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分泌蛋白质组研究进展【摘要】 分泌蛋白质组是指组织、细胞等分泌的全部蛋白质。分泌蛋白主要分布于体液和细胞质胞浆中，参与许多重要的生命过程。分泌蛋白质组的研究主要涉及分泌蛋白的制备、多维色谱或二维凝胶电泳分离、质谱鉴定及生物信息学分析等。本文主要介绍了分泌蛋白的合成途径、蛋白质组技术在分泌蛋白组研究中的应用、分泌蛋白组研究现状及存在的问题等。 【关键词】 分泌蛋白 分泌蛋白质组 蛋白质组 质谱 二维凝胶电泳Abstract secretion proteome refers to the organization, all the proteins secreted by cells and so on. Secretory protein mainly distributed in the cytoplasm of body fluids and cytoplasm involved in many important life processes. Study group of secreted proteins secreted protein involved in the preparation, multi-dimensional chromatography or two-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry identification and bioinformatics analysis. This paper describes the secreted protein pathway, proteins secreted protein of Group Technology in the application of group study, the secretion proteome Research and existing problems.Key Words secreted protein secreted proteome proteomics two-dimensional gel electrophoresis mass spectrometry1 引言分泌蛋白(secretory protein)参与细胞信号的传导细胞增殖、分化和凋亡的调控、生物体的发育等重要生命过程。了解不同发育、生长时期和不同生理、病理条件下及不同类型细胞分泌蛋白表达的特点对认识生命过程具有重要意义。分泌蛋白质组的研究有助于找到直接与特定生理或病理状态相关的生物分子，为从分子水平上认识疾病的发生和发展过程提供理论依据，也为设计作用于特定靶分子(target molecule)的药物筛选奠定基础。目前利用蛋白质组学(proteomics)技术对分泌蛋白进行着广泛和深入的研究，即分泌蛋白质组(Secretome)1。本文就分泌蛋白组以及相关研究进展做一综述。2 分泌蛋白的合成与转运不论原核生物还是真核生物，在细胞浆内合成的蛋白质或者定位于细胞的特定区域，或者分泌出细胞。将蛋白质分泌出细胞，真核细胞比原核细胞更困难，因为真核细胞结构复杂且有大量的膜性间隔。目前研究发现主要通过以下途径进行分泌蛋白的合成和转运。2.1 常规蛋白质的分泌途径分泌蛋白的合成是在细胞基质中开始的。近年来主要为信号假说(Signal hypothesis)，即协同翻译(cotranslation)来解释分泌蛋白质的分泌过程2。首先在N端合成一段含1626个疏水性氨基酸残基的多肽，称为信号肽(signal peptide)。这段多肽能够起到信号的作用，引导肽链进入内质网腔，当多肽链延伸至80个左右氨基酸时，信号肽指引正在合成的多肽链穿过内质网膜，转移至内质网腔中。