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Q260046902 专业做论文郁金药材水溶性部分的指纹图谱研究兰州大学药学院药学专业:刘晓丽 指导老师:封士兰教授摘 要 目的:研究比较郁金水溶性部分和复方制剂的指纹图谱,并计算指纹图谱相似度,为郁金药材及其复方制剂的质量控制提供依据。 方法:采用气相法测定郁金和含郁金的复方制剂的各特征指纹图谱,并且以每天三次、连续三天的进样模式,分别得到郁金水溶性样品和复方制剂样品的指纹图谱各9张。郁金水溶性样品色谱图中得到了相对稳定的7个共有峰,且在含郁金的复方制剂样品中同样具有与郁金相应的7个峰。计算各色谱峰与共有模式的相似度以及各色谱峰相对保留时间的相对标准偏差(RSD%)。郁金8个样品的相似度分别为:0.6903、0.8960、0.8012、0.8407、0.8997、0.6845、0.8400、0.7864,平均相似度为 0.7838;复方制剂9个样品的相似度分别为:0.9713、0.9979、0.9894、0.9950、0.9981、0.9983、0.9921、0.9970、0.8933,平均相似度为0.9701。 郁金各色谱峰相对保留时间的RSD%分别为:0.9953、0.3502、0.0000、0.3427、0.5233、0.4955、0.4622;复方制剂各色谱峰相对保留时间的RSD%分别为:0.1742、0.1226、0.0000、0.1184、0.1801、0.1691、0.1826。 结论 该方法具有快速、简便、数据准确等特点;郁金指纹图谱和复方制剂指纹图谱的相似度都0.78,重现性好,RSD均0.78, the reproduction quality is all good,all of RSD1%。We by altogether have the peak to carry on the demarcation, obtains the chromatograph fingerprint atlas has certain characteristic value, For curcuma raw material for medicine and by water-withdraws the preparation craft curcuma compound prescription preparation quality control has provided certain technical support and the scientific basis.Keywords Fingerprint diagram ;Object;Quality control; Curcuma aromatica Salisb;Soluble 郁金药材水溶性部分的指纹图谱研究引 言 中成药由于其成分极其复杂、有效成分及这些成分间相互的药理作用不明确,导致其质量很难控制。但是如果我们传统的中药想走出国门,走向世界,被欧美所接受,就必须进行中药质量控制。中药的质量控制标准不能简单的等同于化学药品的控制标准,必须制订中药自己独特的质量标准。中药尽管曾经在质量标准中建立多项鉴别试验,但也不能做到逐一味药、逐一成分进行鉴定。色谱指纹图谱分析使中药质量控制的可行策略即对某种(或某产地)中药材或中成药经适当处理后采用一定的分析手段,得到能够标识该中药材或中成药特性的色谱或光谱的图谱。目前,国际上已认可用中药指纹图谱来作为控制中药质量的质控模式。指纹图谱又是中药实现国际化的关键技术。本实验以经生药学鉴定的郁金和混合药材做为研究对象, 样品经过预处理后用GC分析技术对样品进行分析, 并通过不断试验建立合适的色谱条件。按照已经建立的分析方法, 获取郁金和复方制剂的指纹图谱中特征峰及保留时间和峰面积等数据在此条件下进行样品的稳定性实验,得到专属性、准确度与稳定性好(RSD1%)的郁金水提部分的指纹图谱,并以此图谱作为复方制剂中郁金水提部分的特征指纹图谱.