-分子育种 (2).doc

转基因技术在油菜育种中的应用李玲玲（河西学院农业与生物技术学院 甘肃张掖 734000）摘 要: 转基因油菜是近年来转基因研究很有成效的作物之一,而且取得了重要进展。从转基因油菜在杂种优势利用、品质、改良、抗病虫害等方面,综述了转基因油菜育种取得的重要进展,并对转基因油菜育种中所存在的问题提出了一些看法。关键词:油菜;转基因;遗传改良在过去的近百年间,人们已利用传统的育种方法培育出了许多农作物新品种,并获得了巨大的经济效益。但由于传统育种方法所存在的不足及种内遗传资源枯竭等原因限制了其发展速度,而植物基因工程则为解决这些问题提供了新的思路和方法1。油菜是世界上重要的油料作物之一,也是最早成功地进行基因转化的植物之一。自1986年Mathew等用农杆菌介导法首次把新霉素磷酸转移酶基因(NPT-)转入芥菜型油菜中并获得转基因植株以来,转基因油菜研究与发展在世界范围内取得了举世瞩目的进展,它已成为与烟草相似的为数不多的基因工程模式植物2,3。2003年,在世界范围种植的良种油菜有31%是转基因品种1。目前运用于油菜品种改良的外源基因主要包括一些抗除草剂、抗虫、抗病、改良质量(脂肪酸和蛋白质)以及雄性不育等方面的基因2。1 转基因与油菜品质改良 随着生活水平的提高,人们对饮食质量的要求亦越来越高,这就要求农业科研工作者在提高作物产量的同时,要注重对品质的改良。油菜品质改良包括脂肪酸和蛋白质两个方面。1.1 油菜脂肪酸的遗传改良 油菜的脂肪酸除作为食用油以外,在涂料、防腐剂、润滑剂、表面活性剂、医药、化妆品、胶粘剂等领域都有广泛的应用价值11。实践证明,利用转基因技术改变油菜油脂的含量、芥酸的含量、油脂的结构等方面,已经取得了一定的成果。月桂酸是制造表面活性剂的重要原料。油菜脂肪酸基因改造的典范是生产月桂酸的转基因油菜。Pollard等5从富含月桂酸的加州月桂树(Umbellularia california)的种子中分离出酰基-ACP硫激酶Cdna,转入canola油菜中,结果使油菜种子中脂肪酸合成到12碳时就从ACP上释放下来,最终得到了种子中含有40%月桂酸的转基因油菜。美国Calgene公司的研究人员将存在于加利福尼亚月桂树中阻止脂肪酸合成过程碳链(C12)继续延长的硫脂酶基因(120-ACPthioesferase)导入油菜,获得可以合成50%以上月桂酸的转基因油菜;将可可(Coconut)植物中能将月桂酸放在甘油三酯2号位置上的酰基转移酶(LPAAT)基因与120-ACP硫脂酶基因同时导入油菜,获得了月桂酸含量高达70%的转基因油菜。1999年高月桂酸转基因油菜已经进入商业化生产。 陈锦清等3,7报导,将PEP基因片段插入超级双元载体pIG121的Xba I位点,使PEP基因片段连接与CaMV35S启动子下、GUS报告基因上游,并与35S启动子反向连接构建成反义PEP植物表达载体pPEPAS,并用电击法导入根癌农杆菌EHA101,然后与浙758下胚轴共培养,将反义PEP转化到浙油758基因组中,成功获得高油量转基因油菜品系超油1号。PCR扩增检测证明,外源基因已插入油菜基因组并得到表达,转基因植株T1代种子平均含油量比对照提高9.4%。 石东乔等8报导,采用农杆菌介导法,将反义的油酸脱饱和酶基因(FAD2基因)导入甘蓝型油菜双低品种H165,获得了7株转基因植株。与所设对照植株比较,有5株转基因油菜产生的种子中脂肪含量发生变化,表现为油酸含量升高,亚油酸、亚麻酸含量降低,其中油酸最高含量为68.72%,比对照高20%以上。