第二章 工业用微生物菌种.ppt

林心萍E mail yingchaer 发酵工程 FermentationEngineering 大连工业大学食品学院 1 第二章 发酵工业菌种 2 微生物工程工业生产水平的三个决定要素 生产菌种的性能发酵和提取工艺条件生产设备 获得优良的生产菌种是实现高水平微生物工程工业生产的第一环节 3 本章内容 一 常用的工业微生物二 发酵工业菌种筛选的原则与基本技术三 发酵工业菌种改良 4 一 常用的工业微生物 细菌醋杆菌属的醋化醋杆菌 弱氧化醋杆菌乳酸杆菌枯草杆菌丙酮丁醇梭菌大肠杆菌谷氨酸棒状杆菌 5 酵母菌酿酒酵母假丝酵母属产朊假丝酵母解脂假丝酵母热带假丝酵母毕赤酵母属 汉逊酵母属 一 常用的工业微生物 6 霉菌曲霉属米曲霉黑曲霉青霉属青霉菌 点青霉 产黄青霉桔青霉根霉属德氏根霉米根霉 小麦曲根霉红曲霉属紫红曲霉 一 常用的工业微生物 7 放线菌链霉菌属小单孢菌属地中海诺卡氏菌 一 常用的工业微生物 8 未可培养微生物 定义 指迄今所采用的微生物纯培养分离及培养方法还未获得纯培养的微生物 其在自然环境微生物群落中占有非常高的比例 约为99 研究方法模拟自然培养法 原位培养 培养条件优化 单细胞操作宏基因组分析法 9 10 未可培养微生物 Nature重大发现 新型抗生素或可解决细菌耐药性 许多现有的抗生素 包括青霉素 都是人类通过培养自然界中的微生物而被发现的 对应的细菌都能够在实验室培养 产生teixobactin的细菌是一种无法在实验室中培养的细菌 Slava将iChip埋在土壤中 环境中的营养分子会进入到iChip中 这使得细菌比在培养皿中更加能够茁壮成长 通常情况下 只有约1 的土壤微生物能够在实验室生长 iChip将百分比提高到了50 Teixobactin表现出了比万古霉素更好的抗菌效果 万古霉素是治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 MRSA 长期依赖的药物 最让人惊喜的是 这些病原菌无法对Teixobactin产生耐药性 本章内容 一 常用的工业微生物二 发酵工业菌种筛选的原则与基本技术三 发酵工业菌种改良 11 二 发酵工业菌种分离筛选原则与基本技术 一 发酵工业菌种筛选的总趋势与要求 二 分离筛选原理与技术 三 应用举例 12 1 菌种选择的总趋势 野生菌 变异菌自然选育 代谢控制育种诱发基因突变 基因重组的定向育种 13 2 菌种选择的要求 能在廉价原料制成的培养基上迅速生长 且生成的目的产物产量高 易于回收 生长速度和反应速度较快 发酵周期较短 培养条件易于控制 抗噬菌体及杂菌污染的能力强 14 2 菌种选择的要求 菌种不易变异退化 对放大设备的适应性强 菌种不是病原菌 不产生任何有害的生物活性物质和毒素 15 二 分离筛选原理与技术 1 分离筛选工作在实际中应用的几个方面2 新种分离筛选原理与技术 16 1 分离筛选工作在实际中应用的几个方面 从各种育种方法处理的微生物材料中分离筛选适于工业目的的优良菌株 从已知菌种和大自然中分离新菌株寻找新的发酵产品的产生菌 寻找老产品的新的优良菌株 从被污染的生产及科研用菌中分离目的菌 生产中长期使用的菌种的定期分离筛选 17 微生物的获得 自然界分离或者菌种保存机构购买从保藏机构获取菌种进行分离筛选两个好处 经济性指导性主要保藏机构 中国普通微生物菌种保藏管理中心 CGMCC 中国工业微生物菌种保藏管理中心 CICC ATCC AmericanTypeCultureCollection 