内质网腔面上的信号肽酶将信号肽切除，多肽链继续延伸，直至完成整条多肽链的合成。在多肽链从内质网通过高尔基体运输到细胞表面的囊泡之后，高尔基体产生的分泌小泡与质膜融合，泡内的蛋白被释放到胞外空间。信号肽中没有其它保守序列，也没有酸性基团。不同分泌蛋白的信号肽是不同的，如前白蛋白原(Preproalbumin)的信号肽是MetLysTrpValThrPheLeuLeuLeuLeuPheIle SerGlySer AlaPheSerArg3，前2u球蛋白(2uGlobulin)的信号肽是MetLysLeuLeuLeuLeuLeu LeuCysLeuGlyLeuThrLeuValCysGlyHisAlaGluGlu4。进入内质网腔的多肽链还要经过各种修饰加工，如糖基化(glycosylation)、羟基化(hydroxylation)、酰基化(acylation)和二硫键(disulfide bond)的形成等。糖基化伴随着多肽链的合成同时进行，是内质网中最常见的多肽链加工方式。在内质网腔中加在多肽链上的寡糖链，还要在高尔基体中进行一系列复杂的加工才能成为有活性的分泌蛋白。在合成过程中，多肽链在内质网腔中要进行折叠，不能正确折叠的多肽链一般不能进入高尔基体，而在内质网腔中很快被降解。2.2 非常规蛋白质的分泌途径(nonconventional protein export)非常规蛋白分泌途径又称为不依赖内质网/高尔基体的蛋白分泌途径。大部分分泌蛋白都是由常规途径即内质网/高尔基体途径分泌至胞外的，但近年来研究发现，有少数真核细胞蛋白的分泌并不依赖于内质网/高尔基体途径，而是通过其它途径分泌。利用这些途径的有某些血管生成因子、炎症相关的细胞因子、调控细胞分化增殖和凋亡的细胞外基质组分、病毒蛋白、参与感染宿主的寄生虫蛋白等。常见的非常规分泌途径的蛋白有白介素1b(interleukin 1b, IL1b)、利什曼原虫的HASPB蛋白、 半乳糖苷结合蛋白1(galectin1)、纤维原细胞生长因子1和2(fibroblast growth factor，FGF1、FGF2)、硫氧还蛋白等57。真核细胞蛋白非常规分泌途径的存在主要基于以下现象：这些分泌蛋白缺少常规的信号肽；缺少依赖内质网/高尔基体的翻译后修饰(posttranslational modification)，如N糖基化(Nlinked glycosylation)；对依赖内质网/高尔基体蛋白分泌途径的抑制剂 Brefeldin A(一种破坏高尔基体结构和功能的药物)有抗性等。非常规蛋白分泌过程被细胞分化、NFkB依赖的信号传导途径和转录后修饰，如磷酸化(phosphorylation)等所调控8。 3 分泌蛋白质组研究的技术和方法不同发育、生长期和不同生理、病理条件下，不同类型细胞表达的蛋白是不一致的。因此，对蛋白质表达的研究应该精确到细胞甚至亚细胞水平。传统蛋白质研究注重单一蛋白质，而蛋白质组学则研究某一组织或细胞在特定生理或病理状态下表达的所有种类的蛋白质，注重研究参与特定生理或病理状态的所有种类蛋白质及其与周围环境(分子)的关系9。由于分泌蛋白在生物体中参与多种重要生理过程，对生物体的某一特定状态或其全部相关分泌蛋白即分泌蛋白质组的研究就显得很有必要。分泌蛋白质组是蛋白质组研究的分支之一,研究比较细胞或组织在不同生理或病理条件下分泌蛋白质表达的异同，对相关蛋白质进行分类和鉴定后分析分泌蛋白质间相互作用和蛋白质的功能10。3.1 分泌蛋白制备方法 分泌蛋白质组学技术是以已有的蛋白质组研究方法和技术为基础，采用微纳升级流速多维液相色谱分离技术实现在线富集分泌蛋白(或肽段)及肽段分离，或利用同位素标记和荧光标记等方法示踪分泌蛋白在生物体内或细胞内的位置和移动，以纳升电喷雾电离串联质谱(nanoelectrospray ionization tandem mass spectrometry)技术或基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法 (natrixassisted laser desorption/ionization, MALDITOF MS)实现肽段鉴定。