熊兴华等4,9报导,从甘蓝型油菜中克隆FAD2基因cDNA片段,并构建种子特异型表达载体,利用反义抑制技术,将FAD2反义基因转化双低油菜品种湘油15号,使种子中油酸含量提高到80%以上。2003年又以湘油15号子叶柄为受体材料,用基因枪法,将反义油酸脱饱和酶FAD2基因连在种子特异表达载体上后导入油菜,获得8株再生植株。经PCR与PCR-Southern杂交检测,其中有2株为转化株,证明反义FAD2基因已整合到湘油15号基因组中。1.2 蛋白质的遗传改良 油菜籽中不仅含有丰富的脂肪酸和多种维生素,而且蛋白质含量也高。据分析,白菜型和甘蓝型油菜饼粕中的蛋白质和赖氨酸含量较高,可与大豆饼粕相媲美。与提高蛋白质有关的基因有菠菜的酰基载体蛋白因子与种子发育时的专一表达基因调节片段构建的嵌合基因、拟南芥和豌豆2S蛋白质基因、巴西坚果富含甲硫氨酸种子蛋白基因。据Krebbeors,Stayton,Altenbach等报导,通过根癌农杆菌将拟南芥和豌豆2S蛋白基因和巴西坚果富含甲硫氨酸种子蛋白基因导入油菜,使转基因油菜蛋白质总量成倍增加,甲硫氨酸和赖氨酸含量显著提高10。浙江农科院陈锦清等育成的转基因超高含油量油菜新品种“超油1号”和“超油2号”,为油菜产业提供高含油量种质资源创造了良好的条件7,10。这些事实都说明,通过基因工程改良种子中油脂和蛋白质组成是可能的。3 转基因与抗虫 虫害严重影响作物的产量和质量,制约农业经济的稳定发展。培育抗虫油菜是基因工程的一个重要应用领域。现在植物抗虫基因工程主要是利用苏云金杆菌(Bacillus thuringensisi)的毒蛋白基因(简称Bt毒蛋白基因)。Bt毒蛋白基因所表达的晶体蛋白对鳞翅目和鞘翅目昆虫有毒杀作用。毒蛋白在昆虫消化道内经过蛋白酶启动后造成消化道损伤而导致昆虫死亡,对其他生物则没有任何危害。侯丙凯等12从苏云金芽孢杆菌克隆得到野生型杀虫晶体蛋白基因,构建了用于油菜叶绿体定点转化的植株表达载体,并用基因枪法将杀虫蛋白基因导入油菜,在国际上首次实现了抗虫基因对油菜叶绿体基因组的定点整合,并获得了具有抗虫性的油菜叶绿体工程植株。 湖南农业大学官春云院士领导的科研组运用子房注射法与农杆菌介导法成功地将Bt杀虫蛋白基因导入甘蓝型油菜品种双低油菜“湘油13号”,获得转基因植株。为选育高效抗虫油菜新品种,采用酶联免疫吸附法检测了Bt杀虫蛋白基因在转基因油菜植株中的表达,并对转基因抗虫油菜的植株性状、农艺性状和质量性状等进行了研究,还通过喂虫实验对转基因抗虫油菜的菜青虫抗性进行了试验。结果表明,导入基因在油菜中能有效表达,苗期对菜青虫幼虫具有较强的抗性。通过进一步选择,现已获得稳定、高效的转基因抗虫油菜新品系1316。4 转基因与抗病 菌核病(Sclerotinia sclerotiorum)是危害油菜的主要病害,在我国常年发病率10%30%,严重年份80%以上,一般导致减产5%10%,严重的50%以上。除影响产量外,还导致种子含油量和蛋白质含量降低。尤其是“双低”油菜品种由于降低了硫苷(一种十字花科植物体内先天存在的抗真菌物质)的含量使其更易感染真菌病毒。目前通过传统育种方法在寻找抗源方面仍存在问题,因此利用转基因技术以及已建立的油菜遗传转化体系,在导入抗真菌病基因从而改良油菜抗病性方面具有其独特的意义。运用于抗病基因工程的目的基因有:抑制核糖体的蛋白基因、几丁质酶基因、葡聚糖酶基因、溶菌酶基因、抗菌肽基因等2。几丁质酶是现今研究得最多且应用最广泛的抗真菌蛋白之一,它能催化真菌细胞壁的重要物质之一几丁质(聚乙酰胺基葡萄糖)水解,从而抑制真菌的生长和增殖。