高速逆流色谱技术 综述.doc

高速逆流色谱技术1.概述高速逆流色谱（high-speed counter current chromatography，简称 HSCCC），是20世纪70年代由美国国立卫生院（National Institute of Health，简称NIH）Ito博士首创，并且在最近10年之内发展迅速，是一种可在短时间内实现高效分离和制备的新型液-液分配色谱技术，这项技术可以达到几千个理论塔板数的。它具有操作简单易行、应用范围很广、无需固体载体、产品纯度高、适用于制备型分离等特点。自1982年第一台仪器问世，就开始了HSCCC的现代化进程。HSCCC用于天然药物化学成分的分离始于1985年，到1989年达到一个高潮。自2000年9月起国际逆流研究领域每隔2年举行一次世界逆流色谱学术会议。近几年, 人们对健康的认识越来越深刻, 更多的人追求天然绿色的健康理念, 故HSCCC 作为一种对提取物污染小的制备技术, 它的应用越来越受到了人们的关注。鉴于HSCCC的显著特点, 此项技术已被应用于生化、生物工程、医药、天然产物化学、有机合成、环境分析、食品、地质、材料等领域。目前,HSCCC已从制备型发展到了分析型, 甚至是微量分析型, 应用范围也十分广泛 2。高速逆流色谱技术在我国的应用较早, 技术水平在国际领域也处于领先地位。目前, 我国是世界上为数不多的高速逆流色谱仪生产国之一。我国的深圳同田生化技术有限公司是全球第一家多分离柱高速逆流色谱仪专业生产企业。公司拥有自主知识产权的高速逆流色谱专利技术, 现已研制并生产出TBE 系列分析型, 半制备型TBE 300，300A, 制备型TBE1000高速逆流色谱仪设备。2.基本原理高速逆流色谱技术(HSCCC)是一种不用任何同态载体的液-液色谱技术，其分离原理是进行分离纯化时，首先选择预先平衡好的两相溶剂中的一相为固定相, 并将其充满螺旋管柱, 然后使螺旋管柱在一定的转速下高速旋转, 同时以一定的流速将流动相泵入柱内。在体系达到流体动力学平衡后(即开始有流动相流出时), 将待分离的样品注入体系, 其中组分将依据其在两相中分配系数的不同实现分离。HSCCC分离效率高，产品纯度高；不存在载体对样品的吸附和污染；制备量大和溶剂消耗少；操作简单，能从极复杂的混合物中分离出特定的组分。高速逆流色谱仪器的装置如图1所示，它的公转轴水平设置，螺旋管柱距公转轴R处安装，两轴线平行。通过齿轮传动，使螺旋管柱实现在绕仪器中心轴线公转的同时，绕自转轴作相同方向相同角速度的自转。图1 高速逆流色谱仪器的装置示意图(引自： 齐元英孟兆玲 柳仁民等 高速逆流色谱技术及其在天然产物研究中的应用进展）在达到稳定的流体动力学平衡态后，柱中呈现两个绝然不同的区域：在靠近离心轴心大约有四分之一的区域，呈现两相的激烈混合(混合区)；其余区域两溶剂相分成两层(静置区)，较重的溶剂相在外部，较轻的溶剂相在内部，两相形成一个线状分界面。如图2所示：图2 高速逆流色谱螺旋管溶剂体系的区域分布图（引自李爱峰；刘宁宁；柳仁民等高速逆流色谱原理及其在天然产物化学成分分离中的应用研究进展 理化检验-化学分册 44(05)，95-98，（2008）图3为旋转一周混合区域的变化示意图，每一混合区域以与柱旋转速度相同的速度向柱端移动。当流动相恒速通过固定相时，两相溶剂都在反复进行混合和静置的分配过程，这一过程频率极高，当柱以800 r/min旋转时，频率超过13次/s，所以高速逆流色谱有相当高的分配效率。（引自李爱峰；刘宁宁；柳仁民等高速逆流色谱原理及其在天然产物化学成分分离中的应用研究进展 理化检验-化学分册 44(05)，95-98，（2008）3.仪器装置经过多年的开发应用，高速逆流色谱技术在天然产物以及生物活性样品的分离分析等领域取得了长足的进步，仪器设备硬件技术也得到了显著的发展。在逆流色谱技术发展的早期阶段，人们主要侧重于制备型仪器，近年来又对分析型HSCCC的应用报道逐渐增多。