乌头碱体内代谢产物分析方法的研究.doc

乌头碱体内代谢产物分析方法的研究项目完成人员：马辰 李慧义 李文东 刘爱茹 李农项目完成单位：国家药物及代谢产物分析研究中心摘 要 运用体内与体外代谢的方法对乌头碱的代谢转化作了研究，体外代谢运用大鼠肝微粒体体外温孵法，优化了温孵体系，建立了反相HPLC-DAD分离检测乌头碱及其体外代谢产物的分析方法；体内代谢运用对大鼠灌胃给药，收集0-8h、8-24h、24-48h三个时段的尿液，通过冷冻干燥有机溶剂提取的前处理方法， HPLC-DAD检测，建立了体内乌头碱的分析方法，确定了乌头碱一标志性的代谢产物，LC-MS分析初步确定其结构，同时对乌头碱水解产物及不稳定性产物作了研究，通过LC-MS分析，其水解产物为乌头碱8位酯键水解产物与乌头胺，不稳定性产物为8位的乙酰氧基结合一个氢掉一个乙酸基的产物。应用所建立的方法，对血、尿中乌头碱的分布进行了测定。一 乌头碱液相色谱条件的建立与血尿中的分布 乌头碱、次乌头碱及其代谢产物的分子中均含有N原子，有较大极性，在分离中要考虑其结构特性。复方中的成分复杂，为了获得乌头碱与次乌头碱及其它组分的分离，曾选用乙腈-水-三乙胺系统，乙腈对被测组分的洗脱力强，出峰快，分离不好。甲醇-水-三乙胺系统，使化合物之间及与杂质有理想的分离效果。对于碱性化合物来说，流动相的pH值对分离效果的影响很大。为此考察了0.05%，0.04%，0.02%的三乙胺对分离的影响，确定0.04%三乙胺可以满足乌头碱、次乌头碱与杂质峰的分离，且得到较好的峰形。使用的流动相为弱碱性，对色谱柱的破坏较大，因此采用流动相中加入少量酸，经比较，在100ml 流动相中加入0.5ml冰醋酸时，可使分离达到目的，并使流动相的pH值在色谱柱的适合范围内。根据以上条件的考察，确定甲醇： 0.04%三乙胺：冰醋酸（60：40：0.5）为流动相，测定复方酒剂中乌头碱与次乌头碱的含量。乌头碱与次乌头碱乙醇溶液的紫外吸收光谱表明，二者的最大吸收峰均为240 nm。因此，选择240nm作为检测波长。 大鼠口服给药，取血清，用3高氯酸溶液超声提取3次后，冷冻干燥后，用乙酸乙酯提取3次，蒸干，用甲醇溶解，液相色谱测定，给药3h，血清中乌头碱含量为1.3mg/mL，第二天取血，未检测到乌头碱。给药后收集24 h尿液，冷冻干燥后，用乙酸乙酯提取3次，蒸干，用甲醇溶解，液相色谱测定，尿中的乌头碱达15.1mg/mL，2448h尿液降为1.1mg/mL。测定结果表明，血中乌头碱很快检测不到，且其浓度较尿中浓度低，因此尿中鉴定乌头碱中毒更有实际意义。二乌头碱水解产物及不稳定性产物研究1.试剂的配制 乌头碱标准溶液：精密称取1mg乌头碱，置5mL容量瓶中，用MeOH定容；精密称量1mg乌头碱，置5mL容量瓶中，用H2O溶解（不能完全溶解）。 水解样品的配制：取2mg乌头碱对照品，加甲醇0.5mg/mL的溶液；取此溶液2mL,加一滴稀盐酸；同样取2mL，不加稀盐酸。取2mL乌头碱对照品水溶液（0.5mg/mL），加一滴稀盐酸，同样取2mL乌头碱对照品水溶液（0.5mg/mL）不加稀盐酸。将这四个样品于沸水浴中3h，充分水解。 取2mL乌头碱对照品水溶液（0.5mg/mL），加适量MeOH使不溶物溶解。将该样品于37水浴1.5h后取出。2.水解样品的HPLC-DAD分析与LC-MS分析将水解完的样品进行HPLC-DAD分析，色谱条件同前，通过谱图有相关峰出现，又结合LC-MS测定结果进行分析，乌头碱甲醇溶液不加酸水解的HPLC色谱图，与原药乌头碱比较，其中tR为14.6min为乌头碱的色谱峰，tR为12.8 min为乌头碱N去乙基水解产物， tR为9.0min为乌头碱8位酯键的水解产物，tR为5.6min为苯甲酸的色谱峰，该苯甲酸是由乌头碱的8位水解产物在14位进一步水解而掉下的一个苯甲酸，所得乌头胺不含有紫外吸收的官能团，紫外检测器检测不出，质谱图中可以体现。乌头碱标液（MeOH与H2O混溶）于37水解1.5h的HPLC-DAD色谱图，tR 10.5min的色谱峰为乌头碱的不稳定性产物，通过其质谱图解析，初步其为乌头碱8位乙酰氧基与15位的氢结合掉一个乙酸基的产物。以下为乌头碱水解产物及不稳定性产物结构示意图乌头胺乌头碱8位水解产物乌头碱不稳定性产物乌头碱 三乌头碱体外代谢研究1. 