如Zwickl等11提供了一种代谢标签掺入的方法。放射自显影后可直接反映分泌蛋白,并克服残留物或死细胞对荧光显影方法的干扰，利用这种方法对HepG2细胞和人肝组织切片进行的研究结果证实其有广泛的临床应用价值。Huang等12利用毛细管超滤探针技术富集分泌蛋白，用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术鉴定分泌蛋白质。Mbeunkui等13用tC2吸附填料对多种肿瘤细胞系的分泌蛋白富集后，采用二维液相色谱/电喷雾电离串联质谱技术对蛋白进行鉴定，平均每种细胞系鉴定出88个分泌蛋白。3.2 分泌蛋白质的分离和鉴定经典的蛋白质组分离技术是二维凝胶电泳(twodimensional gel electrophoresis，2DE)。二维凝胶电泳可以将不同种类的蛋白质按照等电点和分子量差异进行分离，胶内酶切后在质谱系统中进行分析，从而得到蛋白质的定性数据。这些数据可以用于构建数据库或与已有的数据库进行比较分析14。但二维凝胶电泳的上样量相对比较大，而分泌蛋白的量相对较少。如果按常规电泳的上样量,由于高丰度蛋白的存在，将导致低丰度的分泌蛋白检测困难。因此，常规二维凝胶电泳不能完全满足分泌蛋白质组研究需要。为了适应分泌蛋白质组的研究和低丰度蛋白鉴定的需要，研制新型的色谱分离技术和高灵敏的质谱技术是完全必要的15。首先应对整个液相色谱系统进行研究和改进以适应对低丰度蛋白质的分离。液相色谱技术的发展主要涉及两个方面：(1) 研制新型色谱填料，使其具有高耐压能力和尽可能大的比表面积等特性；(2) 泵系统能够提供较高的压力、稳定的低流速如超高压液相色谱（ultra performance liquid chromatography， UPLC）1618。目前多维液相的发展为分泌蛋白的分离、检测和分泌蛋白质组的深入研究奠定了分离基础1921。其次，质谱技术的发展为分泌蛋白质组的研究提供了关键的鉴定技术，如电喷雾电离技术(electrospray ionization，ESI)、基质辅助激光解吸电离技术(MatrixMALDI)。这些电离技术与不同类型质量分析器，如四极杆分析器、离子阱分析器、飞行时间分析器和离子回旋共振分析器等联用组成不同类型的质谱仪。这些质谱技术的发展为分析低丰度的分泌蛋白在灵敏度和分辨率方面提供了可能2225。各种技术，如多维液相色谱、液相色谱毛细管电泳(LCCE)等与各种质谱离子化技术如ESI、MALDI等的联用，为深入研究分泌蛋白质组学提供强有力的技术支持。利用各种预分离技术富集分泌蛋白后，直接鉴定全分泌蛋白质组混合酶解产物也是目前分泌蛋白组研究的主要策略之一。3.3 生物信息学对分泌蛋白的验证通过蛋白质信号肽和跨膜区的分析也可确定备选的分泌蛋白。首先利用各种生物软件进行分泌蛋白的预测，如经典的信号肽预测软件SignalP、PSORT 、TargetP v1.01、PrediSi等2628。同时，无论信号肽存在与否，SecretomeP均可以较准确预测分泌蛋白，包括非经典途径的分泌蛋白29。Klee等30利用Target P预测人、猪等的分泌蛋白组。Chen等31综合了SwissProt、 TrEMBL、 RefSeq、Ensembl 和CBIGene等数据库后，构建了人、小鼠、大鼠的18152个分泌蛋白的数据库。因此，也可以从中挑选出某一种类的分泌蛋白有针对性的进行研究，这样就可以大大加快分泌蛋白组的研究32。同时面对液相色谱/质谱联用产生的大量数据，生物信息学还可以全面综合基因组学、蛋白组学和分泌蛋白质组学，从而达到由基因到功能的转换和互通3336。