利用分子生物学手段将带有强启动子的几丁质酶基转入某些作物,转化植株组成型超量表达几丁质酶,可有效增强其抗病性。Grison等人利用组成型表达的几丁质酶基因转化油菜,使其对一些真菌性病害的抗性增强。目前用几丁质酶和葡聚糖酶基因同时转化植物从而提高其抗病性的研究也已在烟草中取得成功。 蓝海燕等25利用农杆菌转化法,将组成型表达-1,3-葡聚糖酶及几丁质酶基因的双植物表达载体PBDGC转化优质甘蓝型油菜品种H165,并得到了抗卡那霉素(Kannomycm)的再生植株。对转基因植株进行了活体接种油菜菌核病菌,试验表明,部分转基因植株比对照显示较强抗病性。 郭学兰等27将玉米转座因子Ac导入甘蓝型油菜Westar的具柄子叶,获得转基因植株。田间调查发现,随后代中Ac阳性比例增加,菌核病的病情指数下降,二者为线性关系。5 转基因油菜与杂种优势利用 国内外大量的研究证明,油菜(包括白菜型、芥菜型、甘蓝型和埃塞俄比亚芥)品种间杂种F1存在着明显的种子产量杂种优势,一般可增产20%30%,好的组合增产幅度可达50%。现在的油菜杂交组合主要是利用polima CMS及陕2A CMS雄性不育三系杂种,细胞核雄性不育(GMS)和化学杀雄。利用这些方法来选育不育系存在育种周期长,不育基因单一,对环境因素敏感,组合选配局限性大,费工费时,育种、应用效果差等问题。近年来,科学工作者利用基因工程技术,成功地创造了全新的油菜雄性不育恢复系。 1990年,比利时PGS公司的Mariani23,24等利用烟草花药绒毡层特异表达基因TA29的启动子与解淀粉酶芽孢杆菌的核酸水解酶基因barnase构建嵌合基因,通过遗传转化导入烟草、油菜中,得到遗传工程雄性不育株。研究表明,该基因能在油菜的绒毡层或小孢子细胞质内表达,表达期为小孢子液泡形成期,使花药在小孢子体解体后提前凋萎。为了恢复barnase基因导致的不育,Mariani等又将该基因的抑制蛋白barstar基因接到TA29基因上游区,以抗除草剂草丁膦(PPT)bar基因作筛选标志,经农杆菌转化烟草和野生油菜,获雄性可育转化植株。金红等用含有抗除草剂溴苯腈与雄性不育嵌合基因、抗除草剂溴苯腈与育性恢复嵌合基因转化浙油1号油菜下胚轴组织,分化再生获得转基因雄性不育植株和育性恢复植株。对两种转基因植株花器解剖表明,雄性不育植株的花丝明显比花柱短,花粉少,育性恢复植株与正常植株相同。云南省农业科学院生物技术研究所1999年报道,将携带TA29-barnase雄性不育基因的农杆菌导入“双低”花培油菜,获得了大量的转基因植株。 何业华等利用李文彬等提供的含有TA29-barnase嵌合基因质粒pBI-TBS-bar和含有TA29-barstar嵌合基因的质粒pBTABSBAR23及根癌农杆菌(Agrobacterium turmefaciens) LBA4404,通过农杆菌介导转化甘蓝型油菜,成功获得油菜转基因雄性不育植株和恢复植株。至2002年,在国内所有转基因油菜不育恢复体系研究中,研究工作局限于嵌合基因转化植株的报道,尚未见可用于生产的不育系和恢复系及杂种的报道。国外利用这一系统育成的油菜杂种已应用于生产,其中主要是Plant GeneticSystemsN和AgrEVOInc公司的组合。目前加拿大利用这一技术育成的转基因杂交油菜品种的种植面积占其油菜总种植面积的10%左右。6 展 望 自1986年人类首次获得转基因植物以来,转基因油菜研究及应用已获得显著成效,并有品种得到大面积应用。未来生物技术将广泛应用于油菜品种培育,但无论什么时候,常规育种都不能被取代,它是育种工作的基础。