将未知样品的指纹图谱与已经建立的郁金水提物部分的指纹图谱进行比较, 即可为未知样品的真伪及郁金药材和以水提为制剂工艺的郁金复方制剂的质量控制提供一定的技术支持和科学依据. 本实验建立的指纹图谱可为该复方制剂中郁金药材的真伪鉴别和质量控制提供一定的依据。通过相似性和相关性对比,发现质量变异和缺陷,从而在全过程中及时把握和控制中药的质量命脉。正 文中药作为我国的传统医药,是中华民族的瑰宝,是中国人几千年来通过以身试药,保留和传承下来的宝贵的历史文化遗产。也是历史上唯一以人作为实验对象的医药体系.我们的传统的医药中医药在数千年的应用中,通过不断的摸索与实践形成了自己独特的诊断方式和用药原则!勤劳的中华民族就是通过它治疗疾病和强身健体的!中医药的 “理、法、方、药”的理论渗透着深厚的古代哲学思想和观点。以中药而论,其性味归经、五行生克等理论就是在大量临床观察的基础上,利用古代哲学思想归纳演绎出来的理论,再返回来指导临床应用。传统的复方中药制剂的组方理论从神农本草经、素问就规定了“君、臣、佐、使”的组方法则。而“辨证论治”则是中医用药的精髓。本草学家、方剂学家以及临床学家对此有许多精辟的解释和实践经验。中医药理论的形成实际上反映了我国古代的科学与科学认识方式。人类科学认识史已经经历了三个重要的发展阶段。古代的科学与哲学基本上是一体的学问,自然哲学代表了当时科学发展的最高成就。与古代科学认识水平相适应的主要是直观的和综合的思维方式,这种科学认识方式是在科学观察手段非常粗糙的情况下凭天才猜测试图探求世界本质,力求把表面上极为复杂的自然现象归结为几个简单的基本概念和关系。如中医把自然、人体和药物都用朴素的辩证观点归结成“阴和阳”以及“五行生克”。就药材而论,中医将每一味药材视为一个单一的不可分割的“个体”,将其药理作用按照“性”“味”归结为“寒热温凉”;“升降浮沉”以及“酸甘苦辛咸”。复方方剂是几个“个体”组合的“群体”,归结为“君、臣、佐、使”的关系,使之各司其职,发挥不可分割的“整体作用”。经过历代的发展和演绎,形成了一个有着浓厚古典自然哲学思想与民族文化背景的理论体系。过去对于药材的真伪优劣是通过感官对药材作为一个整体分辨其形态气味,对制剂制备的质量控制,由于当时没有科学的检测手段,则认为“丸散膏丹,神仙难辨”,只能以“修合虽无人见,存心自有天知”的道德修养来约束。10近年来,随着疾病谱和治疗模式的转变,天然药物越来越受到世人的关注。中药及其制剂正是将天然植物经过加工而成的。因此中药及其制剂倍受青睐。据报道中医药在世界替代医学与疗法中,占据前沿位置。但是由于中药成分极其复杂、有效成分及其相互的药理作用不明确,导致我们的中药在国际天然药物市场中仅占3 %5 %的份额。要想中药可以真正的走出国门,为全世界所接受,我们就必须能够提供类似于西药质量控制的标准,与化学药品的质量标准的不同之处在于,中药还不是可以据以直接评价疗效的标准,目前的这种质量标准可以反映上市的商品的真实性和优良程度,以判断产品是否合格、稳定和一致。这种质量标准作为控制指标在监督检查市场中成药商品的真伪优劣、保证药品的质量方面起到了肯定的积极作用。中药的质量标准有两个分支,一个是接近于化学药品质量标准的有效成分的定性定量分析,它可能比较适用于处方简单,现代科学基础研究比较深入,有效成分与临床治疗的指标比较吻合的品种。一个是中药制剂“药效成分”的色谱图像分析或指纹图谱分析,提高综合分析的能力,可能更适应中医传统理论的需要,或者是二者的结合。目前国家药典采用定性或定量测定中药材中活性成分或有效成分来评价其质量,但研究证明,中药的疗效是来自其多种“活性成分”之间的协同作用,甚至是与“非活性成分”之间的协同作用或“生克作用”。在中医理论指导下的中药,任何一种活性成分均不能全面反映中医用药所体现的整体疗效。中药成份本身的复杂性和其制备工艺的不完善,是造成中药产品质量不稳定的一个重要因素,如何对中药(制剂)质量进行控制和评价是企业、科研及管理部门关注的问题。国家食品药品监督管理局从2000 年开始推出采用指纹图谱技术进行中药质量控制和评价的试行方案以来,形成了中药指纹图谱技术研究的热点。