们的IPG胶条又起到什么作用呢，它不是固相化的PH梯度胶条吗，难道它必须借助两性电解质才能形成梯度？我目前只知道两性电解质可以增加蛋白的溶解度，防止部分蛋白到达等电点后出现沉淀现象。对你上述的回答有疑问，呵呵，望指点。 看情况而定,两性电解质一般有两种,一种是以Amersham为代表的IPG buffer,其使用浓度为0.5-2%,其中2%用于裂解使用,0.5%用于水化,另一种是以Bio-Rad为代表的Bio-lyte,其使用浓度为0.2-0.5%,其中0.5%用于裂解使用,0.2%用于水化.在聚焦过程中，两性电解质其实不加也没问题,适量加点最好,多加了就容易使电压升不上去(两性电解质是带电荷的,而且是多电荷).所以如果你按照常规加了两性电解质还是升不上电压,可以减少其使用浓度. shanshanxu wrote:DIGE，恕我孤陋，第一次听说两性电解质还有这样的作用，可有出处？两性电解质是如何形成连续的PH梯度的呢？如果不加，等电聚焦是不是无法完成？那么我们的IPG胶条又起到什么作用呢，它不是固相化的PH梯度胶条吗，难道它必须借助两性电解质才能形成梯度？我目前只知道两性电解质可以增加蛋白的溶解度，防止部分蛋白到达等电点后出现沉淀现象。对你上述的回答有疑问，呵呵，望指点。非常高兴和shanshanxu、zebrafishtom战友一起讨论（绝谈不上指点）。IEF（等电聚焦）电泳的关键技术就是形成连续的pH梯度。在固相pH胶条出现之前，一直是利用载体两性电解质形成稳定，连续的pH梯度。1载体两性电解质的历史：载体两性电解质的概念始于1961年，由瑞典科学家Sensson首先提出的。由于蛋白质本身也是两性电解质，在电泳时，会影响pH梯度，这就要求形成pH梯度的物质必须有足够的缓冲能力来克服蛋白质的影响。第一代载体两性电解质为Ampholine。是由许多脂肪族的多氨基多羧基的异构体和同系物组成。它们有连续变化的氨基与羧基比，是形成pH梯度的基础。第二代载体两性电解质为Pharmalyte。可得到较窄的pH范围，如pH5-6等。目前，Ampholine和Pharmalyte均由GE Amarsham公司生产，其实就是我们常用的IPG buffer。此外，BioRad公司生产的载体两性电解质为Biolyte。它是由丙烯乙胺与乙烯亚胺缩合并蒸馏得到的多胺混合物中再引入磺酸基团或磷酸基团后合成的。2pH梯度如何形成？所有载体两性电解质分子都荷电，只是在溶液中正电荷和负电荷的基团数相等时，总的净电荷为零。当引入电场时，载体两性电解质分子将向阴极或阳极迁移，只净电荷为零时才停止。3载体两性电解质特性：载体两性电解质具有分子量小，可溶性好，缓冲能力强，导电性均匀，紫外吸收低，不发光，容易从聚焦的蛋白中除去等。4固相pH胶条的出现：当80年代，固相pH胶条出现后，载体两性电解质的作用除稳定胶条的pH梯度外，更主要的作用是其缓冲能力强和导电性均匀。在固相pH胶条中，载体两性电解质可遮蔽蛋白表面的疏水基团，明显增加蛋白质的溶解度。同时，由于载体两性电解质的导电性高于固相pH梯度胶，因此，它的存在可使IPG 胶条的聚焦时间明显缩短。以上这些，是我从蛋白质电泳实验技术，科学出版社，郭尧君主编；和Proteins and proteomics: A laboratory manualR.J 辛普森著，分子克隆系列这两本书里学到的。一本中文，一本英文的，都很不错，推荐一下。zebrafishtom wrote:两性电解质其实不加也没问题,适量加点最好,多加了就容易使电压升不上去(两性电解质是带电荷的,而且是多电荷).所以如果你按照常规加了两性电解质还是升不上电压,可以减少其使用浓度.从实验的角度来说，zebrafishtom战友说的已经很对了。 我接触2-D不久，多亏了园子里各位战友的帮助，尤其是DIGE，谢谢你们！ 两性电解质应该控制使用量,而且不能不加,否则拖尾.加多了就电压上不去呢. 谢谢DIGE战友！