动物的诱导与肝微粒体的制备 Wistar种大鼠，腹腔注射苯巴比妥生理盐水溶液60mg/kg，每天一次，连续三天按文献报道的二次离心法制备肝微粒体，用Lowry法测定蛋白含量。2. 温孵体系的优化 依据乌头碱的结构特点及已有的文献工作，设计了乌头碱的有氧大鼠肝微粒体体外温孵体系，该体系组成为：大鼠肝微粒体（Microsome protein）、NADP、NADH、G-6-PDH、G-6-P、Mg2+。 大鼠肝微粒体体外温孵优化方案，如表一所示。表一乌头碱肝微粒体温孵优化体系（5mL）GroupMicrosomeProteinmg/mLNADPmmoL/LNADHmmoL/LG-6-PmmoL/LG-6-PDHIU/LMg2+mmoL/LAconitinemg/5mL16.02.0/20.02.08.01.026.01.02.020.02.08.01.036.02.01.020.02.08.01.546.02.01.020.02.08.00.556.02.01.020.02.08.01.066.02.01.020.02.08.0/Control6.02.01.020.02.08.01.0 具体操作：乌头碱用尽量少的甲醇溶解后，用pH7.4的Tris-HCl缓冲液定容于5mL，加一滴吐温-80，在适量的Tris-HCl缓冲液中加入肝微粒体、NAHP、NADH、G-6-P、G-6-PDH及Mg2+，于37水浴中振摇2 min后，加入乌头碱溶液，继续振摇，每20min在液面上通O2半分钟，1.5 h后撤去水浴，中止代谢反应。 对照组在配制好代谢体系后，沸水浴中加热使酶失活，然后加入Tris-HCl缓冲液助溶的乌头碱，其他操作同样品组。 通过比较乌头碱在几种温孵体系中的代谢情况，确定了如下温孵体系组成：微粒体蛋白 6.0mg/mL；NADP 2.0mmoL/L; NADH 1.0mmoL/L; G-6-P 20mmoL/L; G-6-PDH 2.0IU/mL;MgCl2 8.0mmoL/L;aconitine 1mg/5mL.3. 温孵体系的样品处理与代谢产物HPLC分析 温孵体系的样品用乙酸乙酯3mL3提取,离心,合并有机层,减压蒸干,残留物溶于1ml甲醇中,供HPLC分析. 采用Waters2690HPLC-DAD进行分析,色谱柱(250mm4.6mm)内填5mHalsil Rp-18固定相,流动相为甲醇-水(0.04%三乙胺,0.5%乙酸)(60:40),检测波长240nm.根据乌头碱体外温孵体系提取物的HPLC-DAD图谱,与乌头碱的HPLC-DAD的图谱比较，根据紫外图谱的比较, tR为14.9,13.8,12.2,10.2,及7.1min的峰与乌头碱具有相似 的 紫外图谱，可能为乌头碱的代谢物。结合 LC-MS的 结果进行 判断， 初步判断tR 14.9 min的色谱峰为乌头碱N去乙基代谢物。四.乌头碱体内代谢研究1.药物混悬液的制备 称取乌头碱标品0.6mg（0.2mg/kg体重），滴加吐温-80 4滴，加入适量双蒸水，超声混匀，配制成0.04mg/mL的混悬液2.大鼠尿液的收集 雄性纯种SD大鼠（31010g）20只，禁食12h后，置代谢笼中，以5%蔗糖生理盐水维持，收集0-24h的空白尿液。将20只大鼠分为两组，每次给药前禁食12h，口服灌胃给药，分别收集0-8h，8-24h，24-48h的尿液，前8h以5%蔗糖生理盐水维持，后8-24h以生理盐水维持，每组累积给药12次，将累积的尿液于-20储存备用。3.尿样的水解 将所累积的尿液空白、0-8h、8-24h、24-48h各取约200mL，用稀HCl（1：10）调pH值为2，于沸水浴中1h，取出冷却后，用NaOH 溶液调pH值为7，再用1moL/ L的NaHCO3调pH值至9，-20冷藏，留待处理。4.尿样的预处理因乌头碱给药后，有一副作用为小便失禁，因而所收集的尿样较多，因而采用冷冻干燥有机溶剂提取的方法。流程如下：尿样 1moL/L NaHCO3调节pH值至9冷冻干燥（至完全干透） 30mL乙酸乙酯提取三次合并提取液 减压蒸干残渣（定容供HPLC检测）5.体内代谢产物的HPLC-DAD及LC-MS分析检测尿样预处理后的残渣用适量甲醇溶解，有不溶物，离心，取上清液进行HPLC-DAD分析，色谱条件同前。0-8h尿样的HPLC-DAD的色谱条件中，流动相甲醇：水配比