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液相色谱维护培训 赵广义 第一部分液相色谱故障排除经验液相色谱常见问题 LC10Avp LC 20AProminence 液相色谱简易流程图 1 简单 等度系统 储液瓶 脱气机 泵单元 手动进样器 色谱柱 检测器 废液瓶 1234567 2 低压梯度系统 123456789 3 高压梯度系统 12345678 液相色谱故障排除经验 故障的确定 至少要重复出现两次以上初步判断故障引起的原因 方法或硬件由经验或平时的积累确定故障原因 平时做好观察和记录当不能确认故障原因时 采用排除法逐一考察可能引起故障的因素确定故障能否自行处理 不要贸然拆卸不熟悉的部件 常见故障因素 仪器环境 实验室的温度 湿度 酸度等 实验室震动 灰尘等问题 电源及地线问题使用条件 流动相 pH值 均匀度 气泡等 样品 样品分解 氧化 样品溶剂等 色谱柱 污染 堵塞 塌陷等 硬件问题 输液泵 进样器 检测器 平常保养 做好平常的保养可以有效的降低故障的发生率 做好平常的保养可以延长仪器的使用寿命常做的保养 保持仪器的环境 经常清洁仪器 尤其是灰尘 泵的保养 使用缓冲盐时要清洗柱塞 水和盐不长期保存在泵里 进样器要经常清洗 避免污染物吸附或堵塞管路 尽量进行样品前处理 色谱柱要定期清洗 保证柱效及使用寿命 系统中不要长期保存水和盐 长时间不用时应将仪器所有部分全部更换为70 以上的甲醇 避免细菌的滋生及盐的析出 液相色谱常见问题 压力异常 偏高 波动 漏液保留时间漂移基线问题 漂移 噪声 峰形异常 压力 压力是液相色谱中最重要的指标 要经常关注压力的变化 保留时间的变化经常是由于压力问题引起的 不同溶剂即使在相同流速和温度的情况下压力也是不同的 记下仪器正常状态时 在一定条件下 流速 温度 的压力显示值 压力高时 首先要确认是色谱柱堵塞还是系统堵塞色谱柱堵时 确认可能造成堵塞的样品的性质 相应选择合适的清洗溶剂 系统堵塞 首先应确认是那一部份堵塞 依据情况排除 现象 压力持续偏高或不断上升 流速设定过高保护柱或柱子塞板堵塞流动相使用不当或有缓冲盐析出色谱柱选择不当进样阀损坏在线过滤器堵塞 容易发生堵塞的部件 保护柱及色谱柱线路过滤器管路连接处进样器吸滤器检测器流通池 压力低 如果压力为零 泵头中没有液体 而是充满了气泡单向阀完全堵死柱塞杆折断压力传感器损坏 流动相流动正常 但无压力 如果有压力但是压力比正常时低 漏液单向阀堵塞 现象 压力持续偏低 流速设置过低色谱柱选择不当柱温过高系统漏液 压力波动 压力在短时间内剧烈波动 泵头中有气泡单向阀脏柱塞密封圈漏液 现象 压力波动 泵头内有气泡单向阀坏高压密封圈 柱塞杆密封圈 损坏脱气不充分系统漏液 系统内有气泡柱内有塌陷 气泡使用了梯度洗脱 经常漏液的部件 泵 柱塞密封圈排液阀手动进样器 转子密封圈磨损检测器 流通池窗口 垫片损坏 透镜破碎 接头处漏液 接头松动 接头脏 接头磨损 部件不匹配 泵漏液 单向阀松动漏液高压密封圈磨损漏液放空阀松动 磨损漏液接头处漏液 手动进样器漏液 密封转子磨损漏液定子磨损漏液进样口密封松动进样针尺寸不合适废液管产生虹吸定量环堵塞废液管堵塞 检测器漏液 流通池垫片损坏流通池透镜破裂废液管堵塞流通池堵塞手紧接头松动 接头漏液 接头处松动接头磨损接头处污染部件不匹配 保留时间不稳定 吸滤头脏泵输液不正常 压力波动 气泡等 流动相组分变化流动相缓冲能力不够色谱柱平衡时间不够柱温的变化柱子问题 