流式细胞术在白血病中的应用.ppt

流式细胞术在白血病 淋巴瘤分型和监测中的应用 2 世界卫生组织血液肿瘤分类方案 1999年 新分类方案的基本原则是 结合形态学 免疫表型 遗传改变和临床特征来鉴定疾病的 真实 本质 这为世界各国肿瘤学家和病理学家提供了一个全新的与令人兴奋的合作交流新篇章 必将极大促进人们对血液肿瘤的治疗与认识 美国临床肿瘤协会 临床肿瘤杂志17卷3835 3849页 1999年 更重要的是提供了疾病分类与治疗选择和预后判断的较明确关联性 开启了血液肿瘤靶向性治疗和个性化方案的新时代 3 白血病分子诊断的意义 系统诊断 白血病初发 异常标记 精确诊断准确预后指导治疗科研资料 残留监测靶向治疗 免疫 遗传学靶标 MICM诊断 4 WHO血液肿瘤新分类实验技术平台 实施WHO血液肿瘤新分类方案高度依赖流式细胞 细胞遗传和分子生物学实验技术平台以及掌握这类实验技能并具有专业知识的人员 5 6 InvestigativeToolsforMMdiagnosisandManagement 2008ASHEducationProgramBookp298 PatientEvaluation诊断单克隆蛋白数量和特征血清蛋白电泳和免疫球蛋白定量24小时尿蛋白 总蛋白 本周蛋白尿和血清免疫固定血清自由轻链和比例骨髓检查和骨髓活检Bonemarrowaspirationandbiopsy组化免疫分型 克隆检定 及通过CD38 CD56 CD19 CD45抗体组合能从90余例患者正常浆细胞中找到检测残留MM细胞终末器官损害评价全血细胞计数 生化检查 血清肌酐和骨钙测定预后评估球蛋白 betta 2微球蛋白 LDH CRP骨髓细胞遗传学和FISHt 4 14 t 14 16 del17p针对某些特定患者的特殊研究 7 传统流式细胞术的临床应用细胞计数 CD4 CD34DNA含量 多倍数 S期结果是数据 准确性依赖于良好的质控 传统流式细胞术在白血病免疫表型中的应用单参 白血病表型 阳性比率大多数细胞为肿瘤细胞多为形态学 细胞化学后的确认数据由临床医师判断 高分辨流式细胞的优点以多参数正常抗原表达为基础结果类似病理报告用于原发性诊断与鉴别诊断用于疾病分期 治疗选择疗效监测 预后判断 流式细胞术 8 骨髓 异质性系统中的应用 多系列Lymphocyte T B NK MonocyteNeutrophilEosinophilBasophilErythrocyte骨髓中各系列细胞处于连续性成熟阶段必须能涵盖所有细胞 9 应该使用何种抗体 所有抗体必须为标准的商业化试剂没有什么 秘密武器 或者专门特异的抗体抗体的联合应用能使你从有限的标本中得到最大化的信息量对正常抗原表达的正确认识能帮助你有效地鉴别疾病状态相关的改变 10 高分辨流式细胞术能够鉴别和分类所有骨髓细胞 可以对每一个细胞进行多特征性的检测并对其相应的系列和成熟的阶段进行分类至少检测一万个细胞 分辨率达到0 5 11 12 CD45 SS Wood 2004 MethodsCellBiology75 559 576 13 正常粒系成熟模式 正常B系成熟 Wood 2004 MethodsCellBiology75 559 576 15 表达交叉系列的抗原非同步抗原共表达 CD34与CD15 CD11b CD56 CD14抗原的过度表达 早前B ALL中CD10抗原表达缺失 泛T抗原易位抗原表达 CSF中TdT 淋巴细胞 骨髓中胸腺发育阶段的T淋巴细胞光散射异常 FSC和SSC 白血病相关的免疫表型特点 16 AML M0 17 AML M2 18 AML M3 19 AML M4 20 AML M5 21 B ALL 22 Burkitt淋巴瘤 白血病成熟B ALL 23 MALT G MALT B 24 AUL 25 B CLL SLL 26 HCL 27 大B细胞淋巴瘤 28 MM 29 T ALL 30 NK LGL 31 报告 包括出现或缺乏的异常细胞群异常免疫表型相比正常细胞群的抗原强度增强 减弱 缺失定量层面的判断相对于全部CD45阳性细胞 WBCs 出现的其它细胞群 32 33 TCRV 克隆 34 小结 流式细胞术有助于血液系统异常疾病的诊断更加确定的诊断排除其他疾病有助于细分亚型更准确的原始细胞辨别和定量有助于预后判断治疗后监测快速 35 免疫表型分析与FAB分型基于不同的参数对白血病进行分型 两者的结果可一致或不一致 对有些病例 尤其是髓系白血病亚型 免疫表型分析并非特异 对于复杂的病例 需结合多种检查 如特异性染色体核型分析或融合基因综合判断 36 MRD背景 目前由于多种化疗药的联合应用 使多数白血病患者可以获得形态学的完全缓解 