美国典型菌种保藏中心 18 1 分离筛选工作在实际中应用的几个方面 2 新种分离筛选原理与技术 新种分离与筛选的步骤总述 含微生物样品的采集样品的预处理操作的基本方法分离方法的选择 19 新种分离与筛选的步骤 调查研究 包括资料查阅 试验方案设计含微生物样品的采集 如何使样品中含所需微生物的可能性大 样品预处理 如何在后续的操作中使这种可能性实现 菌种分离 20 根据目的菌株及其产物特点分选择性分离方法随机分离方法 定向筛选 选择压力 用筛选方案 检测系统进行间接分离 富集液体培养固体培养基条件培养 初筛 菌种纯化复筛 21 菌种纯化初步工艺条件摸索再复筛生产性能测试较优菌株1 3株保藏及进一步做生产试验某些必要试验和或作为育种的出发菌株毒性试验等 22 1 从复杂样本中采样 以土壤为例 土壤是微生物的王国 从土壤中几乎可以分离到任何所需的菌株 细菌 108 放线菌 107 霉菌 106 酵母菌 105 藻类 104 原生动物 103 含微生物样品的采集 比较复杂 应根据分离目的来进行灵活掌握采土样最好的土层是5 25cm微生物类群较多 生长旺盛 细菌 放线菌较多 霉菌 酵母菌生产多 根据土壤特点采样 考虑实际样品 土壤 的酸碱度和植被状况 偏碱的土壤 pH7 0 7 5 环境 适合于细菌 放线菌生长偏酸的土壤 pH7 0以下 环境下 霉菌 酵母菌生长旺盛番茄地或腐烂番茄堆积处有较多维生素C生产菌葡萄或其他果树根部附近土壤中酵母菌数量增多豆科植物根瘤菌 考虑实际样品的地理条件 工业微生物菌种 如抗生素产生菌 尤其是霉菌 酵母菌 大多从南方土壤中筛选出来 南方北方土壤原因 南方温度高 温暖季节长 雨水多 相对湿度高 植物种类多 植被覆盖面大 土壤有机质丰富 造成得天独厚的微生物生长环境 考虑实际样品的季节条件 冬季温度低 气候干燥 微生物生长缓慢 数量最少 春天随着气温的升高 微生物生长旺盛 数量逐渐增加春季往往雨水多 土壤含水量高 通气不良 7 10个月处在较高的温度和丰富的植被下 土壤中微生物数量比任何时候都多 秋季取样最好 2 根据微生物生理特点采样 森林土中有相当多枯枝落叶和腐烂的木头 富含纤维素 适合利用纤维素作碳源的纤维素酶产生菌生长 筛选产低温酶的微生物 可从冰窖 南极 深海等采样分离耐高渗透压酵母菌 可到甜果 蜜饯 甘蔗渣堆积处采样 肉类加工厂附近 饭店排污沟 易分离到蛋白酶和脂肪酶产生菌 面粉加工厂等场所易分离到产淀粉酶 糖化酶的菌 含微生物样品的采集 筛选高温酶产生菌通常从温泉 火山爆发处 堆肥等采样 油田附近的土壤中就容易筛选到利用碳氢化合物为碳源的菌株 2 根据微生物生理特点采样 含微生物样品的采集 塑料袋编号并记录地点 土壤质地 植被名称 时间及其他环境条件样品取回后应马上分离 以免微生物死亡路途遥远或者取样太多 选择性培养基做好试管斜面 含微生物样品的采集 3 采样方法 样品的预处理 目的 提高分离效率方法 物理方法 热处理 膜过滤法 离心法化学方法诱饵法 将固体基质加到待检的土壤或水中 待其菌落长成后再铺平板 31 32 操作的基本方法 使微生物在固体培养基平板上形成单个菌落的基本方法 稀释 操作的基本方法 33 1 稀释倒平板法 2 涂布平板法 操作较麻烦 对好氧菌 热敏感菌效果不好 使用较多的常规方法 但有时涂布不均匀 35 平板划线法 操作的基本方法 操作的基本方法 3 平板划线法 3 平板划线法 分离方法的选择 根据目的菌有无选择性特征来选择分离方法生长特征独特菌种的营养特征独特无选择性特征根据产物的特征进行随机分离 