噪音大 流动相污染 变质或由低质溶剂配成有地方漏液流动相 泵 检测器流通池内有气泡流动相各溶剂不相溶或混和不均匀检测池能量不足流通池被污染温度影响 检测器和柱温差别太大 其他电子设备的影响 基线漂移 流动相污染 变质或由低品质溶剂配成流动相不均匀 脱气 使用纯度更高的溶剂 温度波动柱子平衡时间不够流通池被污染或有气泡流通池窗口破裂 峰形问题 死体积太大柱子被污染或堵塞色谱柱塌陷色谱柱化学或次级保留 硅羟基效应 色谱柱被重金属污染流动相缓冲不足或不合适样品溶剂选择不当 与流动相之间极性差异太大样品过载 浓度或体积 柱温过低 鬼峰 流动相被污染进样阀残余峰样品中未知物色谱柱中的污染物 第二部分日常使用注意点硬件基础知识容易出故障的部件及常见故障的排除 液相系统维护流程图 色谱柱 一 输液部分 管线选择 材料不锈钢TeflonPEEK 聚醚醚酮 尺寸0 1mmI D x1 6mmO D 0 3mmI D x1 6mmO D 0 5mmI D x1 6mmO D 0 8mmI D x1 6mmO D 管线材料 不锈钢 可用于所有连接 能承受几千kgf cm2压力酸性或高浓度盐环境中易腐蚀 尤其在pH小于2时 PEEK 可用于所有连接 能承受高达250kgf cm2压力可在整个PH范围 pH1 14 内使用不适用于高溶解性溶剂如氯仿等Teflon 用于柱后阻尼管 反应管和排液管 化学惰性大能承受5kgf cm2压力 接头 不锈钢接头 垫圈主要用于输液泵 进样器的连接能承受400kgf cm2压力一旦固定 垫圈不可再动PEEK接头主要用于色谱柱 检测器的连接易于安装能承受250kgf cm2压力容易产生死体积 不锈钢接头 垫圈 PEEK接头 死体积 死体积可能会引起分离度变差和重现性变差等问题 管线 公螺母 死体积 好的连接 差的连接 选择原则采用 HPLC 级溶剂避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂对试样有适宜的溶解度溶剂粘度要小与检测器相匹配 流动相 溶剂的等级HPLC级优级纯分析纯 都经过蒸馏和0 45u的过滤 除纤维毛 未溶解的机械颗粒 优级纯的纯度比分析纯大 但里面含有防腐剂和抗氧化剂 HPLC级经过0 2u的过滤 且除去有紫外吸收的杂质 微量分析 梯度洗脱 流动相 水 甲醇梯度ODS柱 鬼峰 GradientCurve 1ml min 0 100 MeOHover10minsandholdfor15mins 鬼峰的出现 流动相 水的等级纯化水蒸馏水去离子水 波长 nm 纯化水 去离子水 因为不纯物的存在 去离子的吸光率较高 纯化水中去除了无机和有机的污染物 吸光率 流动相 选择缓冲液的步骤1 确定最佳分离状态时的流动相pH2 选择具有与流动相的pH相近的pKa的缓冲液 即使浓度稀也具有较强能力的缓冲液 3 确认检测波长下缓冲液是否有大的吸收 在波长210nm附近进行检测时 不能用醋酸和柠檬酸的缓冲液 流动相 缓冲液的使用 使用前必须过滤使用后一定要对柱子进行清洗 以免造成腐蚀 磨损及阻塞 首先用5 10 的甲醇水溶液冲洗10 30min 0 5 1ml min 再用甲醇冲洗30min 0 1 0 5ml min 易受到细菌和霉菌的影响 注意冲洗次序 不能直接用有机溶剂冲洗 流动相 流动相的更换 不互溶的流动相不能直接更换 缓冲盐不能直接用有机溶剂更换 水 正己烷 异丙醇 缓冲盐 有机溶剂 水 过滤 0 45um或更小孔径滤膜目的 