基因工程技术与传统的育种技术的有机结合,新的油菜品种将组合更多的优良基因,其产量潜力、品质状况、种植效益都将大大改善。据统计,截止2003年,已有16个商品化的品系。表1为转基因油菜各品系所有外源基因以及各国批准食用的时间。但是,在转基因油菜商业化进程中仍然存在一些问题,主要有以下几个方面: (1)安全问题。转入油菜的目的基因(如抗虫基因)对人体是否具有不良影响,是否会改变与之相关的物种(如昆虫)的进化速度。 ( 2)目的基因是否会转移到其它作物或杂草中去,是否会带来生物“入侵”问题。相信不久的将来,随着基因工程技术的进一步完善,转基因植物将为世界农业带来一场新的绿色革命。参考文献:1 张 涛.转基因油菜研究及应用进展J.甘肃科技,2002,(6):25.2 林良彬,官春云.植物基因工程与油菜品种改育J.作物研究,1996,10(1):43-46.3 官春云.油菜转基因育种研究进展J.中国工程科学,2002,4(8):34-39.4 熊兴华,官春云,李 ,等.基因枪法向甘蓝型油菜转移反义FAD2基因的研究J.湖南农业大学学报(自然科学版),2003,29(3):188-191.5 陈社员,官春云,王国槐,等.基因工程技术与油菜育种J.中国油料作物学报,2002,24(4):76-796 Pollard MR,Anderson L,Fan C,et al.A specific acyl-Acp-thioesterase in plicated in medium chain fatty acidproduction in immature cotyledons of UmbellularieCaliforniaJ.Archivea of Biochemistry and Biophysics,1991,284:306-412. 7 陈锦清,朗春秀,胡张华,等.反义PEP基因调控油菜籽蛋白质/油脂含量比率的研J.农业生物技术学报,1999,7(4):316-320.8 石东乔,周亦华,张丽华,等.农杆菌介导的油菜脂肪酸调控基因工程研究J.高技术通讯,2001,(2):1-7. 9 熊兴华,官春云,李 ,等.甘蓝型油菜FAD2基因cDNA片段的克隆和序列分析J.湖南农业大学学报(自然科学版),2002,28(2):97-99.10 倪 郁,李加纳.基因工程在油菜遗传改良中的应用J.Chinese Agricultural Science Bulletin,2002,18(6):90-93.11 王永飞,马三梅.基因工程在油菜遗传改良中的应用J.湖南农业大学学报(自然科学版),2004,30(2):193-200.12 候丙凯,陈正华.苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白基因克隆及油菜叶绿体遗传转化研究J.遗传,2001,23(1):39-40.13 林良彬,官春云,李 ,等.子房注射法与农杆菌介导法转化甘蓝型油菜的比较研究J.生命科学研究,2000,4(3):231-236.14 林良彬,官春云,李 ,等.油菜高效转化系统研究J.作物学报,1999,39(1):22-27.15 林良彬,周小云,官春云,等.转基因抗虫油菜的ELISA分析J.湖南农业大学学报,2001,27(3):179-181.16 林良彬,官春云,王国槐,等.转基因抗虫油菜的生物学特性研究J.西南农业大学学报,2001,23(5):408-409.17 林良彬,官春云,王国槐,等.转基因抗虫油菜对菜青虫抗性的研究J.