高效液相色谱法在石斛质量分析中的应用进展.doc

高效液相色谱法在石斛质量分析中的应用进展摘要：高效液相色谱法是60年代末发展起来的一项新技术，具有分离效能高，准确性好，分析速度快等优点。随着HPLC技术的不断发展，在石斛属植物的研究方面的应用也日益广泛，HPLC法在石斛属植物质量控制、指纹图谱建立以及有效成分的分离、化学成分测定中占有重要地位。关键字：高效液相色谱法;石斛; 质量控制; 指纹图谱研究;有效成分分离测定石斛属(Dendrobium Sw. )是兰科植物中一个较大的属, 全世界约1 100种, 广泛分布于亚洲、欧洲和大洋洲等地, 我国有74种2变种, 分布于秦岭以南诸地区, 尤其以云南、贵州为多1。在我国传统医学中, 石斛为常用贵重药材, 药用历史悠久,具有益胃生津, 滋阴清热等功能, 用于阴伤津亏, 口干烦躁, 食少干呕, 病后虚热, 目暗不明。现代药理学研究表明, 石斛具有抑制肿瘤、抗衰老、增强人体免疫力和扩张血管等作用2。中华人民共和国药典2000 年版收载的石斛为环草石斛D. loddigesii Rolf, 马鞭石斛D. fimbria tum Hook. Var. oculafum Hook, 黄草石斛D. chrysanthumWa ll, 铁皮石斛D. candidum Wa ll ex Lindl, 金钗石斛D. nobile lindl。2010 年版中华人民共和国药典中记载为兰科植物金钗石斛Dendrobium nobile Lindl、鼓槌石斛Dendrobium chry sotoxum Lindl、或流苏石斛D -endrob ium f im briatum Hook. var. oculatum Hook. 的栽培品及其同属植物近似种的栽培品的新鲜或干燥茎3 。金钗石斛和鼓槌石斛茎形态特异分别呈扁圆柱形和呈粗纺锤形, 易于区分; 而以流苏石斛为代表的其他黄草类石斛茎呈长圆柱形, 其近似种品种主要有叠鞘石斛D.aurantiacum Rchb. f.var.denneanum、束花石斛D.chrysanthum、报春石斛D.p rimulinum、玫瑰石斛D.crep idatum、兜唇石斛D.aphy llum、细叶石斛D .hancocki、密花石斛D.densif lorum 等。由于金钗石斛和鼓槌石斛目前已明确其专属性成分, 分别为石斛碱和毛兰素,2010版中华人民共和国药典分别针对其专属性成分制定了相应的鉴别及含量测定方法; 而流苏石斛等其他石斛, 由于种类较多, 目前仅有以石斛酚为指标的薄层鉴别检查, 尚无含量测定方法。此外, 石斛药材商品规格十分复杂, 其植物来源种类甚多, 主要有细黄草、粗黄草、大黄草和扁黄草等4。因此, 迫切需要建立简便、灵敏和可靠的定量分析方法, 以保证临床用药的安全。HPLC法是利用药用植物各组分在固定相和流动相中迁移速率不同而进行分离。植物各组分在色谱图上的色谱行为可用于植物鉴别。HPLC法不受样品挥发度和热稳定性的限制，几乎能够分析所有的有机、高分子及生物试样,具有流动相选择性广、重现性好、色谱柱可反复使用, 分离效能高、分析速度快及应用范围广等特点5, 使HPLC法在中药质量控制、指纹图谱建立以及化学成分测定中占有重要地位。本文对高效液相色谱法在石斛属植物研究中的应用综述如下:1. 高效液相色谱法( high performance liquid chroma2tography. HPLC)在石斛质量控制中的应用。由于科学技术的迅速发展, 各学科间的相互渗透, 分析化学发生了巨大变化。药物分析已发展成为以仪器分析为主的现代药物分析。其中高效液相色谱法的应用, 并以计算机技术应用于药物分析中为药物提供了准确、快速、灵敏的分离分析方法, 使我们可以更有效地控制药品的质量。尤其是对于石斛属植物的质量控制, 随着生物技术的发展使生药分析在分子水平的检测成为可能。高效液相色谱法广泛应用于石斛属的活性成分、药材真伪及制剂质量分析, 为石斛属植物质量标准的规范奠定了坚实的基础。