选择性分离 38 选择性分离 透明圈法 分离水解酶产生菌时采用较多 如蛋白酶 淀粉酶 脂肪酶 核酸酶等 在平板培养基中加入溶解性较差的底物 使培养基混浊 能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明圈 圈的大小初步反应菌株利用底物的能力 比如分离淀粉酶产生菌 淀粉作为碳源 例如 用此法分离产生碱性蛋白酶的芽孢杆菌 土壤经巴氏消毒 以减少不产芽孢的微生物 然后铺在pH8 9的琼脂培养基 含有均匀的不溶性蛋白质 表面 碱性蛋白酶产生菌能消化平板上的不溶性蛋白质 产生一透明圈 选择性分离 透明圈法 在选择培养基中加入碳酸钙 使平板呈混浊状 产酸菌能够把菌落周围的碳酸钙水解 形成清晰的透明圈 聚赖氨酸产生菌 带正电 加美兰 排斥呈现透明圈 选择性分离 透明圈法 透明圈的大小不能完全作为选择高产菌的依据 因为在深层培养中的产酶单位与平板上圈的大小之间并不完全成正比 但作为初筛的手段是有意义的 选择性分离 透明圈法 对于一些不易产生透明圈产物的产生菌 可在底物平板中加入指示剂或显色剂 使目的微生物菌落周围呈现变色圈 从而能被快速鉴别出来 选择性分离 变色圈法 44 选择性分离 变色圈法 例如 筛选果胶酶产生菌 用含0 2 果胶为唯一碳源的培养基平板 对含微生物样品进行分离 待菌落长成后 加入0 2 刚果红溶液染色4h 具有分解果胶能力的菌落周围便会出现绛红色水解圈 例如 分离解脂微生物 吐温为底物 尼罗红作指示剂 豆油作底物中性红 红 黄 6 8 8 0 指示菌落周围呈红色圈 甘油三丁酸酯为底物罗丹明B为指示剂荧光圈 45 选择性分离 生长圈法 通常用于分离筛选氨基酸 核苷酸和维生素的产生菌 将待检菌涂布于高浓度工具菌并缺少所需营养物的平板上进行培养 若某菌株能合成平板所需的营养物 在该菌株的菌落周围便会形成一个混浊的生长圈 如嘌呤营养缺陷型大肠杆菌与不含嘌呤的琼脂混合倒平板 在其上涂布含菌样品保温培养 周围出现生长圈的菌落即为嘌呤产生菌 只要是筛选微生物所需营养物的产生菌时 都可采用生长圈法 工具菌用相应的营养缺陷型菌株 由于得到所需营养 凡是目的微生物周围便会出现混浊的生长圈 选择性分离 生长圈法 47 选择性分离 抑菌圈法 常用于抗生素产生菌的分离筛选 工具菌采用抗生素的敏感菌 据估计 筛选1万个菌株才能得到1株有用的抗生素产生菌 因此 设计一个准确 快速的筛选模型十分重要 抑菌圈法是常用的初筛方法 若被检菌能分泌某些抑制菌生长的物质 如抗生素等 便会在该菌落周围形成工具菌不能生长的抑菌圈 选择性分离 抑菌圈法 分离方法的选择 根据目的菌有无选择性特征来选择分离方法生长特征独特菌种的营养特征独特无选择性特征根据产物的特征进行随机分离 选择性分离 49 菌种的营养特征独特控制底物浓度控制培养基酸碱度添加抑制剂控制培养温度控制通气条件 50 分离方法的选择 A B S0 基质浓度对A B两种菌的比生长速率 的影响当SS0时 富集什么菌株 51 控制底物浓度进行筛选 随机分离原理与技术 从产物入手 通过设计高产培养基和建立快速灵敏专一的筛选方法 从随机分离的菌落中筛选出所需的目的菌 技术关键 产物合成条件的选择与控制及相应筛选方法的确定 随机分离技术举例抗生素产生菌的筛选药理活性化合物产生菌的筛选生长因子产生菌的筛选多糖产生菌的筛选 52 氨基酸产生菌的筛选 样品预处理初筛 除真菌 在分离平板上生长获得多个单菌落复印平板 copy法 平板培养 