3.4 其它辅助技术方法在鉴定出分泌蛋白后，即可利用Western blot、免疫组化(immunohistochemistry)等技术研究分泌蛋白的定位，GSTpulldown、免疫共沉淀(coimmunoprecipitation)、酵母双杂交(yeast twohybrid)及蛋白质芯片(protein chip)等进行蛋白质相互作用的研究。这些生物学方法无疑可以对由生物物理技术获得的研究结果给出更好的佐证37,38。4 分泌蛋白组研究进展4.1 不同环境条件下分泌蛋白质组的变化对分泌蛋白组的研究可以深入揭示生命活动的规律。Dupont等39采用2DE/MALDI MS的策略研究了巨噬细胞的胞内蛋白和分泌蛋白质组,并全面研究了它们的生物学功能,获得了在不同刺激或失调状态下有关巨噬细胞分泌蛋白变化的资料。此外，还有大量针对血细胞、神经细胞和内皮细胞等正常状态下分泌蛋白质组学的研究 4043, 为在蛋白质水平上了解人体正常生理活动机制提供了新鲜资料。4.2 寻找生物标志物或药物靶标目前虽然已有一些肿瘤的生物标志物用于常规肿瘤的筛查、诊断、预后、监测治疗和复发。但多数是在肿瘤的中晚期组织或体液中发现，因此用于肿瘤早期诊断缺乏敏感性、特异性或预示价值，临床实用性有待其它指标进行确认。Greevenbroek等44利用质谱技术研究了家族性高脂血症患者血浆中的可溶性因子对肝细胞分泌的影响。在将HepG2与患者或对照禁食血浆孵育后，发现与患者血清孵育的HepG2分泌的总蛋白量增加了1015，其中血清纤维结合蛋白明显增加。实验证明:家族性高脂血症患者血浆中的可溶性因子确实会增加肝细胞的分泌，为家族性高脂血症的治疗提供了可能的分子机理和诊断指标。目前大部分分泌蛋白质组的研究主要集中在特定生理状态下或条件培养基(conditioned medium，CM)中细胞的培养，利用各种技术直接鉴定培养基中的分泌蛋白4547。如Xiao等48利用条件培养基对肺癌组织及癌旁组织进行器官培养后，通过聚丙烯酰氨凝胶电泳和液相色谱/质谱联用技术(sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis（SDSPAGE）/ nanoLC/ESIMS/MS)鉴定出299个与细胞生长、信号传导等相关的分泌蛋白，从中筛选出可能对肺癌早期诊断有帮助的蛋白分子谱。Gronborg等49利用细胞培养基中含有稳定同位素标记的氨基酸的方法，对比研究了PANC1和HPDE的表达谱，CD9、串珠素、SDF4、apoE和纤连蛋白受体等在胰腺癌组织芯片的免疫组化实验中被证明其可能可以作为胰腺癌的肿瘤标志物。Farkas等50利用SDSPAGE/LC/ESIMS/MS鉴定了鼠肝实质细胞在条件培养基中对药物诱导条件下分泌蛋白的变化，发现了新的毒性反应标志物如1抗胰蛋白酶、2微球蛋白在黄曲霉毒素诱导下表达下调；同时在肝细胞再生过程中, 特异表达一些胞外基质蛋白等。Amacher等51在鼠的分泌蛋白组中发现了与肝损害或肝肥大相关的一系列蛋白变化,如维他命D结合蛋白、视黄醇结合蛋白、苹果酸脱氢酶、嘌呤核苷磷酸化酶等。大量与疾病发生发展相关的蛋白的发现与鉴定为临床诊断提供了理论基础。4.3 新抗生素的发现和疫苗研制分泌蛋白通常与致病性微生物的毒力因子有关。参与细菌黏附于宿主细胞、在宿主体内繁殖和侵袭以及抑制宿主细胞的防御机制等过程。这些分泌蛋白不但与发病原因和发病机制密切相关，而且因其在宿主细胞胞外易与各种药物相互作用。因此，可能为药靶的候选物。目前分泌蛋白质组技术可以大规模、高通量的对各种寄生虫、病毒等的分泌蛋白进行研究。此外，由于临床耐药菌的增加，研究耐药菌的耐药机制，利用其分泌蛋白表达谱进行有效抗生素的筛选已成为研究热点之一。Trost等52利用2DE/MALDITOF MS和LC/ESI MS质谱技术在单核李斯特菌培养上清液中鉴定了105个蛋白，与无害李斯特菌相比有个蛋白显示出毒力因子的作用。