除去溶剂中的微小物理颗粒 避免堵塞色谱柱 尤其是在使用无机盐配制的缓冲液的时候必须过滤脱气 除去在流动相中溶解或彼此混合而产生的气泡气泡对测定的影响 1 泵中气泡使液流波动 改变保留时间和峰面积2 柱中气泡使流动相绕流 峰变形3 检测器中的气泡产生基线波动无在线脱气应注意 1 每天脱气2 如使用氦脱气 对混合溶剂脱气时间不能过长 溶剂前处理 流动相处理 吸滤头 吸滤头部件号 228 45707 91 吸滤头部件号 228 21984 01 吸滤头 材料 不锈钢烧结 或陶瓷 孔径10um故障 堵塞表现 管路中不断有气泡生成措施 用异丙醇 或5 稀硝酸 超声波清洗 再用蒸馏水清洗 泵工作示意图 流动相入口 流动相出口 单向阀 T泵 串联式往复泵 D泵 并联式往复泵 LC 20AT LC 20AT LC 20AD 单向阀 单向阀结构 球座 单向阀工作原理 单向阀结构 请不要分解阀心A和阀心B重新组装后性能不被保证 输液可能不稳定 注意 LC20AT主入口阀部件号 228 45704 92 LC20AD入口阀LC20AT副入口阀部件号 228 45704 91 LC20AD出口阀部件号 228 45705 91 单向阀 LC10ADvp出口阀LC10ATvp出口阀部件号 228 34976 91 LC10ADvp入口阀部件号 228 39093 92 LC10ATvp入口阀部件号 228 32166 91 单向阀清洗 故障 宝石球或球座受污导致密封不好表现 系统压力波动大措施 打开排液阀 以异丙醇为流动相输液拆下单向阀 放入异丙醇中 超声波清洗 注意 超声清洗时开口端向上放置 View 故障 宝石球粘附于垫片表现 泵无法吸液或排液 流路不通措施 1 用针筒抽出口单向阀以产生负压 使宝石球与垫片分开2 拆下单向阀 放入异丙醇或水中 用超声波清洗 单向阀清洗 View 柱塞密封圈 柱塞密封圈LC 20ADLC 20ABLC 10ADvp部件号228 35146 柱塞密封圈LC 20ATLC 10ATvp部件号 228 35145 取下和安装柱塞密封圈工具 柱塞密封圈的更换 故障 密封圈磨损导致密封不良现象 系统压力波动大或漏液措施 更换密封圈注意点 拆卸泵头前 柱塞杆复位 P SET 流动相 泵头清洗管路 柱塞杆 密封圈 View 柱塞杆 柱塞杆LC 10ADvp用部件号 228 35281 91 柱塞杆LC 10ATvp用部件号 228 35009 92 柱塞杆LC 20AD LC 20AB用部件号 228 35281 95 柱塞杆LC 20AT用部件号 228 35009 93 柱塞杆更换 更换柱塞密封圈后仍然漏液时 柱塞密封圈使用寿命短时 柱塞杆损伤时 应更换柱塞杆 柱塞隔膜 更换柱塞时 应同时更换隔膜 隔膜损坏导致泵头后部漏液时 应更换隔膜 注意 只有D系列泵有隔膜 T系列泵由于设计不同 没有隔膜 隔膜LC 20AD LC 20AB LC 10ADvp用部件号 228 32784 91 View 线路过滤器 故障 堵塞现象 系统压力偏高措施 异丙醇 或5 稀硝酸 超声波清洗判断依据 关闭排液阀 断开出口管路 设定流速1mL min 如压力 5kgf cm2 则堵塞 线路过滤器部件号 228 32744 过滤器的更换 旧过滤器的取出 新过滤器的安装 排液阀漏液 故障 排液阀垫圈损伤或密封不良现象 打开排液阀进行排气时 从装有排液阀的螺口处漏液措施 排液阀手柄按逆时针方向旋转取下 确认垫圈表面有否损伤 有损伤 进行更换 附有脏物 