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模式生物 大肠杆菌 酵母菌 张红霞 大肠杆菌简介 大肠杆菌 Escherichiacoli 是相对简单的单细胞原核生物 所有DNA RNA和蛋白质合成的机器都包含在同一细胞器中 可以相对容易的培养和操作 酵母菌简介 酵母菌 Yeast 是一群以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖的单细胞真核生物 分属于子囊菌纲 子囊酵母菌 担子菌纲 担子酵母菌 半知菌类 半知酵母菌 共由56个属和500多个种组成 如果说大肠杆菌是外源基因最成熟的原核生物表达系统 则酵母菌是最成熟的真核生物表达系统 酿酒酵母 Sacharomycescerevisiae 是第一种至少在一万年前就能被人工培育的真菌 是最简单的真核生物 是由一个细胞组成的独立的生物个体 能在基本培养基上生长 易于培养和操作 被称为真核生物中的 大肠杆菌 早在1996年就完成了酿酒酵母的基因组测序 这是人类第一次获得真核生物基因组的完整核苷酸序列 被称为遗传学研究上的一座里程碑 大肠杆菌基因组 大肠杆菌通常只有一条染色体 比高等生物的基因组要小得多 并且具有较高的基因密度 大约每1kb就有一个基因 没有内含子和很少有重复DNA 易于寻找和分析基因 通过对酵母全基因组序列测定 其基因组大小约为12Mb 初步确定了5885个编码蛋白质的基因 140个rRNA基因 275个tRNA基因 第一次揭示了一种真核生物的全部基因的数目和大体上的功能分类 酵母基因组中有将近31 编码蛋白质或者具有开放阅读框 与哺乳动物编码蛋白质的基因有高度的同源性 酵母菌基因组 酵母与其它真核生物相比 它们的基因组较小 约12Mb 基因数目也比较少 约5885 与大肠杆菌类似 它们可以在实验室里快速繁殖 在理想条件下 每次细胞分裂大约90min 可以从单个细胞繁殖成克隆群体 酵母作为模式实验系统最重要的优点是 酵母细胞不仅简单 而且具有所有真核生物细胞的主要特征 如含有一个独立的细胞核 多条线性染色体包装成染色质 细胞质包含了全部的细胞器 如线粒体 和具有细胞骨架结构 如肌动纤维蛋白 等 大肠杆菌遗传学研究应用 大肠杆菌的生活周期很短 并且单个细胞可以很容易的获得一个遗传上同源的细胞群体 克隆 细菌是单倍体 这意味着即使是隐性突变 也能够表现出突变的表型 同时细菌之间可以方便地进行遗传物质的交换 细菌的这些特征便于对其进行遗传学研究 大肠杆菌作为生命科学研究的模式系统 其主要优势是具有遗传交换系统 遗传交换使定位突变 构建含多种突变的菌株 构建用来辨别显性突变和隐性突变及进行顺反式分析的部分双倍体的菌株成为可能 这种遗传交换系统主要通过两种方式构建的 第一种方式是大肠杆菌通过性结合交换DNA 大肠杆菌的育性质粒 F因子 F factor 具备把自身从一个细胞转移到另一个细胞的能力 F因子介导的结合是一个复制的过程 F 细胞转移一个拷贝的F因子给F 细胞 有时 F因子整合到染色体中 就会引起寄主染色体通过接合向F 细胞转移 含有整合的F因子的菌株叫做Hfr菌株 高频重组菌株 Hfrstrain 这种材料对于进行遗传交换研究非常有用 第二种方式是通过噬菌体介导的转导 噬菌体成熟时有一部分噬菌体的DNA被寄主DNA所取代 当噬菌体感染下一个细胞时 从以前寄主那里获得的染色体DNA片段可以和被感染的寄主染色体发生重组 导致遗传信息从一个细胞转移到另一个细胞 在酵母系统中 单倍体和双倍体细胞的存在促进了酵母的遗传分析 酵母在单倍体和二倍体的状态下均能生长 并能在实验条件下较为方便地控制单倍体和二倍体之间的相互转换 这种转换是通过交配 单倍体到双倍体 和孢子生成 双倍体到单倍体 来实现的 这对其基因功能的研究十分有利 例如 要想知道一个特定的基因是否是细胞生长所必需的 可以在单倍体里敲除这个基因 单倍体细胞只能承受非必需基因的敲除 酵母菌遗传学研究应用 酵母中容易对其基因组做精确的人为突变 当把末端与基因组的任何一个特定区域同源的线性DNA引入到酵母细胞中 酵母基因组就会发生非常高的同源重组 导致目标染色体序列被所用的目的染色体片段所取代 如精确地删除整个基因的编码区 改变单个特定的密码子 甚至改变启动子中一个特定的碱基对 这使得研究基因或其调控序列的功能等具体问题变得比较容易 在20世纪60年代末 Hartwell Hunt和Nurse便认识到用遗传学方法研究细胞周期的可能性 Hartwell采用酿酒酵母细胞建立系统模型 经过一系列试验 分离出细胞周期基因发生突变的酵母细胞 相继发现了一系列与细胞周期调控相关的CDC基因 celldivisioncyclegenes 一种被称为 START 的基因对控制各个细胞周期的最初阶段具有决定性的作用 Nurse在Hartwell的基础上 发现了调节细胞周期的一种关键物质CDK 细胞周期蛋白依赖激酶 并证明CDK是通过对其它蛋白质的化学作用 磷酸化作用 