Buist等53研究了数种革兰氏阳性菌的分泌质组学后，明确了Sec、Tat和ABC等转运系统在其不同生活环境中的作用。Sibbald等54在对金黄色葡萄球菌与表皮葡萄球菌、枯草杆菌等的基因组学和分泌蛋白质组的数据综合比较后第一次定义了核心分泌蛋白质组和变异分泌蛋白组。核心分泌蛋白组主要参与在宿主细胞内的繁殖，而变异分泌蛋白组主要与其的侵袭性有关。此外,红内期疟原虫通过特殊的转运机制将其编码的蛋白质表达于红细胞的胞浆或胞膜，参与疟原虫的进一步感染或繁殖，但对于这种机制认识一直都不很清楚。最近，Templeton，Horrocks和Muhia等研究小组同时鉴定出一种新的疟原虫在红内期的转运相关蛋白。同时利用这种新鉴定的转运蛋白预测出与之相关的300400个恶性疟原虫的分泌蛋白组，极大地扩展了有效疫苗和药靶分子的候选范围5557。上述研究结果表明，分泌蛋白质组学为研究微生物的致病机制、疫苗研制、药物开发等提供了快速有效的方法。5 分泌蛋白质组研究的瓶颈与展望尽管分泌蛋白质组学的研究发展十分迅速，但仍有许多问题亟需解决。由于蛋白质研究远比基因研究复杂和困难,同时由于机体或细胞的分泌蛋白水平处于动态变化中，导致分泌蛋白质组学的实验结果重复性差。在分泌蛋白的样品制备过程中，许多研究者采用组织培养后制备分泌蛋白质样品的技术路线，其研究结论有待商讨。因为将来自不同细胞类型的分泌蛋白质混杂在一起，最后得到的研究数据较难解释分泌蛋白质在每类细胞中的表达情况。此外各种条件培养基的培养过程怎样控制才能真正反映分泌蛋白的表达谱仍有待于进一步研究和控制5860。由于分泌蛋白质组学的目标是寻找有效的药靶，获得新的疫苗和深入探究生命体的调节机制，所以尽可能的分离蛋白尤其是低丰度蛋白是其将来研究重要方向之一。5. 结束语目前已有大量的生物学软件可以预测和处理分泌蛋白组学鉴定出的大量可能的分泌蛋白，但仍存在较高的假阳性。如何对其进行准确鉴定，并且从中挑选出有意义的目标蛋白并对其进行功能测定，是亟待解决的另一问题61,62。虽然一些新技术、新方法和新策略的出现已部分解决上述不足，但真正达到高灵敏度、高通量、全自动仍依赖于蛋白质组学在富集和分离技术上的突破。总之，由于分泌蛋白参与生物体内的多个重要过程,如细胞信号传导、细胞凋亡、细胞与细胞外基质的相互作用等。所以，详尽的研究不同组织和细胞系的分泌蛋白质组对认识疾病的发生、发展、开展早期诊断和治疗具有重要生物学意义和临床意义63,64。目前分泌蛋白质组学的研究已扩展到原核、真核等基础学科和疾病机理研究的各个领域，它已成为寻找疾病分子标记和药物靶标的最有效方法之一。分泌蛋白质组学的大量研究结果有助于在蛋白质水平上深入认识生长、发育和代谢调控等生命活动的规律。分泌蛋白质组的研究不但为研究重大疾病的发病机制、疾病诊断、防治和新药开发等提供重要的理论基础，并成为生物技术药物发展的动力之一，明显地加快开发新的治疗和诊断方法。在应用的研究技术方面，如何将二维凝胶电泳、多维液相、质谱及蛋白芯片等多种分离和鉴定技术有机结合是从分泌蛋白质组中成功筛查与鉴定早期生物标志物的关键，这些技术的有机结合也为研究临床上众多疾病的早期诊断方法和早期治疗的分子机理提供一定的手段。上述技术还可以为监测疾病的发生、发展和预后提供帮助。但由于蛋白质组学技术发展水平的局限，也限制了低丰度分泌蛋白质组学的研究。因此，加快蛋白质组学各项技术的创新及技术之间的联合应用是深入研究分泌蛋白质组的基础，也是各种疑难病症早期诊断与治疗的希望6. 参加文献 Grimmond S M, Miranda K C, Yuan Z, Davis M J, Hume D A, Yagi K, Tominaga N, Bono H, Hayashizaki Y, Okazaki Y, Teasdale R D. 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