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刍 球中龟药 2 O O 9 年7 月 第2 9 卷 第7 期 J ilin J o u m a l o f T ra d it io n a l C h in e s e M e d ic in e 2 0 0 9 V o 1 2 9 N o 7 6 2 1 实 验 x 0 1 究 脑缺血后抑郁大 鼠海马 N MD A受体表达及 中药的干预作用 黄育玲 唐启盛 徐 向青 赵瑞珍 侯秀娟 1 北京中医药大学 北京 1 0 0 0 2 9 2 北京中医药大学第三附属医院 北京 1 0 0 0 2 9 3 山东中医药大学附属 医院 山东 济南 2 5 0 0 1 1 4 北京中医药大学东方医院 北京 1 0 0 0 7 8 摘 要 目的 观察脑缺血后抑郁模型大鼠脑内N M D A受体 N R1 N R 2 B m R N A的表达及 中药颐脑解郁方 的 干预作用 方法 复制脑缺血后抑郁大鼠模 型 采用逆 转录 P C R R T P C R 的方法 观察 大鼠海马 N M D A受体 N R 1 N R 2 B m R N A的表达 结果 脑缺血后抑郁模 型大鼠海马的 N R 1 N R 2 B m R N A的表达较正常组明显升高 P 0 0 1 经 中药颐脑解郁方干预后海马 N R l m R N A表达较模型组显著 降低 P 0 0 1 N R 2 B m R N A表达较模型 组降低 P 0 0 5 假手术大鼠海马 N R 1 m R N A表达 明显升高 P 0 0 1 N R 2 B mR N A表达升高 P 0 0 5 结论 脑缺血后抑郁模型大 鼠脑内N M D A受体 N R1 N R 2 B m R N A表达升高 中药颐脑解郁方能使之明显下调 提 示颐脑解郁方治疗脑缺血后抑郁状态的作用机制可能与下调脑 内N M D A受体 N R 1 N R 2 B m R N A表达有关 关键词 脑缺血后抑郁 中药疗法 N M D A受体 颐脑解郁方 治疗应用 中图分类号 R 2 8 5 5 文献标识码 A 文章编号 1 0 0 3 5 6 9 9 2 0 0 9 0 7 0 6 2 1 0 3 脑缺血后抑郁症是发生在缺血性卒中后 的一种 包括多种精神症状和躯体症状的复杂 的情感性精神 障碍性疾病 它发病率较高 影 响卒 中后的康复 可 使住院时间延长 死亡率升高 直接影响了患者的生 活质量和躯体功能康复 研究显示谷氨酸离子型受体 N M D A受体的功能 与抑郁症相关 1 j 而 N MD A受体 与脑 缺血后抑郁症 的关系则无文献报道 本研究探讨 了脑缺血后抑郁 模型大鼠脑内N M D A受体 N R 1 N R 2 B m R N A的表达及 中药颐脑解郁方 的干预作用 旨在进一步 阐明脑缺 血后抑郁症的发病机理 寻找抗抑郁作用的新靶点 1 实验材料 1 1 实验动物二级雄性 Wi s t a r 大 鼠 4 0只 体重 2 0 0 2 0 g 购 自中国医学科学院实验动物研究所 合格证编号 S C X K 京 采用颗粒型普通大鼠饲料 饲养 饮用 自来水 光照周期 1 2 h以模拟正常昼夜生 理节奏 7 0 0 1 9 0 0光照 l 9 0 0 7 0 0黑暗 室 内 温度 2 3 1 o C 相对湿度 6 0 7 0 基金项目 国家自然科学基金资助项 目 3 0 5 7 2 3 8 9 1 2 药 品与试 剂 盐 酸 氟西 汀 E l i L i l l y C o m p a n y L i m i t e d 按照成人用量 0 3 3 m g k g d 7倍计算大 鼠 用量为 2 3 1 m g k g d 临用时溶于蒸馏水中混匀 浓度为 0 2 3 1 g L 颐脑解郁方药 北京 中医药大学 中 药鉴定教研室鉴定 方药组成为 刺五加 2 0 g 栀子 1 0 g 五味子 1 0 g 等 使用前按 照灌 胃剂量 煎药浓 缩 浓度 0 6 2 g m l 生药 贮存于 4 冰箱 中备 