由于分析型HSCCC仪器具有体积小、分离速度快、溶剂消耗小等优点，因此在溶剂体系的快速优化、样品的小量制备以及分配系数的测定等方面得到了应用。下表比较分析了分析型仪器与制备型仪器及其操作系数：项目分析型制备型仪器类型J形多层螺旋管离心分析仪J形多层螺旋管离心分析仪螺旋管内径/mm1,到3-4柱体积/ml1.5-5050，最大到1000流速/(ml/min)0.1-12.0-10转速/(r/min)1500-40001200样品量1g-10mg10mg-10g高速逆流色谱技术的基本系统结构如图4所示，主要由输液泵、进样阀、螺旋管式离心分离管、检测器等组成。由于其操作压力并不高，用普通的中低压泵即可。进样可用带有样品环管的六通进样阀进样。样品的分离是在多层螺旋管式离心分离管内完成。检测器与液相色谱的检测器相同，如紫外检测器、蒸发光散射检测器、质谱检测器等。图4 HSCCC的基本系统结构(引自邓建朝；肖小华；李攻科等 高速逆流色谱仪器装置的研究进展，J 化学通报（印刷版）（2009）)图5为高速逆流色谱原型的横截面示意图，由一个电机带动一对齿形皮带轮，并由齿形皮带带动转动框架，转动框架将管柱支持件和配重组件对称地装在离心仪中心轴两边，在每一个支持件的轴线上都装有一个行星齿轮，与中心管上固定齿轮相啮合，这几个齿轮的尺寸和形状完全一样。为了保证仪器的机械稳定性，用一根短偶联管同轴地装设在转动框架的自由端，偶联管地另一头通过球轴承靠仪器的固定侧壁件支撑，从绕制在支持件上的螺旋管引起的一对流通管，先穿过支持件转轴地中心孔，再穿过偶联管的侧孔到达中心固定管地开口，然后穿过此固定管，从仪器地另一端引出。流通管外采用油脂润滑核塑料套管保护措施，以避免与金属件直接摩擦。图5 高速逆流色谱技术地横截面示意图(引自 李攻科、胡玉玲、阮贵华等，样品前处理仪器与装置，M 289,(2009) 图6为改进后的高速逆流色谱仪，这种仪器装有3个柱支持件，每个支持件上有两个齿轮，一个与装在中心离心轴上地行星齿轮相啮合，另一个与装在管支持件轴线上地齿轮相啮合，为避免流通管地打绞，管支持件轴相对于柱支持件做反向转动。 图6 改进后的高速逆流色谱仪(引自 李攻科、胡玉玲、阮贵华等，样品前处理仪器与装置，M 290,(2009)目前，国内外商品化的高速逆流色谱技术仪多为在单柱分离系统的改进型，主要可以分为以下几类：1、 GS系列 由北京新技术应用研究所张天佑教授领导的科研小组研制开发，是国内最早的色谱仪器。主要包括GS10A半制备型HSCCC仪（柱体积为210250 ml，最高转速为1000r/min，单分离柱加配重件结构）以及GS20分析型HSCCC仪（柱体积35ml，最高转速2000r/min），如图7所示图7 GS系列HSCCC仪(引自李攻科、胡玉玲、阮贵华等，样品前处理仪器与装置，M 301,(2009)2、 TBE系列 由深圳同田生物技术有限公司负责开发。包括TBE-300、TBE-300A以及TBE-1000三种类型，如图8所示.采用三串联柱分离系统，其中TBE-300以及TBE-300A的柱体积设计为300ml，PTFE管径为1.6mm转速为700-1000r/min，TBE-1000型柱体积为1000ml，PTFE管径为2.6mm，转速为400-600r/min。 图8 TBE系列HSCCC仪(引自网页/Product/detail/50753.html)3、 Quattro系列 由英国Brunel大学生物工程研究所lan Surherland教授领导的研究小组研究开发。该系列仪器设计了可以试想自我平衡的爽分离系统，且两分离柱留有多个聚四氟乙烯管抽头，用户可以根据自己的需要，串联或并联出不同的柱体积（150ml-3L），同时还可以进行两个不同的分离过程（如图9所示）图9 Quattro系列HSCCC仪(引自李攻科、胡玉玲、阮贵华等，样品前处理仪器与装置，M 301,(2009) 另外，美国Pharma Tech Rearch 公司生产逆流色谱技术仪器也已经有十几年的历史，如CCC-3000以及CCC-1000型仪器（如图10所示）均带有三分离柱串联的自平衡系统，柱体积分别为50ml和120-850ml。