其中有产生氨基酸的菌落分泌氨基酸对应到copy前相应u v线杀死长好的菌落位置 找到目的菌落再铺上一层含营养缺陷型试验菌的琼脂培养后产氨基酸菌落周围有生长圈 目的菌落进行液体培养 对产物进行定量测定 筛选产物含量高的菌株 53 细菌分离 以乳酸菌为例 取未成熟的酱醪样品1g至无菌磨口瓶中加麦芽汁至瓶口处 封塞 25 培养24 48h培养基中长出绢丝状波动物 镜检杆状 阳性染色初步断定乳酸菌用选择性培养基分批富集培养2 3代稀释分离法分离单菌落 培养基为含麦芽汁 CaCO3的琼脂培养基根据透明圈挑选菌落性能测定 镜检杆状 染色阳性 乳酸纸层析鉴定 Rf值定性 有机酸呈黄斑点 乳酸生成量测定 滴定法 54 放线菌的分离 以产链霉素菌种的分离为例 从退化菌种中筛选 取工业发酵液 含孢子 样品1环放入带玻璃珠的装有10ml无菌水的小三角瓶中 摇匀采用稀释法制平板 获取单菌落斜面保藏高产菌恢复根据高产菌的特点 选择目的菌落放大培养 发酵液性能测试 筛选模型 形态依据 55 真菌的分离筛选 以啤酒酵母的分离为例 取发酵液少许以10倍稀释成10 1 10 7稀释分离法取0 1ml加入固体培养基铺平皿 2 在麦芽汁固体培养基上 25 培养48 72h形态筛选根据正常株特点进行挑选 接种斜面备用纯化 采用平板分离法进一步纯化 至少反复三次 生成子囊孢子速度测定 发酵力测定性能测定 热死温度测定 凝集力测定 双乙酰含量测定 56 本章内容 一 常用的工业微生物二 发酵工业菌种筛选的原则与基本技术三 发酵工业菌种改良 57 菌种选育改良的具体目标 提高目标产物的产量提高目标产物的纯度 减少副产物改良菌种性状 改善发酵过程改变生物合成途径 以获得高产的新产品 58 发酵工业菌种改良方法 常规育种 诱变育种 杂交育种基因工程育种代谢工程育种 59 育种过程 包括下列3个步骤 1 在不影响菌种活力的前提下 有益基因型的引入 2 希望基因型的选出 3 改良菌种的评价 包括实验规模和工业生产规模 一 诱变育种 以微生物的自然变异作为基础的生产选种的机率并不很高 一个基因的自然突变频率仅10 6 10 10左右 诱变育种 以诱发突变为基础的育种 是迄今为止国内外提高菌种产量 性能的主要手段 1 诱变剂和诱变处理 物理诱变剂 射线如紫外线 X 射线 射线 快中子 物理因素中目前使用得最方便而且十分有效的是紫外线 许多高产菌株的选育都用过紫外线 对于一般实验室 中小型工厂都适用 也很安全 其他的几种射线都是电离性质的 有一定的穿透力 一般都由专业人员在专门的设备中使用 否则有一定危险性 化学诱变剂 化学因子如碱基类似物 5 氟尿嘧啶 烷化剂等 化学诱变剂中使用最多 最有效的是烷化剂 使用化学诱变剂的优缺点 1 大多数情况下 就突变数量而言 要比电离辐射更有效 2 化学诱变剂是很经济的 因为只需要少量的合适的诱变剂 设备是实验室的一般玻璃器皿 一个蒸气罩 而用电离辐射工作时 设备费用大 并要注意安全性 3 大部分诱变剂是致癌剂 所以在使用中必须非常谨慎 要避免化学诱变剂与皮肤接触 且切勿吸入其蒸气 有人对某些诱变剂极其敏感 甚至未直接接触就会过敏 这就更要当心 2 诱变剂的选择 1 碱基类似物和羟胺具有很高的特异性 但很少使用 回复突变率高 效果不大 2 亚硝酸和烷化剂应用的范围较广 造成的遗传损伤较多 其中亚硝基胍和甲基磺酸乙酯常被称为 超诱变剂 甲基磺酸乙酯 EMS 是毒性最小的诱变剂之一 3 吖啶类诱变剂可以造成生化代谢途径的完全中断 4 紫外线仍十分有效 电离辐射是造成染色体巨大损伤的最好诱变剂 