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慢性心衰动物模型的制备及指标评定 方剂学李文佳2015 10 1 1 常用实验动物 小鼠大鼠兔子犬 2 CHF模型制备的方法 药物诱导性模型压力超负荷型模型容量超负荷型模型心脏快速起搏模型遗传性心衰模型 3 药物诱导性模型 4 阿霉素戊巴比妥钠异丙肾上腺素乙醇 5 阿霉素 简介 是一种广谱抗肿瘤化疗药物 对心脏组织有明显毒性 静注数小时或数日可造成剂量依赖性不可逆的心肌损害和心力衰竭 机制 其心肌毒性机制可能与部分自由基释放 线粒体损伤及代谢失衡有关 方法 1 腹腔注射法a 阿霉素每周1次4mg kg 持续给药6周 b 阿霉素每周3次2 5mg kg 间隔2周后 重复给药1周 2 尾静脉注射法阿霉素每周1次1mg kg 持续给药6周 优劣 1 腹腔注射法药物经膜吸收入血 易造成腹部积液 网膜肿胀受损等不良反应 影响心衰模型的评估 2 尾静脉注射简单 易行 重复性好 减少了对腹膜的影响 但其注射操作较难 易出现烂尾现象 6 戊巴比妥钠 简介 为中时作用的巴比妥类催眠药 作用时间可维持3 6小时 显效较快 用作催眠和麻醉前给药 亦可用于治疗癫痫和破伤风的痉挛 机制 负性肌力作用 严重抑制心肌收缩功能导致心衰 方法 恒流泵经输液管恒速输入2 戊巴比妥钠0 2ml kg min 当左心室内压上升最大速度下降到基础值的20 左右停输 当左心室内压上升最大速度有回升者 可予2 戊巴比妥钠0 1ml kg min 滴速维持 优劣 简便 重复性好 多用来建立急性心衰动物模型 不能反映临床病理变化 7 盐酸异丙肾上腺素 IPH 简介 为 受体激动剂 对 1和 2受体均有强大的激动作用 对 受体几无作用 用于治疗心源性或感染性休克 完全性房室传导阻滞 心搏骤停 机制 导致快速心率及心肌持续强烈收缩 产生广泛的心肌细胞坏死和纤维化 并导致心室重构 最终导致心力衰竭 方法 腹腔注射IPH15mg kg d 连续7天 优劣 制作简单 创伤性小 易于重复并且诱导时间短 适用于以心肌病变为原发病的心力衰竭研究 但发病机制尚不明确 与临床常见心力衰竭差异较大 故较少应用 8 乙醇 简介 乙醇中毒严重者可引起心血管损害 最终导致心力衰竭 机制 乙醇及其代谢物乙醛 脂肪酸乙烷酯在血液中沉积可诱导心肌细胞凋亡 明显减低心肌收缩力及心房自律性 抑制左心房静息后增强效应 延长左心房功能不应期 方法 以0 1g kg min 恒速静脉滴注低浓度 0 2g ml 乙醇 40 8 13 6 min后诱导家兔心衰 优劣 诱导时间较长 但恒速静脉注射可控性好 能够较好的复制急性乙醇中毒引起的心血管疾病 9 压力超负荷型模型 10 实验性高血压动物主动脉狭窄肺动脉狭窄 11 实验性高血压动物 Ddhl盐敏感性高血压大鼠饮用生理盐水条件下 首先出现血压升高 8周后发生心肌肥厚 进一步出现心脏扩大 15 20周出现心衰症状 自发性高血压大鼠 SHR SHR为遗传性高血压大鼠 有明显的左心室肥厚 LVH 在1年内心功能保持正常 18 24个月后发展成心衰 出现心功能障碍 左心室内的纤维化细胞和凋亡细胞增多 肾血管性高血压大鼠在盐负荷下形成心衰 动物易得廉价 但心衰所需时间长 12 主动脉狭窄 方法 分离主动脉上升支或肾动脉分支以上的腹主动脉 用线结扎或套上压缩环使主动脉口径缩小 