1994年马国祥等6采用反相高效液相色谱法测定18 种石斛类生药中chrysotoxene, erian in 和chrysotoxinede的含量, 结果表明大部分石斛中含有这3中成分或其中的1 2种, chrysotoxene含量最高的种类为报春石斛, erianin含量最高的种类为鼓槌石斛, 而几乎所有的种类都不含或只含极微量chrysotoxin. E。上海中医药大学中药研究所中药标准化教育部重点实验室徐蓓等7以联苄类成分杓唇石斛素和石斛酚为指标成分, 建立了采用H PLC 进行石斛含量测定的方法。采用反相C18色谱柱, 以乙腈-0.01%三氟乙酸为流动相进行梯度洗脱。通过对18种不同来源石斛及18批商品石斛的含量测定, 表明所建方法灵敏、准确、可靠, 为中药石斛的质量控制提供科学依据。郝冉等8通过采用薄层色谱( TLC ) 法对石斛爽目软胶囊中的石斛、白芍及柴胡进行定性鉴别, 并采用高效液相色谱(H PLC )法测定芍药苷的含量探讨石斛爽目软胶囊的质量控制方法TLC 法和H PLC 法可快速、准确地对石斛爽目软胶囊中的成分进行定性、定量检测, 可用于该制剂的质量控制。北京市药品检验所李琰等9修订了显微鉴别项，增加了人参、黄连、川芎的薄层鉴别项采用高效液相色谱法测定黄连中盐酸小檗碱的含量，建立了石斛明目丸的薄层色谱鉴别与含量测定方法。对10 批次的样品延胡索乙素含量测定结果表明：本方法的建立，提高了原制剂的质量标准，加强了制剂的质量控制。2. 高效液相色谱法( high performance liqu id chroma2tography. HPLC)在石斛指纹图谱建立研究中的应用。由于高效液相色谱仪的诸多优点并能对中药样品中含有的绝大多数成分进行分析检测及质量评价，故高效液相色谱技术已成为当前研究中药指纹图谱的主要手段。欧洲国家现在普遍采用高效液相色谱法对植物药物中已知及未知组分进行控制，并形成相应的规范。因此高效液相色谱法在构建中药指纹图谱对中药的定性鉴别与定量分析中得到广泛应用。采用高效液相色谱法测定指纹图谱可对中药材的产地、采收时间、加工方法、工艺流程等多方面通过化学成分的差异来反映中药材的种属差异、真伪鉴别等,从而达到控制中药质量的目的。近年近年来,HPLC指纹图谱在石斛属植物的研究中得到了广泛的应用。中国药科大学分析测试中心张尊建10用HPLC /UV 与HPLC/MS技术对中国药典( 2000版)收载的五种石斛的色谱指纹图谱进行了研究, 建立了密花、马鞭、短棒、鼓槌和金钗石斛的色谱指纹图谱, 并对其中3种石斛HPLC /MS指纹图谱中的色谱峰进行了解析, 共对15个谱峰进行了化学成分的初步归属, 为全面质量控制及化学成分研究提供参考。2004 年张尊建等【11】同样采用HPLC/UV与HPLC /MS技术对密花石斛进行指纹图谱研究, 得到分离度较好的密花石斛HPLC /UV指纹图谱, 标示了9 个共有峰, 并用HPLC /MS对其部分色谱峰进行了初步定性，为密花石斛的质量控制提供了参考。 南京中医药大学殷放宙等12采用梯度洗脱的方法, 以Kromasil【R】KR10025C18(250 mm 416 mm , 5 Lm) 为分析用色谱柱, 以乙腈2014% 磷酸溶液为流动相建立了铁皮石斛药材的RP-HPLC指纹图谱, 并进行了相似度的计算。建立了铁皮石斛药材的RP-HPLC 指纹图谱，使铁皮石斛中各成分得到较好的分离, 并根据检测结果确定了15 个共有指纹峰。证明了RP-HPLC指纹图谱检测方法简便、重现性好, 可作为铁皮石斛药材质量控制的重要方法。广州中医药大学中药资源科学与工程研究中心欧焕娇等13采用Phenomenex prodigy ODS(3) C18色谱柱(250 mm 416 mm, 5m) ,乙腈-0.1%乙酸溶液梯度洗脱,柱温25,流速110 mL /min,检测波长254 nm，建立了金钗石斛药材中黄酮类和酚类成分的HPLC指纹图谱。使金钗石斛中黄酮类和酚类成分得到较好的分离,并根据检测结果选定了10个共有指纹峰。