用 临 用前加热 1 1R I Z 0 l 试剂 美 国 I n v i t r o g e n公 司 M M L V逆转 录酶 P C R试剂 P r o m e g a 公司 琼脂糖 S i g m a 公 司 引物由北京奥科生物技术有限责任公司合成 1 3 仪器游泳用水箱 I i Z Q C空气振荡浴 哈尔滨 市东明医疗仪器厂 自制的大鼠黑白颠倒箱 高速冷 冻离心机 德 国 S I G M A公司 紫外分光光度计 U N I C A M公 司 图像摄录分析系统 法 国 a m p h a r m a c i a 公 司 P C R仪 德 国 M J 公司 2 实验方法 2 1 脑缺血后抑郁大鼠模型的建立动物购进后适 6 2 2 2 0 0 9 年7 月 第2 9 卷 第7 期 J ilin J o u m a l o f T ra d itio n a l C h in e s e M e d ic in e 2 0 0 9 V o 1 2 9 N o 7 考球中 萌 应陛饲 养 1周 采用 O P E N F I E L D法进 行行 为学 评 分 选择评分相近的大鼠随机分组 分为正常组 脑缺 血后抑郁组 中药治疗组 西药对照组 假手术组 共 5 组 每组 8只 脑缺血后抑郁组 模型组 中药治疗组 西药对 照组按照唐启盛等l 2 J 报道方法复制脑缺血后抑郁状 态大鼠模型 先行去皮层血管 手术 具体方法为 用 1 0 水合氯醛 4 o o m g k g体重 麻醉大 鼠 头顶部备 皮 剪开头部皮肤 暴露颅骨 应用牙科钻分别在左侧 颅骨钻 6 个孔 用 眼科剪 翻开左侧颅骨 暴露左侧硬 脑膜 用虹膜剪轻轻剪开硬脑膜 露出软脑膜 使用沾 了生理盐水的棉签轻轻擦拭 在解剖显微镜下 至镜 下见不到血管为止 缝合皮肤 手术后恢复性饲养 1 周 开始分笼饲养 接受 2 1 d的不可预知性慢性应 激 包括 3次 2 4 h禁食 3次 2 4 h禁水 3次通宵 照 明 3次 4 C冰水 游泳 5 m i n 3次 4 5 C烘 箱热刺激 5 m i n 3 次 1 m i n 夹尾 3 次 3 0 m i n 高速水平振荡 1 6 0 次 m i n 每天随机选取一种刺激方法 共 2 1 d 慢 性刺激结束后第 1 d开始干预 脑缺血后抑郁组灌 胃 双蒸水 西药治疗组 中药治疗组分别灌 胃百优解和 中药 灌胃体积为 1 m I Jl 0 0 g 体重 根据大鼠体重变 化每周调整灌 胃量 共灌胃 6 周 假手术组 大 鼠用 1 0 水合 氯醛 4 0 0 m g k g体 重 麻醉 头顶部备皮 剪开头部皮肤 暴露颅骨 应用 牙科钻分别在左侧颅骨钻 6 个孔 用眼科剪翻开左侧 颅骨 暴露硬脑膜后 即缝合皮肤 恢复性饲养 1周 后 同脑缺血后抑郁组同时进行分笼饲养及 2 1 d不 可预知性慢性应激 应激结束后灌胃双蒸水 共 6周 正常组常规饲养 2 2 脑缺血后抑郁大鼠海马 N R 1 N R 2 B m R N A表达 测定 2 2 1 取材将大鼠断头处死 在冰上剥离大脑 取 左侧海马 8 0 m g 迅速放入 E p管 投入液氮 中 随后置 于 一 7 0 冰箱保存备用 2 2 2 总 R N A的提取将脑组织置于玻璃研 磨器 中 加 1 m L冰冷的 T R I z o l 反复吹打 加 2 0 0 氯仿 剧烈振荡 1 5 S 室温放置 2 m i n 4 C 1 2 0 0 0 r m i n离 心 1 5 m i n 取上层水相 加等体积 的异丙醇 颠倒混 匀 室温放置 1 0 m i n 离心 1 5 ra i n 弃上清 7 5 乙醇 漂洗 2 遍 真空抽吸干燥 加 加 L无 R N A a s e水溶 解 取 2 tz L样品 4 0倍稀释 用紫外分光光度计检i 贝 0 2 6 0 2 8 0 2 3 0 n i l 波长下 的光密度值 计算总 R N A的 浓度及纯度 另取 2 样品 行 0 9 琼脂糖凝胶电 泳 显示出 1 8 S 和 2 8 S 两条 R N A电泳条带 表明 R N A 完整 