它能造成不可回复的缺突变 但它可能影响邻近基因的性能 3 诱变育种步骤 出发菌株的选择处理菌悬液的制备诱变处理中间培养分离和筛选 1 出发菌株的选择 1 自然界新分离的野生型菌株 对诱变处理较敏感 容易达到好的效果 2 在生产中经生产选种得到的菌株与野生型较相像 也是良好的出发菌株 3 每次诱变处理都有一定提高的菌株 往往多次诱变能积累较多的提高 4 出发菌株开始时可以同时选2 3株 在处理比较后 将更适合的出发菌株留作继续诱变 5 要尽量选择单倍体细胞 单核或核少的多细胞体来作出发诱变细胞 这是由于变异性状大部分是隐性的 特别是高产基因 6 根据采用的诱变剂或根据细胞生理状态或诱变谱选择诱变剂 因为同一诱变剂的重复处理会使细胞产生抗性 使诱变效果下降 有的诱变剂是作用于营养细胞 就要选对数期的细胞 有的作用于休止期 就可选用孢子 2 处理菌悬液的制备 这一步骤的关键是制备单细胞和单孢子状态的 活力类似的菌悬液 为此要进行合适培养基的培养 并要离心 洗涤 过滤 3 诱变处理 根据前面有关诱变剂及诱变处理的介绍 结合诱变对象的实际 设计诱变处理方案 4 中间培养 由于在发生了突变尚未表现出来之前 有一个表现延迟的过程 即细胞内原有酶量的稀释过程 生理延迟 需3代以上的繁殖才能将突变性状表现出来 这个过程对今后的筛选和获得稳定菌株都是极为重要的 方法 让变异处理后细胞在液体培养基中培养几小时 以让细胞的遗传物质复制 让细胞繁殖几代 以得到纯的变异细胞 这样 隐性的变异就会显现出来 若不经液体培养基的中间培养 直接在平皿上分离就会出现变异和不变异细胞同时存在于一个菌落内的可能 形成混杂菌落 以致造成筛选结果的不稳定和将来的菌株退化 5 分离和筛选 筛选分初筛和复筛 初筛以迅速筛出大量的达到初步要求的分离菌落为目的 以量为主 复筛则是精选 以质为主 也就是以精确度为主 因此在具体方法上就有差异 例如 初筛可以在平皿上直接以菌落的代谢产物与某些染料或基质的作用形成的变色圈或透明圈的大小来挑取参加复筛者 而将90 的菌落淘汰 在数量减少后就要仔细比较参加复筛和再复筛的菌株 最后才能选得优秀菌株 在以后的复筛阶段 还应不断结合自然分离 纯化菌株 诱变育种举例 营养缺陷型的选育 营养缺陷型是指通过诱变而产生的缺乏合成某些营养物质如氨基酸 维生素和碱基等的能力 必须在其基本培养基中加入相应的营养成分才能正常生长的变异株 与营养缺陷型对应的是野生型 能满足野生型菌株正常生长的培养基称基本培养基 MM 在基本培养基中加入相应的营养成分的称补充培养基 SM 能满足各种营养缺陷型生长的称完全培养基 CM 如牛肉膏蛋白胨培养基 麦芽汁培养基等 营养缺陷型的用途 营养缺陷型在生产上和科学研究上用途很大 目前生产氨基酸 核苷酸的菌种都是各种类型的缺陷型 要研究代谢途径 育种技术都必须有营养缺陷型的菌株为材料 筛选营养缺陷型的步骤 诱变 物理 化学 淘汰野生型检出缺陷型确定生长谱 淘汰野生型 抗生素法 野生型能在MM中生长 而缺陷型不能 于是将诱变处理液在MM中培养短时让野生型生长 处于活化阶段 而缺陷型无法生长 仍处于休眠状态 由于细菌或酵母对一些抗生素敏感 于是就相应加入一定量的抗生素 结果活化状态的野生型就被杀死 保存了缺陷型 一般细菌可以采用青霉素 酵母可采用制霉菌素 例如ura 菌株的筛选 菌丝过滤法 对于霉菌 因孢子生长后会长出菌丝体 就可用滤纸过滤法将菌丝滤去 而缺陷型孢子却因未发芽而不能滤过 检出缺陷型 原理 在固体基本培养基和完全培养基上 生长情况完全不同 