7郁金为姜科植物温郁金(Curcuma wenyujin Y.H.chen et C.Ling)、姜黄属植物姜黄(黄丝郁金,Curcuma longa L)、广西莪术(桂郁金,Curcuma kwangsinensis S.G.Lee et C.F.Liang)、蓬莪术/ 绿丝郁金,Curcuma phaeocaulis Val.)的干燥块根。冬季或早春当地上部分枯萎后采挖,取下端的块根(郁金),洗净,开水煮熟后晒干或烘干3。郁金主产于广西、广东、四川等,温郁金含挥发油0.3% ,主要含有莪术醇、莪双酮、异味吉马烯、吉马烯、樟脑、龙脑、异龙、莰烯、-蒎烯、- 蒎烯及川芎素等。姜黄含挥油2.01%,成分有姜黄酮、姜油烯、水芹烯、1,8-桉叶素、香桧烯等。广西莪术含挥发油0.3% ,挥发油成分不含姜黄素,主要为莪术酮类及类同温金和姜黄中的烯类酮类成分。蓬莪术含挥发油0.35%,成分有蓬莪术环氧酮、蓬莪术酮、蓬莪术二烯、蓬莪术环二烯酮、姜黄醇酮等3。气相色谱法具有灵敏度高、选择性好、分离效率高、分析速度快、应用范围广等特点,11 本文采用气相色谱法测定郁金和含郁金的复方制剂的各特征指纹图谱,并且以每天三次、连续三天的进样模式,分别得到郁金和复方制剂的指纹图谱各9张。比较这些指纹图谱,并计算各色谱峰与共有模式的相似度以及各色谱峰相对保留时间的相对标准偏差(RSD%)。该方法具有快速、简便、准确等特点;郁金指纹图谱和复方制剂指纹图谱各自都有相似性,重现性好,RSD%均1%。该方法可用于鉴别和控制复方制剂中郁金的质量,具有简便、准确、专属性强等特点。现将结果报道如下:实验部分:1.仪器与试药1.1仪器气相色谱仪:北分GC 3420;弹性石英毛细管柱:中科安泰 S-PEG-20M(30mX0.25mmX0.25m);检测器:FID;超声仪:昆山市超声仪器有限公司 KQ 3200 DB 型数控超声波清洗器;载气:N2高纯氮(99.99%),空气流速:300ml/min,氢气流速:30ml/min;分流进样,分流比为40:1;工作站:N2000 兰州化物所研制。1.2试药色谱纯甲醇:山东禹王实业有限公司禹城化工厂生产的色谱纯甲醇;分析纯甲醇:山东禹王实业有限公司禹城化工厂生产的分析纯甲醇;水:重蒸馏纯净水;本实验所用郁金购于甘肃省兰州市黄河药市,由兰州大学生药教研室周印锁教授进行生药学鉴定为姜科植物温郁金(Curcuma wenyujin Y.H.chen et C.Ling)、姜黄属植物姜黄(黄丝郁金,Curcuma longa L)、广西莪术(桂郁金,Curcuma kwangsinensis S.G.Lee et C.F.Liang)、蓬莪术/ 绿丝郁金,Curcuma phaeocaulis Val.)的干燥块根。郁金复方制剂由10味中药材研制而成,其中郁金为君药,由兰州大学药物分析研究所提供。2. 方法与结果2.1供试品溶液的制备复方制剂样品(含有10味中药材,其中郁金为君药): 按处方10倍量称取药材,混合,水煎煮3次,第一次1h,第二次40min,第三次40min,合并三次所得的煎煮液,离心,弃去沉淀,提取液浓缩至干(水浴蒸发后,42冷冻干燥)得复方制剂浸膏。精密称取复方制剂粉末2.0764克至10ml的容量瓶中,加入8ml甲醇,超声提取30min,放置至室温,至刻度,用0.45m的微孔滤膜过滤,到供试品复方制剂样品。郁金样品:称取郁金药材100克,以10倍量的水煎煮3次,第一次1h,第二次40min,第三次40min, 合并三次所得的煎煮液,离心,弃去沉淀,提取液浓缩至干(水浴蒸发后,42冷冻干燥)得郁金浸膏。精密称取郁金浸膏0.4196g置于10ml容量瓶中,加甲醇超声溶解(30 min),放置至室温,用甲醇定容至刻度,用0.45m的微孔滤膜过滤,得到郁金样品溶液.2.2色谱分离条件选择2.2.1极性部分S-PEG-20M(1)色谱条件1:弹性石英毛细管柱:中科安泰 S-PEG-20M(30mX0.25mmX0.25m);气化室温度:250;检测器温度:260;压力0.06kpa;进样量2l;柱温:初始80,5/min升至250,保持5min。此条件下得到郁金样品的谱图见图1-1。