剩余样品 一7 0 C冻存 2 2 3 R T P C R反应 m R N A反转 录为 c D N A 取约 3 g 左右的样品 调整体积 l 2 加 O l i g d T 2 混 匀 9 5 C 3 m i n变性 立即置于冰上 在上述反应体 系中 依次加入缓 冲液 5 t t L d A T P d C T P d T r P d G T P 各 1 2 5 t t L R N A酶抑制剂 0 5 t t L M ML V逆转 录酶 0 5 混匀 4 2 温育 6 0 m i n 9 5 3 m i n变性 立 即置于冰上 一2 0 q C 冻存 N R 1 N R 2 B引物序列参考 L e k i s h v i l i 4 j 的方 法确 定 由北 京 奥 科 生 物 技 术 有 限 责 任 公 司 合 成 N R 1 m R N A引物序列为 上游引物 5 G C A C G C C T I T A T C q V G G A C T C 3 下 游引物 5 G T C G G G C q L 3 V A 2 T C T A C C A C T 3 扩增长度为 4 4 2 b p N R 2 B m R N A引物序 列为 上游引物 5 A G G C T C A G A A G A A G A A T C G G A 3 下游引物 5 A T G T C C T F C q W G A A A C G A C C T 3 扩增长 度为 4 6 6 b p P C R反应 反应体系中依 次加入双蒸水 7 5 P C R Mi x l 2 5 L 上 下 游 引 物 各 1 0 u L R T产 物 3 0 总反应体 系 2 5 反应 条件 为 9 4 C变性 5 m i n 后 变性 9 4 3 0 S 退 火 5 8 o 3 0 S 延伸 7 2 6 0 S 共 2 8个循 环 7 2 C延伸 8 m i n 扩增 完毕 行 1 2 琼脂糖凝胶电泳 2 2 4 R T P C R扩增产物相对定量分析 取 P C R产 物 1 0 与 1 5 上样缓冲液混合后 行 1 2 琼脂 糖凝胶电泳 1 h 1 0 0 V 1 0 0 b p M a r k e r 上样 1 5 电 泳结束后 取 出凝胶 放人凝胶成像仪 中 用 I m a g e M a s t e r V D S 图像摄录分析系统对 电泳条带进行光密 度扫描 以平均吸光度乘 以条带 面积表示 总 A值 将样品扩增产物的 A值与 m ark e r 中0 5 b p条带的 A 值的比值作为 m R N A表达水平的参数 对所有样品的 N R 1 和 N R 2 B m R N A的表达进行半定量分析 2 3 统计方法检测结果以均数 标准差 互 s 表 示 应用 S P S S 1 1 5统计分析系统 多组问比较采用单 因素方差分析并做组间两两 比较 3 实验 结果 脑缺血后抑郁大鼠海马 N R 1 N R 2 B m R N A表达显 著增强 与正常组相 比 具有统计学意义 P 0 0 1 假手术大鼠海马 N R 1 N R 2 B表达增强 中药治疗组和 西药对照组大 鼠海马 N R 1 m R N A表达较模型组显著 降低 P 0 0 1 N R 2 B m R N A表达较模型组降低 P 击球中 药 2 0 0 9 年7 月 第2 9 卷 第7 期 J ilin J o u m a l o f T ra d it io n a l C h in e s e M e d ic in e 2 0 0 9 V o 1 2 9 N o 7 6 2 3 0 0 5 见表 1 表 1 各组 大鼠海马 N R 1 N R 2 B n d N A表达 比较 t 注 与 正 常组 相 比 i P 0 0 5 P 0 O l 与 模 型 组 相 比 P 0 0 5 P 0 0 1 4 讨论 N M D A受体属于离子型谷氨酸受体 它广泛存在 于神经元上 通过受体的激活 可直接使细胞膜 上的 离子通道开放 导致细胞膜对 C a 2 的通透性增加 细 