CCC-1000也可以根据需要配置不同的分离柱。美国Conway Centrichrom公司生产的DU-1000型，同样带有三分离柱，其三柱体积并不相同，分别为480ml、85 ml、245 ml，PTFE管内径为1.6mm。图10 Pharma Tech Rearch系列HSCCC仪(引自李攻科、胡玉玲、阮贵华等，样品前处理仪器与装置，M 301,(2009)4.应用HSCCC技术已经成为一种备受关注的新型分离纯化技术。由于其具有较好的分辨性、固定相不需要载体、进样量大、分离完全等优点，因此被广泛应用于生物医药、天然产物、食品和化妆品等诸多领域。我国还是继美国、日本之后最早开展逆流色谱应用的国家，也是世界上高速逆流色谱仪生产国之一，我国丰富的资源给HSCCC技术提供了广阔的平台。1 高速逆流色谱技术在天然产物领域中的应用1.1黄酮类化合物 黄酮类化学物质在自然界中广泛存在于多种植物，且对于治疗多种疾病有着重要的作用，是一类比较重要的植物化学成分。现已成功应用HSCCC 技术分离提纯该类化合物的对照品。 常用的分离黄酮类化合物的溶剂系统为氯仿-甲醇-水（4:3:2），例如潘霞等以芦荟全叶为原料，经过一系列的预处理手段获得芦荟色酮粗提物，采用氯仿-甲醇-水(4:3:2)混合溶液和二氯甲烷 -甲醇-水(5:4:2)混合溶液为溶剂分离系统，经过两步HSCCC分离纯化出纯度在95%以上的芦荟色酮单体。通过紫外检测、快原子轰击质谱及核磁共振等方法的结构分析鉴定证实分离所得物质为肉桂酰基-C-葡萄糖苷芦荟色酮。Yang F Q等用该体系成功分离了沙棘中的茨非醇。 马晓丰等采用HSCCC法，以正己烷-氯仿-甲醇-水(1.5:3:3:2)组成的二相系统对黄芪的醋酸乙酯粗提物进行了分离纯化，分离出的毛蕊异黄酮纯度可达95%以上，并可以初步纯化芒柄花素；然后用正己烷-氯仿-甲醇-水 (4:4:5:4)组成的系统进一步纯化芒柄花素，其纯度达95以上。Du Q Z以正己烷-醋酸乙酯-正丁醇-甲醇-醋酸-水(1:2:1:1:5:1)为溶剂分离了大豆中的黄豆苷、染料木苷，以正己烷-醋酸乙酯 -甲醇-水(1:3:2:4)为溶剂分离了Ampelopsis grossedentata中的（+）二氢杨梅黄酮。 1.2生物碱 大多数的生物碱都具有较活泼的生物活性，故生物碱的HSCCC提取文献报道较多。较常用的溶剂系统主要是氯仿-甲醇-酸性改性剂体系。蒋凯等采用HSCCC分离纯化黄花乌头块根中的生物碱类化学成分，其溶剂系统采用氯仿-甲醇 -0.2 molL-1盐酸（10:3:3），从黄花乌头块根中一次性分离得到8个化合物，其中化合物13- diacetyl-14-hydroxyhetisine为新化合物，命名为关附未素（Guanfubase R）。洪波等采用HSC- CC对附子中的化学成分进行研究，分离得到了 15-羟基新乌碱单体，溶剂系统为氯仿-甲醇-0.3 molL-1盐酸（4:3:2）。颜继忠等以氯仿-甲醇-0.2 molL-1盐酸(2:1:1)为溶剂体系，用HSCCC成功分离出金果榄中的巴马亭成分，经测定组分纯度大于99.6%，并由IR、1H- NMR和MS确定结构。Fuquan Y等利用HSCCC 以氯仿-甲醇-0.3 molL-1盐酸（4:1.5:2）为溶剂系统，从乌头的总生物碱粗提物中分离出高乌碱、N-去乙酰基高乌碱。 1.3有机酸 有机酸类是分子结构中含有羧基的一类化合物，在中草药的叶、根特别是果实中广泛分布，常见植物中的有机酸有脂肪族的一元、二元、多元羧酸，如酒石酸、草酸、苹果酸、构椽酸、抗坏血酸（即维生素C）等，亦有芳香族有机酸如苯甲酸、水杨酸、咖啡酸等。