图1-1可以从图中看到,谱图在24 min后基线出现了漂移,但一般第一次进样时由于仪器的不稳定和柱中可能残存其他溶剂,会导致谱图的不准确。为了排除这些影响,我们在此色谱条件下进了第二针郁金溶液,得到郁金样品的谱图见图1-2。图1-2通过这张谱图我们发现基线还是存在漂移,但是24min以后出现的色谱峰明显多于图1-1,可能是该色谱条件不合适,所以要更改色谱条件。比较以上两张图可以发现在30min以后几乎没有多少峰,我们可以将升温的速度减慢,使中间部分的峰能尽量多出一点,所以将色谱条件更改为色谱条件2。(2)色谱条件2:弹性石英毛细管柱:中科安泰 S-PEG-20M(30mX0.25mmX0.25m);气化室温度:250;检测器温度:260;压力0.06kpa;进样量3l;柱温:初始120,3/min升至230,不保持。此条件下得到郁金样品的谱图见图1-3。图1-3可以看到基线的后部仍然存在漂移,而且出的峰的数量和形状都没有图1-2多,因此考虑采用二阶程序升温。首先以较慢的升温速度升至200,并且多保持一会(因为图1-2在24 min附近出现了大量的峰,延长保持时间有助于使这些峰都达到分离),接着以较快的升温速度升到250(因为在谱图的末端出现的峰很少,加快升温速度可以使采集时间缩短,提高效率),所以将色谱条件改为色谱条件3。(3)色谱条件3:弹性石英毛细管柱:中科安泰 S-PEG-20M(30mX0.25mmX0.25m);气化室温度:250;检测器温度:260;压力0.06kpa;进样量3l;柱温:程序升温,初始80,5/min升至200,保持10min,10/min升至250,不保持。此条件下得到郁金样品的谱图见图1-4。图1-4在此条件下,出现的色谱峰不但多,而且响应值也不小,同时各色谱峰基本上实现了基线分离.对复方制剂也在这一条件下进行分析,发现复方制剂色谱图的分离效果同样很好,因此可以将此色谱条件(气化室温度:250;检测器温度:260;压力0.06kpa;进样量3l;柱温(程序升温,初始80,5/min升至200,保持10min,10/min升至250,不保持)作为郁金指纹图谱研究的条件。2.2.2非极性部分SE-54(1)气相色谱条件1:弹性石英毛细管柱:中科安泰 SE-54(30mX0.32mmX0.33m);气化室温度:250;检测器温度:300;压力0.06kpa;进样量3l;柱温:初始50保持5min,5/min升至250,保持5min。此条件下得到郁金样品的谱图见图2-1。图2-1此色谱条件下各色谱峰的响应值很小,几乎看不到尖锐的色谱峰。但一般第一次进样时由于仪器的不稳定和柱中可能残存其他溶剂,会导致谱图的不准确。为了排除这些影响,我们在此条件下进了第二针郁金样品,得到的谱图见图2-2。 图2-2郁金仍然没有出现明显的吸收峰,而且谱图的末端没有峰,那250时的保留就没有意义。所以根据此情况将起始温度调高至100,将色谱条件改为2。(2)气相色谱条件2:弹性石英毛细管柱:中科安泰 SE-54(30mX0.32mmX0.33m);气化室温度:250;检测器温度:300;压力0.06kpa;进样量1l;柱温:初始50保持5min,5/min升至250,保持5min。此条件下得到郁金样品的谱图见图2-3。图2-3可以从图中看到基线的后部出现了5个小峰,但是在420min这段时间里几乎没有任何峰出现,具体条件更改为气相色谱条件3。以便确定峰主要出现在哪段时间中,再根据出峰情况改变色谱条件为3。(3)气相色谱条件3:弹性石英毛细管柱:中科安泰 SE-54(30mX0.32mmX0.33m);气化室温度:250;检测器温度:300;压力0.06kpa;进样量1l;柱温:初始50,保持5min ,5/min升至100,10/min升至250,不保持。 此条件下得到郁金样品的谱图见图2-4。图2-4此条件下虽然在图谱的中部出现了几个小峰,但是后面的曲线仍然存在漂移,谱图不是很理想。并且图的中部没有峰,将条件更改为气相色谱条件4。