刚果红染色法1.doc

刚果红染色法： 常用的刚果红染色法有两种，一种是先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应，另一种是在倒平板时就加入刚果红。 方法一 在长出茵落的培养基上，覆盖质量浓度为1 mgmI。的CR溶液，1015 min后，倒去CR溶液，加入物质的量浓度为l molI。的NaCI溶液，15 min后倒掉NaCl溶液，此时，产生纤维素酶的茵落周围将会出现透明圈。 方法二 配制质量浓度为10 mgmI。的CR溶液，灭菌后，按照每200 mI。培养基加入1 mI。的比例加入CR溶液，混匀后倒平板。等培养基上长出茵落后，产生纤维素酶的菌落周围将会出现明显的透明圈。两种刚果红染色法的比较 刚果红在筛选纤维素分解菌上的应用已经有超过20年的历史，课本中给出了两种方法。方法一是传统的方法，缺点是操作繁琐，加入刚果红溶液会使菌落之间发生混杂；其优点是这样显示出的颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用。方法二的优点是操作简便，不存在菌落混杂问题，缺点是由于在纤维素粉和琼脂、土豆汁中都含有淀粉类物质，可以使能够产生淀粉酶的微生物出现假阳性反应。但这种只产生淀粉酶的微生物产生的透明圈较为模糊，因为培养基中纤维素占主要地位，因此可以与纤维素酶产生的透明圈相区分。方法二的另一缺点是：有些微生物具有降解色素的能力，它们在长时间培养过程中会降解刚果红而形成明显的透明圈，与纤维素分解菌不易区分。维素酶（CMC）活性检验方法1 原理 纤维素酶在一定的温度和pH条件下，水解羧甲基纤维素钠释放出还原性糖（以葡萄糖计）。在碱性、煮沸条件下，能与3，5二硝基水杨酸起显色反应，其颜色的深浅与还原糖的含量成正比。在550nm下测定其吸光度，可以计算出还原糖的量，从而得出纤维素酶的活力。2 活性单位 1g固体酶粉（1 ml液体酶）在500.5 PH5.0条件下，每分钟水解底物产生1g葡萄糖所需酶液的量定义为一个CMC酶活性单位。3 仪器与设备3.1 分光光度计（应符合GB9721的有关规定）3.2 恒温水浴锅3.3 电热鼓风干燥箱3.4 分析天平（感量0.1mg）3.5 电冰箱3.6 酸度计（精度0.01pH）3.7 定时钟或秒表4 试剂和溶液（若未特别说明均为分析纯：所用水为蒸馏水或去离子水）4.1 醋酸醋酸钠缓冲液（PH=5.0） 甲液：量去冰醋酸6ml，用水定容至1000ml，配成0.1M醋酸溶液。 乙液：称去8.2g醋酸钠，用水定容至1000ml，配成0.1M醋酸钠溶液。 应用液：取甲液三份，乙液七份混合，用PH计矫正至PH为5.00.05低温冷藏备用。4.2 3，5二硝基水杨酸试剂（DNS） 甲液：取酒石酸钠182g，溶于500 ml水中，再称取重蒸苯酚5 g、无水亚硫酸钠5 g溶于其中。 乙液：取氢氧化钠20.8 g溶于260 ml水中，再加入3，5二硝基水杨酸6 g。 将甲液和乙液倒入棕色试剂瓶混合，再加入240 ml水暗处放一周后使用。4.3 1%（W/V）羧甲基纤维素钠溶液 准确称取1.0000g羧甲基纤维素钠溶于100 ml PH=5.0醋酸醋酸钠缓冲液中配制成1%羧甲基纤维素钠溶液。4.4 1%（W/V）葡萄糖标准储备液 葡萄糖在802烘箱中烘至恒重，准确称取1.0000g溶解并定溶于100ml容量瓶中，置于4冰箱内备用，备用期为三天，必要时加叠氮化钠防腐。4.4.1 葡萄糖标准应用液 分别吸取葡萄糖标准储备液，0.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00ml于50ml容量瓶中，用水定溶于刻度。5 分析步骤5.1 标准曲线的制作 按表 1规定的量，分别吸取葡萄糖标准应用液、缓冲液和DNS试剂于各管中摇匀，将各管同时置于沸水浴中反应10分钟，取出后用冷水冷却至室温后，定溶于内直径为15mm的15ml刻度试管中摇匀，再用1cm比色杯，在分光光度计550nm波长处测吸光度，以葡萄糖的量为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，三次重复实验的均值获得线性回归方程，线性回归系数（r）应在0.9996以上方可使用（否则重新操作）。每次新配DNS试剂、更换分光光度计或更换分光光度计部件，都应重做标准曲线。1 葡萄糖标准曲线管号葡萄糖标准应用液醋酸醋酸钠缓冲液（ml）DNS试剂（ml）浓度（mg/ml）吸取量（ml）000.501.52.010.40.501.52.020.80.501.52.031.20.501.52.041.60.501.52.052.00.501.52.05.2 样品的测定5.2.1 待测酶液的置备 称取2g固体酶粉，精确至0.1mg（或用2ml移液管，准确移取2ml液体酶样）用水溶解，准确稀释定溶，（使试样液与空白液的吸光度之差在0.30.6范围内）待测。5.2.2 操作步骤 取4支内直径15mm的15ml的刻度试管，分别加入稀释酶液0.5ml，取其中3支作为测定管，分别加入1.5ml p H 5.0的1%CMC溶液，另一支作为空白管加入2mlDNS溶液，共同在500.5水浴30分钟，三支测定管分别加入2mlDNS溶液，空白管加入1.5ml p H 5.0的1%CMC溶液，在沸水浴中反应10分钟，冷却后定溶至15ml，以空白管调零，在分光光度计550nm处测吸光度。5.2.3 酶活的计算： 酶活= An10000.530式中： A 根据吸光度在标准曲线上，查得的还原糖的量（mg） n 酶液的稀释倍数