擦洗掉 再确认 LC 20A系列泵部件号 228 45574 91 LC 10Avp系列泵部件号 670 11518 排液阀 1 使用流动相溶解样品 减少溶剂峰 尤其是组分峰靠近溶剂峰时由为重要 保证样品在流动相中的溶解度 避免样品在系统中尤其在柱中产生沉淀2 进样前最好使用0 45um的过滤头进行过滤如果样品很脏 要使用0 22um的过滤头进行过滤3 对于含有复杂基质的样品 最好过前处理小柱后再进样 样品前处理 二 进样部分 进样器 自动进样器手动进样器 7725 7725i 原理 六通阀 注入方式 1 全量注入2 部分注入 7725i手动进样阀 手动进样器的原理图 7725 7725i手动进样器结构图 定子密封部件号 228 32211 31 转子密封 Vespel 部件号 670 12098 51 Tefzel 部件号 670 12098 56 转子密封适用范围 进样量和检测器响应的关系示意图 进样量 定量环体积一半 三倍定量环体积 全量注入 部分注入 响应值 交叉污染的原因 微量注射器 红色表示残留样品 进样口清洗 1 将附件进样口清洗器安在注射器上 2 清洗液 试样溶剂或不含盐的流动相等 用注射器吸入 3 在进样状态下 将针孔清洗器压接在针导管上 流入清洗液1ml左右 4 使用缓冲盐后 用水清洗流路和针孔 5 不应用微型注射器清洗 6 清洗液可能反喷 因此注射器应慢慢地推压 故障处理 漏液如果液体从定子和定子环之间流出 或从针孔流出 或从排液口流出 上紧压力调整螺钉 如果不成功更换转子或定子面组件针密封漏液针的外径由于有偏差 在使用比针外径小的注射器时 进样口不能严实密封 产生漏液 使进样量不准 从进样口取出针 用铅笔的橡皮头将针导管压入 针密封上承受压力使孔变小达到严实密封 三 分离部分 色谱柱的日常保养 购买新柱后一定要仔细阅读说明书 确认柱的使用条件以及清洗再生步骤 按照说明书条件测试色谱柱柱效 记录使用压力定期检测柱压和柱效不同流动相之间转换时应注意溶剂的互溶性确认样品不会在流动相中析出或带有固体不溶物 请使用0 45um或0 2um的一次性滤头过滤样品 或者进行前处理 为了延长色谱柱使用寿命 请使用保护柱 定期用合适的溶剂清洗或再生色谱柱长期不用时 清洗干净后 使用柱子说明书中指明的溶剂保存 柱子要从仪器上卸下并用堵头密封后保存 定期用合适的流动相清洗保存的柱子 避免干涸 峰的变形 根部变宽 有肩或分叉 峰产生有肩或分叉的原因 1 柱子劣化 进口处产生不均匀的空隙 2 样品劣化 生成氧化物 分解物等 判断标准所有的峰都产生有肩峰或分叉时则为柱子劣化 色谱柱柱效降低原因 滤片或填料堵塞样品或流动相中杂质吸附机械振动产生空隙填料变性 滤片或填料堵塞 使用预柱缓冲液和溶剂使用0 45um滤膜过滤样品溶液使用0 45um滤头过滤打开柱头 清洗或更换滤片反向连接色谱柱 使用清洗溶剂以小流量送液 样品或流动相中杂质吸附 杂质会产生拖尾峰使用高溶解性溶剂清洗色谱柱 仅几毫米深度会被污染 色谱柱 取出污染填料 装填新的填料 机械振动产生空隙 不要撞击色谱柱 如 色谱柱掉落或柱压急剧变化 色谱柱类型 色谱柱的类型及适用范围 产生峰变形的原因 柱进口污染柱内存在空隙样品过载溶解样品的溶剂选择不当 溶解样品的溶剂选择不当 最好不要选择高溶解性的试剂作为溶解样品的溶剂 最好注入少量样品 四 检测部分 紫外检测器光路图 紫外检测器 参比池 样品池 光线 硅光电池板 检测器基线异常 基线噪音异常大气泡未脱出检测器污染灯老化出现漂移