王凤美等采用HSCCC，以正己烷 -醋酸乙酯-水-甲醇(1.5:5:5:1.5)为溶剂系统分离纯化丹参水溶性成分丹酚酸类物质，结果一次分离可制备63.4mg丹酚酸B，其纯度为98.6%。该方法可作为高纯度丹酚酸B化学对照品的制备分离方法。黄健光等以正己烷-醋酸乙酯-甲醇 -水(7:3:6:4)为溶剂系统，成功分离了邻苯二酚和对苯二酚这一对同分异构体。孙爱玲等建立了HSCCC分离制备厚朴的有效成分厚朴酚与和厚朴酚的新方法，溶剂系统为石油醚-醋酸乙酯-甲醇-1%醋酸(5:5:7:3)。从l00mg厚朴粗提物制得和厚朴酚33.3mg，厚朴酚19.5 mg，经HPLC分析，纯度均大于99.5%，其化学结构由1H-NMR和 13C-NMR鉴定。Lu Haitao等应用正丁醇-冰醋酸-水(4:1:5)系统从金银花中分离得到绿原酸。 1.4蒽醌类及其他 陈存社等经过分析得出，用氯仿-甲醇- 丙酮-水(9:8:1:8)为溶剂系统分离纯化芦荟有效成分蒽醌类物质芦荟大黄素和芦荟大黄素苷的效果最佳。袁黎明等对芦荟的乙醇粗提物在不同的溶剂系统比例下进行了分离，当采用氯仿-甲醇-水 (4:3.8:2)时，分离结果最好。王春燕等应用 HSCCC法，以溶剂系统氯仿-甲醇-水 (9:10.5:8)的上相为固定相，下相为流动相，从芦荟生药中一次性分离得到芦荟苷（纯度 99.99%）和芦荟大黄素（纯度95.83%）。实验中还分离得到一个未知物，其薄层色谱鉴别与芦荟苷一致，经HPLC测定其纯度为99.26%，是否为芦荟苷的异构体，有待进一步研究。Yang F Q等用氯仿-甲醇-水(4:3.8:2)分离了虎杖中的白藜芦醇和白藜芦醇苷。Weiduo Si等以正己烷- 醋酸乙酯-甲醇-水（2:8:2:8）为溶剂，用HSC- CC技术对绿茶粗提物中的杀菌成分进行了分离，得到两个活性成分。Qizhen Du等利用HSCCC技术从越桔粗提物中提取花青素，从500mg越桔粗提物得到cyanidin-3-O-sambubioside和delphini- din3-O-sambubioside提纯品77 mg和130mg,其溶剂系统为三氟乙酸-水-正丁醇-叔丁基甲醚- 乙腈（0.01:5:4:1:1）。2 高速逆流色谱在药物中的应用与传统的液相色谱法相比较，HSCCC具有分离效率高、溶剂用量少、无吸附、样品回收率高、重现性好和适用范围广等优点。由于HSCCC的溶剂系统组成与配比可以是无限多的，理论上何极性范围的样品都可用它得到分离；而且HSCCC对样品的预处理要求低，仅需简单的提取，甚至不用前处理都可达到很好的分离效果。它的这种特点非常适用于中药成分的分离和分析。许多研究证明，HSCCC能分离用HPLC难以分离的成分。Schaufelberger等用正己烷-乙醇-水（体积比为6:5:5）溶剂系统分离含有长春胺、长春辛和长春新碱等的样品，与用HPLC的分离效果相似，这3种成分之间均能达到基线分离；但采用HSCCC还能将用HPLC难以分离的长春新碱对映异构体分开。HSCCC在中草药研究方面的应用尚处在起步阶段，目前主要用于中草药有效成分的分离和标准品的制备。2.1.1制备中药化学成分对照品国内外学者已采用HSCCC技术分离提纯了许多中药化学成分对照品, 如从金银花中分离绿原酸（纯度94.8%）, 从黄芪中分离异黄酮苷（95%），从紫草中分离紫草宁（98.9%），从二氢杨梅素粗提物中纯化二氢杨梅素川(99%), 从虎仗中分离白黎芦醇(99%), 从肉苁蓉acleoside（98%），从丹参中分离隐丹参酮（98.8%），从大黄中分离大黄素甲醚、芦荟大黄酸、大黄酸、大黄粉、大黄素（98%）, 从毛柳苷粗提物中纯化毛柳苷（98%）等。2.1.2 分离蛋白质和多肽HSCCC用于分离制备蛋白质和多肽, 需要强极性并具有较高的粘度的溶剂系统, 为了获得合适的固定相保留值, 大部分都采用X型的CPC。目前, 聚合物双水相溶剂体系、新型的PCCC以及ICCC的出现和发展则为成功分离蛋白质和多肽提供了有利的条件。