胞内钙超载 最终导致细胞死亡 这个作用机制在外 伤 缺氧 缺血引起的急性神经死亡 以及慢性神经退 行性改变和神经代谢疾病的研究中引起广泛重视 l 5 J 有研究提示 N M D A受体拮抗剂具有抗抑郁效果 其 作用机制还不清楚 可能与其下调 J3 肾上腺素受体 提高 5 羟色胺功 能有关 也有实验发 现 躁狂动物 N M D A和 A MP A受体亚单元的水平均有所提高 并且 N MD A受体上甘氨酸结合位点与甘氨酸的亲和力提 高 阻断 N MD A受体可 以减 弱这些作用 6 j 因此 N MD A受体的调节可能与脑缺血后 抑郁状态存在一 定关系 本课题组 在前期的研究工作 中 提 出 肾精亏虚 肝气郁结是脑缺血后抑郁症的基本病机 并据此确立 益肾调气的治疗法则 拟定颐脑解郁方治疗脑缺血后 抑郁症 在临床上取得 了很好 的疗效l 8 j 且通过对脑 缺血后抑郁大鼠模型脑内受体后 c A M P P K A C R E B信 号通路的研究 发现脑缺血后抑郁大鼠脑皮质及海马 受体后 c A M P P K A C R E B信号通路系统下调 颐脑解 郁方能使之上调 因此该药的抗抑郁作用可能与调节 受体后 c A MP P K A C R E B信号通路有关 在此基础上 本研究采用逆转录 P C R的方法 观 察脑 缺 血后 抑郁 大 鼠模 型 海 马 N M D A受 体 N R 1 N R 2 B m R N A的表达 发现脑缺血后 抑郁 大 鼠模 型脑 内 N MD A受体表达明显上调 颐脑解郁方可使 N M D A 受体表达下调 提示脑缺血后抑郁状态下脑 内 N M D A受体表达上调 激活离子通道 导致细胞 内钙超 载 最终引起神经细胞死亡 而颐脑解郁方的抗抑郁 作用可能与调节 N MD A受体表达 从而减轻神经细 胞损伤有关 参考文献 1 李小白 黄继忠 王祖成 抑郁症与谷氨酸传导 J 中国新 药与临床杂志 2 0 0 5 2 4 8 6 0 1 2 唐启盛 裴清华 侯秀娟 脑卒中后抑郁状态动物模型的建 立 J 北京中医药大学学报 2 0 0 4 2 7 3 3 3 3 6 1 3 L e k i s h v i l i T H e s k e t h S B r a z i e r M W e t a 1 M o u s e g al e c t i n 1 i n h i b i t s t h e t o x i c i t y o f g l u t a ma t e b y m o d i f y i n g N R1 NMD A r e c e p t o r e x p r e s s i o n J J o u r n a l E u r J N e u r o se i 2 0 0 6 2 4 1 1 3 0 1 7 3 02 5 1 4 j G r o c L H e i n e M C o u s i n s S L e t a 1 N M D A r e e e p t o r s u r f a c e m o b i l i t y d e p e n d s o n N R 2 A 2 B s u b u n i t s J J J o u r n a l P r o c N a il A c a d S c i U S A 2 0 0 6 1 0 3 4 9 1 8 7 6 9 1 8 7 7 4 5 李刚 金蓓 肖艳 谷氨酸受体系统与药物作用的靶 点 J 航空航天医药 2 0 0 5 1 6 3 5 3 6 N o w a k G R e d m o n d A Mc N a m a r a M e t a1 S w i m S t r e s s i n c re a s e s t h e p o t e n c y o f gl y c i n e a t th e N m e t h y l D a s p a r ta t e r e c e p t o r e o m p l e x J J N e u r o c h e m 1 9 9 5 6 4 9