(4)气相色谱条件4:弹性石英毛细管柱:中科安泰 SE-54(30mX0.32mmX0.33m);气化室温度:250;检测器温度:300;压力0.06kpa;进样量1l;柱温:初始80,保持5min ,5/min升至180,10/min升至300,不保持。此条件下得到郁金样品的谱图见图2-5.图2-5色谱图仍然很不理想. 由于时间关系,并没有摸索出合适的SE-54的色谱条件.由于即便是在同一条件下,郁金的色谱图仍然不能够重复,如图2-1和图2-2,考虑到SE-54为非极性柱,而本实验的样品采用极性很强的水进行提取,根据相似相溶的原理,水提物部分可能含有的非极性成分不多.同时,GC主要研究的是挥发油类成分,而本实验中样品的处理采用煎煮的方法,并没有采取任何回馏装置,挥发油类成分极易挥发而使其不稳定,所以并没有出现稳定的色谱峰。如果以后有机会,我希望可以继续这一有意义的实验。2.3指纹图谱的测定和研究分别吸取郁金样品和复方制剂的样品3l,注入气相色谱仪,记录39min 的色谱图。将做的稳定性实验的9张郁金图谱进行比较,在色谱图上选择一个特定色谱峰,该峰为所有样品所共有,且位于色谱图中心位置和具有较高的强度,将其指定为参考峰。本实验将郁金谱图中16min附近的3号峰作为参照峰。在此基础上求出所有色谱峰的相对保留值。相对保留值计算公式为:= tri/trs 。其中tri 为待测峰的绝对保留时间, trs 为参考峰的绝对保留时间。相对面积计算公式为: Sr = (待测峰i 的相对面积/准样品的总面积) 100%。混合溶剂的谱图中标明的7个色谱峰的保留时间与郁金的基本上吻合。郁金样品的9张色谱图见图3-1至图3-9,复方制剂样品的9张色谱图见图4-1至图4-9.测得的保留时间和相对保留时间的RSD值见表1、表2。研究结果表明:在有效成分不完全明确的前提下,利用色谱指纹图谱来鉴别中成药中郁金的真伪优劣是切实可行的,并为不同品种郁金之间的鉴别提供了科学依据. 图3-1 图 4-1 图3-2 图 4-2 图3-3 图4-3 图3-4 图4-4 图3-5 图4-5 图3-6 图4-6 图3-7 图4-7 图3-8 图4-8 图3-9 图4-9峰号图3-1图3-2图3-3图3-4图3-5图3-6图3-7图3-8图3-9平均值RSD%10.63320.63200.63340.61880.62740.63160.64250.62850.63290.63110.995320.82990.82910.83090.82130.82710.82850.82330.82420.82730.82700.350231.00001.00001.00001.00001.00001.00001.00001.00001.00001.00000.000041.31671.31771.31641.33091.32171.31761.32081.32061.32311.32060.342751.80011.80431.80131.82961.81181.80361.81211.81211.80011.80830.523361.96751.97161.96911.99781.97971.97111.97731.97881.96561.97540.495572.17272.17802.17212.20262.18692.17812.18462.18512.17022.18120.4622表1:郁金的保留时间(min)和相对保留时间的RSD%峰号图3-1图3-2图3-3图3-4图3-5图3-6图3-7图3-8图3-9平均值RSD%10.63370.63280.63400.63460.63490.63580.63640.63380.63430.63450.174220.82570.82280.82520.82480.82500.82390.82280.82430.82440.82430.126031.00001.00001.00001.00001.00001.00001.00001.00001.00001.00000.000041.31671.31961.31711.31651.31481.31531.31461.31771.31631.31650.118