用HSCCC分离的有卵白蛋白、乙醇脱氢酶（ADH）、乳酸脱氢酶（LDH）、DNA结合蛋白、脂蛋白、短杆菌肤、杆菌肤、粘菌素、缩胆囊素等。2.1.3分离抗生素由于可以直接向HSCCC中进粗品, 抗生素的分析和制备分离也可采用。美国FDA及世界卫生组织也采用此项技术作为抗生素成分的分离检定。HSCCC分离制备抗生素时, 进样量通常为1mg5g，溶剂系统一般采用疏水性体系。用HSCCC分离的抗生素实例有环孢菌素、WAP8249A 、伊维菌素、螺旋霉素,、子囊霉素及依罗霉素、道诺红菌素衍生物、普那霉素、放线菌素、杀念菌素、尼达霉素等。2.1.4 分离手性化合物随着HSCCC技术的发展, 其应用范围逐步拓展。已有用HSCCC分离外消旋对映体手性化合物的报道。如已用于分离撷氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸等手性氨基酸对映体, 也有报道从紫胶染料、喹啉黄、食品红等染料中分离手性化合物。随着高选择性的手性添加剂的发现, 相信将有更多的手性物质通过HSCCC拆分。2.2 在药物分析中的应用2.2.1 HSCCC与其他色谱技术联用进行中药的定性、定量分析分析型HSCCC与各种检测器联用可以用于中药化学成分的定性、定量分析, 或者将分析型与制备型HSCCC联用。还可以将HSCCC技术与其他色谱如HPLC、MS和NMR联用, 从而充分发挥HSCCC高速、高效的优点与其他色谱灵敏度高的优点, 更好地用于中药的分析鉴定。2.2.2利用HSCCC建立中药指纹图谱 中药质量可控是中药现代化的一个重要内容，中药以及复方因其复杂的成分和未明的作用机理，阻碍着中药现代化的进程。中药指纹图谱技术已成为研究中药有效成分及作用机理，控制中药质量，推动中药业走向世界的关键技术。HSCCC具有很好的分辨率和重现性，加上不存在固体载体吸咐，对样品的前处理要求不高或不用前处理，不存在分离过程丢失成分和成分变性的问题，因而可用于中药有效成分的定性或半定量分析，并整理出中药材的特征峰和指纹谱，制定标准图谱，用于中药的质量控制和测定。在高速逆流色谱指纹图谱研究方面，目前已对大黄、沙棘、何首乌等一些中药进行了研究。从20世纪90年代以来, HSCCC有关技术有了较大的发展, 且在天然药物、生物医药研究中获得了广泛的应用, 也有人研究用HSCCC分离手性化合物的外消旋对映体。有理由相信, HSCCC技术在药物的分离鉴别、质量控制、定量分析等方面会有更加广阔的应用前景。5.发展前景与评价5.1 高速逆流色谱技术的优点HSCCC技术虽仅有20余年的发展历史，但作为一种具有独特优势的液-液分配色谱技术，HSCCC的发展可谓迅猛，技术也日臻全面和完善，在天然产物有效成分的分离纯化领域中有着独特的优势并且获得了广泛的应用。逆流色谱分离技术在黄酮类化合物分离纯化的应用中几乎没有限制，可以用于各种黄酮类化合物的分离。这主要是由于HSCCC 技术有足够多的两相溶剂体系以供选择应用，其洗脱方式灵活多样，既可以使用单一流动相，也可以一次使用不同的流动相，甚至可以使用两相溶剂同时双向流动，实现真正连续的逆流色谱过程。此外，HSCCC 还可以实现多种形式的梯度洗脱过程，既可用于天然植物粗提物的去除杂质，也可用于最后产物的精制，甚至直接从未经处理的粗提物一步纯化得到纯品。所有这些优点在上面所述的应用实例中都有具体体现。作为一种新兴的，备受关注的分离纯化技术，随着越来越多的研究者的加入，HSCCC 必将得到更加广泛的应用和发展。5.2 高速逆流色谱技术的缺点尽管HSCCC 具有其它色谱分离方法不可替代的优点。但是HSCCC 的更广泛的应用还受到一些因素的制约。首先在溶剂体系的选择上还没有非常系统、成熟的理论来指导，虽然已经有学者建立了几种经验性的溶剂系统筛选方法，但这些方法均为经验性的规律总结，如何选择一种具有良好分离效果的溶剂体系还依赖于操作者的经验，通常都需要多次实验才能筛选出较佳的溶剂系统。