CR 但多数患者不能维持长期缓解 仍有相当多的患者再次复发 复发的主要原因是患者体内存在少量的形态学难以辨认的残存白血病细胞 如果能够准确检测患者体内残存的白血病状态 可以有的放矢地进行治疗 使患者避免许多不必要的痛苦 37 MRD OutlineofLeukemicDiagnosis Morphology 1 5 Cytogenetics 1 5 Flowcytometry 0 1 0 01 RT PCR 0 01 0 001 CR Primaryleukemia OS Chemotherapies AutoSCT AlloSCT Induction Leukemiccells 10121010109108107 106 100 1 0 1 0 010 001 38 39 MolecularMeasurementsofTreatmentResponse ClinicalApplication 2008ASHEducationProgramBookp367 ApplicationAction检测治疗早期的反应佳加强治疗检测治疗早期的反应差无需加强治疗检测复发加强治疗 准备HSCTHSCT前MRD评估优化HSCT的时间HSCT后MRD评估调整免疫抑制治疗时间 等临床试验结束时的MRD评估评价新的抗ALL药物或治疗的结果 40 MRD与预后 当残存白血病细胞 10 2 3年复发率为76 94 10 3 残存白血病细胞 10 2 3年复发率为37 53 残存白血病细胞 10 3 3年复发率为8 20 残存白血病细胞 10 4 3年无复发 41 各种MRD检测方法 检测残存白血病细胞的主要依据是在患者发病时找到患者的特殊表现 包括遗传学 分子生物学以及免疫学的特征 这些特征往往是正常血细胞所没有的 因此可利用这些标志鉴别正常细胞与异常细胞 特异地检测残存白血病细胞 评价这些方法的有效性及应用性主要依据该方法的特异性 敏感性 简单性 重复性和速度 FCM免疫表型 FCMDNA倍体 PCR FISH是较好的方法 42 MRD流式分析原则 违背正常分化模式诊断时辨别出背离正常发育阶段的免疫表型相对特异的抗原组合随访辨别出不同于正常免疫表型的不连续群体以诊断的免疫表型作为出发点 43 免疫表型异常适合MRD检测 ALL 95 儿童ALL 90 95 成人ALLAML85 儿童AML80 95 成人AML 44 报告模板 45 病例一AML 病例资料 女 3岁 2009 6初发FCM印象 在CD45 SSC点图上设门分析 原始细胞分布区域可见异常细胞群体 约占有核细胞的26 主要表达HLA DR CD13 CD15 CD33 CD34 CD38 CD117 CD19 2 27 淋巴细胞比例降低 提示 急性髓系细胞白血病 AML M2可能 基因 AML1 ETO阳性 46 病例一 续1 2009 7化疗D33 FCM 可见残留 CD33 CD19 细胞约占0 04 基因 AML1 ETO阳性 47 2009 9D70 FCM 未做 基因 AML1 ETO阴性 2010 3D245 FCM 未见免疫表型明显异常的细胞 基因 AML1 ETO阴性 病例一 续2 48 病例二B ALL 病例资料 男 3岁 2007 3初发FCM印象 在CD45 SSC点图上设门分析 CD45弱表达分布区域可见异常细胞群体 约占有核细胞的45 表达HLA DR CD10 CD19 CD22 CD34 CD38 Gly A cCD79a TdT 提示 急性B淋巴细胞白血病 普通型B ALL 基因 BCR ABL阴性 49 2008 11化疗第20个月 FCM 未见明显表型异常的残留白血病细胞 未附图 基因 未做 2009 09化疗第30个月 FCM 可见残留 在CD45dim 区域可见约1 87 的CD10 CD19 CD20 细胞和约1 55 的HLA DR CD19 CD34 细胞 考虑为残留白血病细胞 见右图 基因 未做 病例二 续1 50 病例二 续2 2010 03化疗 DC CIK第36个月 FCM印象 在CD45 SSC点图上设门分析 CD45阴性略向原始延伸的分布区域可见异常细胞群体 与有核红细胞无分界 共约占有核细胞的89 主要表达HLA DR CD10 CD15 CD19 CD20 CD22 CD34 CD38 cCD79a TdT 提示 结合病史 考虑急性B淋巴细胞白血病 普通型B ALL 复发 基因 ALL基因筛查示TSL ERG阳性 其余均阴性 51 病例三T ALL 病例资料 女 3岁 2008 10初发FCM印象 在CD45 SSC点图上设门分析 原始细胞分布区域可见异常细胞群体 约占有核细