我是基于固相IPG胶条前提提的问题。看来仍需再细看这两本书了。蛋白质组学的发展既是受技术推动的，也是受技术限制的。蛋白质组学研究成功与否，很大程度上取决于其技术方法水平的高低。蛋白质研究技术远比基因技术复杂和困难。不仅氨基酸残基种类远多于核苷酸残基，而且蛋白质有着复杂的翻译后修饰，如磷酸化和糖基化等，给分离和分析蛋白质带来很多困难。此外，通过表达载体进行蛋白质的体外扩增和纯化也并非易事，从而难以制备大量的蛋白质。 大规模蛋白质组分析过程包括样品制备(蛋白质的分离与显色成像)、图像分析(图像的采集和分析)、蛋白质成分的分析与鉴定(包括蛋白质的分子量和丰度，及通过特定算法推算出的蛋白质分子的结构等)。为此，双向电泳技术、计算机图象分析技术与大规模数据处理技术、质谱技术以及生物信息学技术被称为蛋白质组研究的基本支撑技术。样品的分离直接影响到下一步研究的结果，因此我们在本文中将详细介绍蛋白质组的分离技术。 一、样品制备 蛋白质样品的制备对于精确的蛋白质组分析尤为重要。制备样品的过程必须是可重复的，而且还应适合于随后的蛋白质分离和鉴定。目前常用的方法有： 1)制备的亚蛋白质组。根据特定蛋白质的特性(如疏水性、电性)来收集蛋白质，用于选择性溶解特定亚蛋白质组。 2)使用各种还原剂、手性试剂或去垢剂来破坏组织内和生物体液内的蛋白-蛋白和蛋白质-蛋白质之间的相互作用。 样品制备时必须注意的几个方面：简化样品处理过程，避免蛋白丢失；减少蛋白降解；避免样品的反复冻融；防止各种可能的非目标性蛋白修饰；保证清除所有杂质；样品裂解液应新鲜制备。 对较为特殊的样品(如膜蛋白多为低溶解性蛋白和偏碱性蛋白，核蛋白虽具有中度溶解性，但多为强碱性蛋白)，必要时采用特殊助溶剂或分步提取等制备方法。 二、样品分离 目前，双向凝胶电泳(2-DE)仍是最好的分离复杂蛋白质混合物的技术。一般来说可以从单个蛋白质样品中解析到20003000个蛋白质点，或可以从高通量常规凝胶中解析多达10000种蛋白质。虽然目前2-DE分析是最为广泛使用的蛋白质分离技术，但其他的一些蛋白质分离方法也可以达到2-DE的分离程度，有的还可以分离2-DE无法分离的亚蛋白质组。这些方法包括离子交换、分子筛法、高效液相色谱法(HPLC)、亲和层析色谱、毛细管IEF、毛细管电泳与质谱联用、柱层析、免疫沉淀、蛋白芯片以及蛋白质飞行质谱(SELDI)技术等技术。 (一)、双向电泳(2-DE)： 2-DE是一种大规模的蛋白质分离技术，能将数千种蛋白质同时分离与展示。在2-DE中，蛋白质首先根据等电点的不同在一向等电聚焦电泳中分离，接着被转移到二向凝胶上，此时蛋白质是根据其相对分子质量大小不同而被分离。从20世纪70年代中期首次提出二维凝胶电泳，此项技术经历了几个不同的发展阶段：由最初的重复性差、上样量小到20世纪80年代初期出现的固相化pH梯度(IPG)等电聚焦电泳技术，使其重复性和上样量大大改善；与后续的微量鉴定技术和质谱技术的联合应用更使得2-DE获得了广泛的应用，成为蛋白质组研究中首选的分离技术之一。 1.一维等电聚焦电泳(IEF) (1)一维等电聚焦的基本原理： 把蛋白质加入到含有pH梯度的集体时，如果蛋白质所在的点的pH值与其等电点不符，则该蛋白质会带一定量的正电荷或负电荷。在高于其等电点的位置，蛋白质带负电，反之带正电。此时，如果加以强电场，蛋白分子会在电场作用下分别向正极或负极漂移。当达到其等电点位置时，蛋白质不带电，就不再漂移，这就是等电聚焦电泳的基本原理。 (2)一维等电聚焦的基本过程： 首先是IEF凝胶的制备，此一步骤是电泳能否成功，结果是否精确的关键。早期的等电聚焦以合成载体两性电解质(sytheticcarrierampholyte，SCA)为介质，它的引入是等电聚焦技术的一大突破，但该技术仍存在其自身难以克服的缺陷：首先，SCA本身就是通过复杂的合成过程得到的，其重复性很难控制，这样从一开始就限制了2-DE分离的重复性