另外尽管目前的HSCCC 已经能实现上百毫克甚至数十克级的制备分离，但是还未达到数百克级甚至公斤级的制备能力。此外，HSCCC 在中试规模和产业化当中的应用还需要对逆流色谱的分离机理从理论上做更深入的探讨，还需要解决现有仪器设备在放大过程中的一些关键性技术问题。目前，已有科技人员着手这方面的研究，相信在不久的将来HSCCC 将发展成为一种更加成熟的可产业化的高效分离技术。5.3 高速逆流色谱的应用前景5.3.1 HSCCC 的微型化以及与多种分析技术的联用近年来, 分析型HSCCC的柱系统越来越向微型化发展, 如螺旋管柱体积可小到35mL, 柱内径小到0.30.4mm, 并可以通过各种接口技术与多种检测器和化合物结构分析技术相结合。尤其是HSCCC与MS的联用,把HSCCC分离的灵活性、多样性与MS的高灵敏度检测和结构分析特性良好地结合在一起,在天然活性成分的快速分离和鉴定方面显示了其独特的优势, 很有发展前景。同时,要将HSCCC 发展成为一种高通量分离技术, HSCCC的微型化也是必需的。5.3.2 HSCCC 在药物工业化制备方面的应用和发展HSCCC 从根本上是一种制备性色谱分离技术, 目前实验室HSCCC的制备能力已经达到中试HPLC 的制备规模。HSCCC 与HPLC的放大过程相比, 其分离过程简单,所用溶剂量比HPLC 要少75%,且所得目标成分在分离级分中的浓度较高, 易于回收或作进一步的处理。HSCCC 的放大过程不会改变其分离原理。分离过程可以采用典型的色谱理论很好地进行描述和模型化。这种分离过程的可预测性、分离物质的高回收率以及不用固体支撑体等优点, 使得HSCCC成为一种可用于工业化分离的很有前途和吸引力的分离制备方法。但是, 逆流色谱的真正工业化应用还有很多的问题需要研究解决。大制备量仪器的研制首先要搞清放大倍数、产量、分离效率与柱体参数的关系, 在理论指导下进行有目的的可预测的放大。近年来, 英国B runel大学生物工程研究所的Sutherland教授研究小组及其合作者在这方面进行了一系列的研究, 他们对一些试验样品的分离, 在分离柱体积从5mL放大到5L, 上样量扩大1000倍的情况下, 可以几乎在同样的时间( 10m in)内，实现同等效率的分离结果, 分离谱图基本吻合, 为HSCCC仪器的工业化放大奠定了良好的基础。5.3.3 HSCCC 在生物药物高效分离中的应用和发展HSCCC 在大环内酯类和环肽类等抗生素药物的分离制备中的应用早有报道。在氨基酸和肽类衍生物等生物药物成分的分离纯化方面也有应用, 并且采用pH- 区带精制逆流色谱等新型分离纯化技术可以使酸性或碱性的这类物质达到10g量级的制备。但是采用HSCCC对蛋白质等生物大分子药物的分离制备还存在一些问题。主要是目前商业化的HSCCC仪器对于分离小分子药物所需要的含有机相两相溶剂体系有较高的固定相保留, 而对于分离生物大分子所需要的聚合物双水相体系的保留能力较差, 而固定相的保留值是关系到分离效率高低的重要参数之一。因此, 研究和开发高效的分离生物大分子的HSCCC仪器和方法是近年来人们研究关注的又一个热点问题，是制约HSCCC在药物研发中广泛应用的关键问题。首先, HSCCC 是一种相对较新的分离纯化技术,尽管它具有许多与生俱来的优点，但是人们对它的认识和理解还需要一个逐步深入的过程, 因而从某种程度上影响了它的应用; 其次, HSCCC 技术的广泛应用还需要有更为成熟稳定的仪器设备条件的支撑。目前国内只有一二家专门从事逆流色谱仪器研发和生产的机构, 主要生产可用于实验室半制备分离的仪器。另外国家对该项技术研发的投入和支持也很有限, 缺乏对该项技术和相关设备的系统性的研究, 目前国内可用于大规模生产的商业化仪器设备研制和开发还处于起步阶段。国外已有工业化仪器设备面世, 但由于技术保密等方面的顾虑, 目前还没有投放国内市场, 且价格昂贵。因此, HSCCC 的工业化大规模应用还需要国家和有关行业的投入