依利特液相提纲.doc

。液相色谱实验实验目的:学习掌握仪器原理、结构、应用及仪器使用注意事项。掌握色谱工作站的使用，独立操作，建立分析方法，了解色谱条件优化方法，建立单点标准曲线，分析待测样品浓度。基本原理：色谱仪是用来分析分离混合物的仪器，它是利用混合物各组分在固定相和流动相上的分配系数不同，对物质的组分进行分离，定性定量分析。液相色谱主要用于高沸点、遇热易分解以及具有生物活性的组分的分析分离。本次实验重点针对依利特液相色谱的紫外可变波长检测器、单泵、手动进样器及比较常用的化学键合固定相C18柱（反相柱）的原理、结构、应用及仪器使用注意事项进行基本操作训练，掌握用外标法单点定量的要点及注意事项，掌握色谱工作站的设置、数据采集、数据处理、打印数据谱图报告的方法。化学键合固定相化学键合相色谱法是由液液分配色谱法发展而来。分配色谱法虽然分离效果好，但由于固定液的流失，会使柱效和分离选择性下降。流失的固定相会使基线的噪声增加，降低了检测器的灵敏度。化学键合相色谱法已逐渐取代液液分配色谱法，广泛应用，在高效液相色谱法中占有极其重要的地位。根据键合固定相与流动相的相对极性的强弱，可分为正相键合相色谱和反相键合相色谱。反相键合相色谱的键合固定相极性小于流动相的极性，适合分离非极性、极性和离子型化合物。应用范围比正相键合相色谱更为广泛，约70%-80%的分析任务皆由反相键合相色谱法完成。非极性烷基键合相是目前最广泛应用的柱填料，尤其是十八烷基硅烷键合相(Octadecylsilyl,简称 ODS-C18) 在反相液相色谱中发挥着重要作用，它可完成高效液相色谱分析的大部分任务。化学键合固定相是将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上,是目前应用最广、性能最佳的固定相；主要有 a. 硅氧碳键型： SiOC b. 硅氧硅碳键型：SiOSi C 稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广； c. 硅碳键型： SiCd. 硅氮键型： SiN化学键合固定相的特点（1）传质快，表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快；（2）寿命长，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击；耐水、耐光、耐有机溶剂，稳定； （3）选择性好，可键合不同官能团，提高选择性；（4）有利于梯度洗脱；存在着双重分离机制：(键合基团的覆盖率决定分离机理)，高覆盖率：分配为主；低覆盖率：吸附为主；流动相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定液的极性（正相 normal phase），反之流动相的极性大于固定液的极性（反相 reverse phase）。正相与反相的出峰顺序相反；影响分离的因素与提高柱效的途径 在高效液相色谱中, 液体的扩散系数仅为气体的万分之一，则速率方程中的分子扩散项B/U较小，可以忽略不计，即： H = A + C u流速对分离效果的影响：流速对柱效的影响如图所示。在实际操作中，流量仍是一个调整分离度和保留时间的重要可选择参数。固定相及分离柱 气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色谱，其选用原则与气相色谱一样。但在高效液相色谱中，分离柱的制备是一项技术要求非常高的工作，一般很少自行制备。选择流动相时应注意的几个问题（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。（2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。（4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。分离类型选择仪器使用注意事项流动相：配制前需要分别用0.45m有机相膜和水膜过滤，避免尘埃阻塞色谱柱，使用前需要超声波脱气或使用在线脱气机脱气（最好的脱气方法是用氦气，但价格昂贵，一般不用）。恒流泵：使用前先要打开排气阀，排除流动相管线中的气体，一定不要让气泡进入系统。检测器：可在200-400nm之间调节，选定最大吸收波长检测，采集数据得到色谱图。色谱柱：一定要了解色谱柱的性能，不要把不适合做的样品进到色谱柱中，会使色谱柱废掉。如果使用加入了缓冲溶液的流动相，实验结束后，一定要用85%的甲醇水洗柱子20-30分钟，否则盐分会在柱子中结晶，占据固定相的空间，以后再用其它流动相时，盐会溶解，柱子的死体积增加，柱效下降，分离效果差。长期不使用时要用100%的甲醇洗30分钟以上。样品浓度不要太大。对于复杂样品可以调节流动相配比或加酸、加碱、加缓冲溶液改变流动相的PH值。我们用的ODS-C18（反相色谱柱）可在PH值3-8之间。手动进样装置：必须使用平头进样器，否则会损坏六通进样阀。样品配制后需要用0.45m有机相膜或水膜过滤，进样前需用样品润洗进样器5-7次，取样品量是进样量的两倍以上，针尖向上排出气泡，准确留出进样体积，分析易挥发组分，需在进样前随进随取，避免样品或溶剂挥发，影响测定的准确性。为了确保进样量准确，可以使用一定体积的定量管（定量环），但进样量要大，保证把定量管里的体积全部置换。思考题1. 简述液相色谱分析与气相色谱分析的异同点？2. 影响标准曲线相关系数的原因？3. 液相色谱中改变流速对分离、峰面积、峰形有何影响？4. 液相色谱分离条件的优化可以改变哪些因素？5. 在使用反相键合相色谱柱时，本实验标准样品的保留