来驱动细胞周期 鉴于利用酵母分子遗传学对细胞周期调控理论的巨大贡献 Hunt Hartwell和Nurse荣获了21世纪的首届诺贝尔生理医学奖 细胞生命活动中的许多过程诸如酶催化代谢反应 信号转导 蛋白质的修饰与加工 蛋白质的转运等都表现为一种蛋白质与另一种蛋白质间的相互作用 传统的免疫印迹 Westernblot等方法很难满足对蛋白质分子之间相互作用这一动态过程的研究需要 利用酵母转录因子的特点 Fields和Song于1989年创立了一种非常简便而有效的研究蛋白质相互作用的方法 酵母双杂交系统 酵母双杂交系统 最突出的特点是可以在酵母这种生长迅速且易操作的体系中研究真核细胞的蛋白质 蛋白质相互作用 而且还可通过cDNA文库筛选直接找到与未知蛋白质相互作用的蛋白质的基因 近年来为了适应更广泛的用途 在原有酵母双杂交系统基础上发展了大量的衍生系统 如蛋白质三杂交系统 激酶三杂交系统 小配体三杂交系统 RNA三杂交系统等类型 此外 还出现了为研究膜蛋白的相互作用而改进的SOS富集系统 SOSrecruitmentsystem SRS 在该系统中 蛋白质之间的相互作用被人为限制在酵母细胞膜上 应用 利用重组大肠杆菌生产人胰岛素 1982年 美国ElyLiLi公司首先使用重组大肠杆菌生产人胰岛素 成为世界上第一个上市的基因工程药物 由基因工程菌合成的重组人胰岛素在体外胰岛素受体结合性能 淋巴细胞和成纤维细胞的应答能力 降血糖作用 血浆药代动力学等指标上均与天然胰岛素没有任何区别 而且还具有无免疫原性 注射吸收迅速等优点 充分展示了基因工程在生物医药领域中的巨大潜力 大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征 大肠杆菌表达外源基因的优势 大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征 大肠杆菌表达外源基因的劣势 蓝白斑筛选 筛选原理 野生型大肠杆菌产生的 半乳糖苷酶可以将无色化合物X gal 5 溴 4 氯 3 吲哚 D 半乳糖苷 切割成半乳糖和深蓝色的物质5 溴 4 靛蓝 有色物质可以使整个培养菌落产生颜色变化 而颜色变化是鉴定和筛选的最直观有效的方法 工程菌及载体 基因工程菌为 半乳糖苷酶缺陷型菌株 这种宿主菌的染色体基因组中编码 半乳糖苷酶的基因突变 造成其编码的 半乳糖苷酶失去正常N段一个146个氨基酸的短肽 即 肽链 从而不具有生物活性 即无法作用于X gal产生蓝色物质 用于蓝白斑筛选的载体具有一段称为lacz 的基因 lacz 中包括 一段 半乳糖苷酶的启动子 编码 肽链的区段 一个多克隆位点 MCS 互补 缺陷株基因无法单独编码有活性的 半乳糖苷酶 但当菌体中含有带lacz 的质粒后 质粒lacz 基因编码的 肽链和菌株基因组表达的 端缺陷的 半乳糖苷酶突变体互补 具有与完整 半乳糖苷酶相同的作用X gal生成蓝色物质的能力 这种现象即 互补 操作中 添加IPTG 异丙基硫代 半乳糖苷 以激活lacz 中的 半乳糖苷酶的启动子 在含有X gal的固体平板培养基中菌落呈现蓝色 以上是携带空载体的菌株产生的表型 当外源DNA 即目的片段 与含lacz 的载体连接时 会插入进MCS 使 肽链读码框破坏 这种重组质粒不再表达 肽链 将它导入宿主缺陷菌株则无 互补作用 不产生活性 半乳糖苷酶 即不可分解培养基中的X gal产生蓝色 培养表型即呈现白色菌落 实验中 通常蓝白筛选是与抗性筛选一同使用的 含X gal的平板培养基中同时含有一种或多种载体所携带抗性相对应的抗生素 这样 一次筛选可以判断出 未转化的菌不具有抗性 不生长 转化了空载体 即未重组质粒的菌 长成蓝色菌落 转化了重组质粒的菌 即目的重组菌 长成白色菌落 酵母基因工程 利用重组酵母生产乙肝疫苗由乙型肝炎病毒 HBV 感染引起的急慢性乙型肝炎是一种严重的传染病 每年约有200万病人死亡 并有3亿人成为HBV携带者 其中相当一部分人可能转化为肝硬化或肝癌患者 目前对乙型肝炎病毒还没有一种有效的治疗药物 因此高纯度乙型疫苗的生产对预防病毒感染具有重大的社会效益 而利用重组酵母大规模生产乙型疫苗为其广泛应用提供了可靠的保证 产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母 整合型重组巴斯德毕赤酵母的构建 PARS2 BglII 5 AOX1 HBsAg PHIS4 3 AOX1 BglII pBSAG151 11kb BglII 5 AOX1 HBsAg PHIS4 3 AOX1 his 的转化子 重组分子 转化his 的受体细胞 染色体DNA 重组菌首先在含有甘油的培养基中培养 待甘油耗尽后 加入甲醇诱导乙肝病毒的表面抗原多肽 HBsAg 表达 最终S蛋白的产量可达细胞可溶性蛋白总量的3 在大规模的生产过程中 巴斯德毕赤酵母工程菌在一个240L的发酵罐中培养 最终可获得90克22nm的HBsAg颗粒 足够制成900万份乙肝疫苗