451.80351.81171.80271.80431.80021.80221.80311.80581.80281.80400.180161.96951.97661.96981.96981.96601.96581.96681.97051.96721.96910.169172.17822.18722.17702.17852.17372.17442.17582.17772.17572.17760.1826表2:复方制剂的保留时间(min)和相对保留时间的RSD%计算公式:相似度2.4指纹图谱精密度、稳定性的考察(PEG-20M色谱柱)本实验对同一供试品溶液的指纹图谱峰面积与其共有模式峰面积相比较,并进行相似度计算,其中8组郁金样品指纹图谱的相似度分别为0.6903、0.8960、0.8012、0.8407、0.8997、0.6845、0.8400、0.7864;9组复方制剂溶液的指纹图谱相似度分别为0.9713、0.9979、0.9894、0.9950、0.9981、0.9983、0.9921、0.9970、0.8933。8组郁金样品相似度数据中有5个在0.8000以上;9组复方制剂样品的相似度数据中有8组在0.9700以上,而只有一组为0.8933,说明郁金样品及其复方制剂的稳定性好,其中稳定性较低的一组可能是由于仪器、进样量、操作人员等误差引起的。按照指纹图谱相关技术要求,对郁金和混合物溶液的检测方法进行精密度和稳定性考察,并计算相关系数。精密吸取同一供试品溶液,连续进样3次,持续3天。以郁金样品的指纹图谱中的3号峰为参照峰,各峰与共有模式的相对保留时间的RSD%分别为郁金样品:0.9953%、0.3502%、0.0000%、0.3427%、0.5233%、0.4955%、0.4622%;复方制剂样品:0.1742%、0.1226%、0.0000%、0.1184%、0.1801%、0.1691%、0.1826%。 2.5讨论 郁金和复方制剂都是多组分的混合物,而气相色谱分析的目的是对多组分混合样进行定性和定量的分析,所以本实验采用了GC作为分析的手段。由于绝对保留值受操作条件影响较大,重复性较差,如果采用某组分与另一基准物的相对保留值来定性,则可以消除某些操作条件影响。本文采用相对保留时间(即以谱图中峰面积中等、保留时间中等、在郁金样品谱图中部的3号峰作为参照峰,其他组分的保留时间与3号峰保留时间的比值)来计算RSD%。因为绝对保留值只受柱温和固定相的影响,与操作条件无关。但是绝对保留值在同一根色谱柱上不同的组分可能具有相同的数值或者差别很小,这就需要采用双柱保留值法进行定性。因此我们选用了极性相反的PEG-20M和SE-54色谱柱。一般来说,在两根极性差别较大的柱子上的定性结果如果一致的话,就基本可以确定该组分,结果比较可靠。11实验结果表明PEG-20M部分各峰与共有模式的相对保留时间的RSD均1%,说明, 仪器和方法的的精密度很好。但是由于时间关系SE-54部分的实验未能完成。AE.SE-54毛细管柱法测定郁金样品及含郁金的复方制剂样品的指纹图谱尚未得出令人满意的结果。但是由图2-1-图2-5可见用SE-54毛细管色谱柱对郁金药材水溶性成份指纹图谱的测定效果不佳,可能是由于本实验中对供试品进行处理时,先水煎煮法提取后浓缩成浸膏,在这过程中郁金中挥发性成分大量挥发,在制成的供试品溶液中含量很少或几乎不存在;另外,也可能是在研究中仪器、柱子等的影响所造成,建议重新选择其它规格的非极性柱子,或者是尽量不用非极性柱子测定郁金及含复方制剂水溶性部分的指纹图谱. 3.结论 结合所有的色谱图进行对比,研究结果表明:GC主要分析样品中的挥发油类成分,但是由于复方制剂的处理过程中进行了煎煮,但是并没有安装回馏装置,使得样品中含有的挥发油大大减少,从而使指纹图谱中峰的响应值很小,但吸收峰仍然很明显。郁金挥发油均出现相应的成分峰,并且在复方制剂的谱图中可 以找到相对应的色谱峰。通过计算得知同一样品溶液的重现性和精密度都很好。

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