原理 左心室血液流出道受阻 左室后负荷加重 先出现代偿性心肌肥厚 部分动物发展成心衰 13 肺动脉狭窄 方法 分离肺动脉用线结扎或套上压缩环使主动脉口径缩小 原理 右心排血受阻 右室负荷增加 体循环回心血液不能完全进去肺循环 出现右心衰竭 发生内脏器官充血和全身水肿等症状 14 容量超负荷型模型 15 动静脉瘘二尖瓣关闭不全主动脉瓣关闭不全下腔静脉狭窄 16 动 静脉瘘 方法 肾动脉以下的腹主动脉与下腔静脉间造瘘 原理 体循环动脉血液直接进入静脉 形成回心血量增加 心脏前负荷加重 从而使左心室舒张末容积及压力增高 心排血量增加 造成高心排出量心衰 17 二尖瓣关闭不全 方法 切断二尖瓣腱索或用带气囊的塑料管破坏二尖瓣引起二尖瓣关闭不全 原理 左心室收缩时 血射入主动脉的同时一部分反流至左心房 致左心室排出量降低 左心房血量增多 压力增高 逐渐产生左心房代偿性扩大增厚 左心室舒张时 左心室充盈量增多 负荷加重 导致心室逐渐肥厚增大 逐渐形成左心衰 18 主动脉瓣关闭不全 方法 在麻醉条件下 将塑料导管从颈动脉插至主动脉瓣尖端 多次拉动导管 以损伤主动脉瓣 当血压下降至40mmHg 表明主动脉已经被破坏 出现主动脉血反流 原理 舒张期血液自主动脉反流至左心室 导致左心室充盈过度 使左心室舒张期容量负荷过重 左心室逐渐扩张肥厚 最终导致左心衰 19 下腔静脉狭窄 缩窄犬下腔静脉 造成静脉回心血量减少 形成HF 该模型适用于研究HF时神经内分泌系统改变 20 心脏快速起搏模型 21 方法 a 在无菌条件下 将起搏器放置在两肩胛骨之间的皮下 起搏电极从右颈静脉插至右心室尖部 b 心外膜起搏 即将电极缝在右心室或左心室尖部心外膜下进行起搏 原理 心脏快速起搏 血流动力学发生严重紊乱 心肌供血减少 心肌收缩力降低 形成失代偿性心衰 22 心肌梗塞后模型 23 冠状动脉结扎法冠状动脉微栓子注入法 24 冠状动脉结扎法 方法 通常结扎左前降支或回旋支冠状动脉 亦有使用多处结扎法 即同时或先后结扎几处的冠状动脉分支 形成一个梗塞区域或采用一种遇水膨胀的纤维素环套在欲要闭塞的冠状动脉上 术后2周可将冠状动脉逐渐闭塞 原理 左室逐渐扩大 出现心功能不全 心排出量 左室射血分数及左室压力最大上升速度均下降 左室舒张末期压力升高 此种模型多采用哺乳动物 25 冠脉内微栓子注入法 方法 早期多采用油质 石松子抱或汞等弥散性冠状动脉微栓塞或选择性冠状动脉栓塞 近年来多采用塑料微球及明胶海绵法 常以某支冠状动脉为目标 通过导管技术输入微粒样或小球类异物 以其数量的多少或球体的大小 可致不同范围的梗塞区 需多次冠脉内注射 一般需3 6周形成HF 特点 该种模型多适用于大动物 克服了以往开胸结扎法造成创伤大 死亡率高的缺点 手术创伤相对小 定位准确 实验动物较少出现生理紊乱 死亡率低 26 遗传型和转基因型模型 27 遗传型 SH HF大鼠同种交配18个月发生的SHR 有facp基因的大鼠发病较早 这些大鼠的血浆肾素活性 ANP和醛固酮水平随鼠龄逐渐增高 血浆肾素活性与心肌肥厚独立相关 28 基因敲除法 基因打靶断裂小鼠肌肉LIM蛋白是一种新的HF模型 MLP敲除的纯合子小鼠易发生扩张型心肌病 并有心肌肥厚 间质细胞增殖和纤维化 成年小鼠有与人类HF近似的血流动力学和临床体征 29 转基因法 采用转基因技术建立的HF小鼠模型对研究HF相关基因改变起到了重要作用 