缺陷型在CM上生长良好 而在MM上则不生长 野生型都能生长 具体方法 影印法 点种法 影印法 点种法 也就是任意法 用接种针或牙签将CM上长出的菌落在MM和CM两副平板上接种 依次在相应位置点种 然后一起培养 观察其生长情况 此法结果明确 但工作量大 二 杂交育种 1 细菌杂交 在细菌中实现杂交的种类尚不多 主要是大肠杆菌 其他还有鼠伤寒沙门氏菌 铜绿假单胞菌 淋病奈氏球菌等 大肠杆菌中存着致育因子F 有F因子为F 没有F因子称F F因子存在于细胞中形式 游离状态 F 细胞 整合状态 即F因子插入胞核质的一定位置上 Hfr细胞 F因子有明显的感染性 大肠杆菌的接合 实质上是F因子的转移 所以F 和Hfr称供体菌 而F 称受体菌 85 2 酵母杂交育种技术 2 酵母杂交育种技术 一般而言 杂交育种运用了酵母的单双倍生活周期 将不同基因型和相对的交配型的单倍体细胞经诱导杂交而形成二倍体细胞 经筛选便可获得新的遗传性状 酵母的杂交方法有孢子杂交法 群体交配法 单倍体细胞杂交法和罕见交配法 就啤酒酵母而言 运用罕见交配法更易获得结果 87 3 原生质体育种 原生质体融合是通过人工方法 使遗传性状不同的两个细胞的原生质体发生融合 并产生重组子的过程 亦可称为 细胞融合 原生质体融合的基本过程 88 3 原生质体育种 89 3 原生质体育种 多用酶解法细菌 放线菌溶菌酶酵母菌蜗牛酶霉菌纤维素酶等 90 3 原生质体育种 大幅度提高亲本之间重组频率扩大重组的亲本范围原生质体融合时亲本整套染色体参与交换 遗传物质转移和重组性状较多 集中双亲优良性状机会更大可以和其它育种方法相结合 把由其他方法得到的优良性状通过原生质体融合再组合到一个单株中 91 3 原生质体育种 例子 酿酒酵母 可利用葡萄糖生产酒精 但不能利用淀粉和糊精 糖化酵母能利用淀粉和糊精 但产酒精能力很差 二者融合 获得了可利用淀粉和糊精生产酒精的融合子 三 基因工程育种 1973年 美国斯坦福大学的学者首次成功地实现了DNA体外重新连接及转化实验 宣告基因工程学的诞生基因工程育种 是用人为的方法获得目的基因 将该目的基因与作为载体的DNA分子体外连接成重组DNA 然后导入受体细胞中 以改变受体细胞原来的遗传特性 获得新的品种 产生新的产物 基因工程菌的构建主要包括 目的基因的获得载体的选择目的基因与载体的外在连接重组DNA分子导入宿主细胞筛选 鉴定阳性重组子产物的表达 94 四 代谢工程育种 利用多基因重组技术有目的地对细胞代谢途径进行修饰 改造 改变细胞特性 并与细胞基因调控 代谢调控及生化工程相结合 为实现构建新的代谢途径 生产特定目的产物而发展起来的一个新的学科领域 又称作途径工程 是多基因的基因工程 代谢工程发展基础 相依网络 代谢网络中各主节点集中于产物 为了避免中间物的过量积累 各分支的代谢流都必须保持平衡 各分支的分流相等 各节点的重要性相同 独立网络 代谢网络的主节点不集中 可以通过对代谢的修饰来影响产物的产量 其对代谢修饰的应答能力 取决于各节点的刚柔性及其位置 SIPS P BB1B2 相依网路 独立网路 代谢工程育种思路 1 改变代谢流 改变分支代谢途径的流向 阻断有害代谢产物的合成 1 加速限速反应 2 改变分支代谢途径流向 提高代谢分支点的某一分支代谢途径酶系的活力 在与另外的分支代谢途径的竞争中占有优势 可以提高目的代谢末端产物的产量 3 构建代谢旁路 4 改变能量代谢途径 代谢工程育种思路 2 扩展代谢途径 1 在引入外源基因后 使原来的代谢途径向后延伸 产生新的末端代谢产物 2 使原来的代谢途径向前延伸 可以利用新的原料生物合成代谢末端产物 代谢工程育种思路 3 转移或构建新的代谢途径1 转移代谢途径 为生产某一新的化学结构的代谢产物 将催化某一代谢途径的基因组克隆到另一不具备该种能力的微生物中 达到代谢途径转移的目的 使之具备生产该种新化合物的能力 2 构建新的代谢途径 利用基因工程手段 通过克隆少数基因将原来细胞中无关的两条代谢途径桥连在一起 形成新的代谢途径 99 代谢途径构建演示 Lowyield 100 代谢工程到合成生物学MetabolicEngineeringtoSyntheticBiology NatBiotechnol 2011 27 693 695 101 合成生物学 合成生物学 就是在基因组技术为核心的生物技术基础上 以系统生物学思想为指导 综合化学物理技术和生物信息技术 利用基因和基因组的基本要素及其组合 设计 改造 重建或制造生物分子 生物体部件 生物反应系统 代谢途径与过程 乃至整个生命活动的细胞和生物个体 合成生物学里程碑 102 DanielG GibsonandJ CraigVenterTheJ CraigVenterInstitute Science 2008 319 1215 1220Science 2009 325 1693 1696Science 2010 329 52 56 先将蕈状支原体的DNA 脱氧核糖核酸 注入 山羊支原体 中 最后新的支原体终于开始自我繁殖 成为世界首个 人造生命 103 CRISPR Cas CRISPR Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats 被称为规律成簇间隔短回文重复 实际上就是一种基因编辑器 是细菌用以保护自身对抗病毒的一个系统 也是一种对付攻击者的基因武器 Science 2013 339 819 823 Science 2013 339 823 826 NatBiotechnol 2013 31 227 229 NatBiotechnol 2013 31 230 232 NatBiotechnol 2013 31 233 239 2013年明星 公司推出产品 104 1 1987年 就发现在E coli的alkalinephosphatase iap 基因附近有这样的重复序列存在 2 直到2002年 发现这样的序列在细菌和古菌中广泛存在 将其命名为CRISPR 它们的功能是未知的 尽管对它们进行了许多猜测 3 2005年 转折点出现 有人发现重复序列所间隔序列与噬菌体或质粒序列同源 暗示了这些序列可能与细菌免疫有关 4 2007年 研究报道CRISPR Cas系统可以提供噬菌体抗性 2008年 CRISPR可以限制质粒的转移 5 CRISPR Cas细菌免疫系统的机制被逐渐展开 6 2013 CRISPR Cas应用于基因组编辑与基因表达调控 CRISPR Cas bacterialimununesystem诺贝尔奖级别的发现 Annu Rev Genet 2011 45 273 97Annu Rev Biochem 2013 82 237 66Science2010327 167 170 CRISPR Cas9System 106 107 转基因安全性 CRISPR这个基因编辑神器可让科学家几乎能随心所欲地编辑目的基因 然而最近发现更不可思议的是 这种编辑后基因会发生高水平转移 即使和正常蚊子交配 产生的后代依然是纯种的 科学家制造出能传