研究发现 基因打靶断裂小鼠肌肉LIM蛋白 MLP 是一种新的HF模型 血清应答因子 serumresponsefactor SRF 不足小鼠 TNF1 6小鼠可能为可诱导HF模型 30 离体法 乏氧灌流使心脏缺氧 结扎冠脉或停灌而使心肌缺血 或用异丙肾上腺等药物损害心肌等都可使体外心脏心室功能最终处于HF状态 多用于评价强心药物以及某些影响心肌代谢的药物 31 细菌或病毒性心肌炎HF模型 Grandel等采用葡萄球菌毒素灌注离体雄性大鼠心脏 导致冠状动脉灌注压增高 心肌收缩力下降 水肿形成 也有接种脑心肌炎变异株诱发心肌炎 急性期过后发生充血性 接种后一天病毒血症阶段出现心肌细胞坏死 双心室扩张和充血性的体征 心肌功能改变和神经内分泌活化 32 CHF判断指标 行为体征观察初体重和终末体重测量心重及心体比心功能测定血清酶学指标心 肝 肺病理学光镜观察心肌病理学电镜观察 33 行为体征观察 每天早 中 晚观察大鼠的精神状态 活动情况 皮毛变化 饮食情况及呼吸频率 CHF体征 精神状态差 眼睑分泌物增多 活动能力下降 活动逐渐减少 进食减少 被毛松软 脱毛 呼吸加快 体温下降 喜欢聚团等出现了生命体征发生变化的现象 34 初体重和终末体重测量 用天平分别称量实验前1d 初重 和末次给药24h后取材时体重 终重 CHF组与正常组比 终体重明显减轻 差异有统计意义 P 0 05 35 心重及心体比 取材时断头处死 打开胸腔观察心脏收缩情况及心脏大小 并拍照 分别取心 肝及肺 用预冷生理盐水冲洗 吸干 分别称其全量 并分别计算其与初重和终重的比 CHF组显著大于正常组 P 0 01 说明CHF组比正常组心脏相对增重 36 心功能测定 分离右颈总动脉切开后插入直径1mm且有1 肝素的心导管 接BL 4205生物机能分析系统 缓慢推进同时观测动脉压 描记记录血压曲线 再继续插入 使其通过主动脉瓣进入左心室 描记记录左心室内压 心脏舒张期左室内压变化最大速率及心率 与正常组相比CHF模型组大鼠收缩与舒张功能明显障碍 左心室内压 心脏舒张期左室内压变化最大速率及心率 显著低于正常组 左心室收缩和舒张压差变小 而脉压差增大 37 血清酶学指标 肌钙蛋白I cTnI 肌酸激酶同工酶 CK一MB 谷草转氨酶 AST 谷丙转氨酶 ALT 乳酸脱氢酶 LDH 肌酸激酶 C均有不同程度升高 38 心 肺 肝脏病理学光镜观察 分别取部分左心室肌 肝脏及肺脏组织 以10 福尔马淋固定 常规石蜡切片 HE染色 光镜观察及拍片 39 心脏变化 正常组心肌细胞形态 胞质 间质及横 纵纹均正常 肌纤维排列整齐 胞质丰富均匀 而ADR至CHF模型组心肌呈波浪状 细胞水肿 轻度空泡变性 脂肪变性 部分心肌细胞肌浆凝聚 核固缩 横 纵纹不清 不同程度的炎症细胞浸润和间质水肿 甚至出血 40 肺脏变化 肺脏与正常组相比 ADR模型组肺组织明显水肿 肺间质可见大量红细胞渗出 坏死后转变为含铁血黄素 未见到较明显的肺巨噬细胞吞噬含铁血黄素而出现典型的心衰细胞 41 肝脏变化 肝脏与正常组相比 模型组肝血窦明显扩大 肝小叶细胞索断裂 门管区充血变大 小叶中央静脉周围组织有核溶解现象 42 心肌病理学电镜观察 新鲜心脏标本取心尖部1mm 大小组织块 放入3 戊二醛加1 5 多聚甲醛固定 磷酸缓冲液冲洗 切成50um厚的半薄切片 定位 然后 2