为金钗石斛药材质量控制提供了参考。中国药科大学分析测试中心王源园等14采用HPLC/UV/MS法具体方法是采用Agilent Zorbax SB-C18柱（250mm*4.6mm, 5m）,以乙腈和0.05%甲酸为流动相进行梯度洗脱，流速1.0王mL /min，检测波长265nm;柱温25，对鼓槌石斛进行指纹图谱研究，得到较好的鼓槌石斛HPLC/UV指纹图谱，并用HPLC /MS对其部分色谱峰进行了初步归属。为鼓槌石斛的全面质量控制提供了参考。中国医学科学院中国协和医科大学药用植物研究所生物技术中心陈晓梅等15用用HPLC/MS技术，对真菌诱导子处理的人工培养的铁皮石斛原球茎与对照原球茎、人工栽培的铁皮石斛的HPLc-Ms指纹图谱分别进行了比较分析，了解真菌诱导子对铁皮石斛原球茎化学成分的影响，以及诱导子处理的原球茎与铁皮石斛的化学成分差异，为深入开发利用铁皮石斛原球茎奠定理论基础。3. 高效液相色谱法( high performance liqu id chroma2tography. HPLC)在石斛有效成分的分离、化学成分测定中的应用.HPLC 具有分离效能高, 分析速度快, 灵敏度高及应用范围广的特点, 在各种色谱技术中, HPLC 是分离与纯化药物以及测定药物含量的最佳选择。在新世纪中, HPLC 技术由于具有其他方法无法比拟的特点及强大的分离能力必将成为分离与纯化及含测领域中的主要方法之一。16下面是高效液相色谱法在石斛有效成分的分离、化学成分测定中的应用进展：成都中医药大学李旻等17以从川产迭鞘石斛中分离得到的香豆素为指标性成分，建立其薄层色谱（TLC）鉴别方法和高效液相色谱（HPLC）含量测定方法，以较全面地反映其内在质量，为控制迭鞘石斛的质量和进一步开发川产迭鞘石斛资源提供依据。中国医学科学院-北京协和医学院药用植物研究所李燕等18为了研究铁皮石斛的化学成分，利用硅胶、凝胶柱色谱及制备高效液相色谱等方法进行分离, 根据光谱数据和理化性质鉴定其结构。并利用1, 1-苯基苦基苯肼( DPPH )自由基清除实验评价分得的化合物的抗氧化活性。从铁皮石斛的脂溶性部位分离得到了15个酚性化合物及2个二氢黄酮类化合物，证明了铁皮石斛化合物的活性强弱与结构之间存在一定的相关性。中国药科大学生药学研究室、 上海中医药大学中药研究所张光浓等19建立了球花石斛中滨蒿内酯和泽兰内酯组分的HPLC-UV 定量方法,并测定了4 个不同产地16 批次球花石斛药材、球花石斛不同部位及其他22 种石斛中该两种成分的含量。证明HPLC-UV 定量方法简便、准确、重复性好,为球花石斛的质量控制提供了一定的依据。中国医学科学院-中国协和医科大学药用植物研究所李墅等20采用Waters XTerraTM RP18 色谱柱（3.9 mm150 mm，5 m），流动相为乙腈-水-三乙胺（21790.005），流速为1 mLmin-1，检测波长为210 nm。建立一种用HPLC 测定石斛中石斛碱含量的方法，结果石斛碱在30.9618 mgL-1内与峰面积呈良好的线性关系，回归方程为Y=3 191.5+14 191（r=0.999 9），平均回收率为99.11%，RSD 为2.60%。证明应用HPLC 测定石斛中石斛碱含量的方法简便、准确、可行。沈阳药科大学药学院周婧等21建立了基于UFLC-IT-TOF MS/MS 的石斛枫斗中酚酸类成分分析方法, 对18 个批次6 大类的石斛进行分析, 对其LC-MS 图谱进行了相似性比较, 表明不同石斛种属间存在较大的化学组成差异。结合质谱信息和文献数据对其中18 个酚酸类化合物进行了初步定性。根据生物学活性及生理意义,在共有化合物中选择杓唇石斛素和石斛酚作为质量评价的指标性化合物, 进而建立HPLC 检测方法。该方法将为进一步研究石斛类药材的质量控制及其药效学差异提供科学依据。4结论综上所述, 采用高效液相色谱法, 获得石斛属不同个体的化学成分信息, 以图形图案方式表达, 进行对比和分析, 可实现石斛未知物质群整体的质量与控制水平,是实现多种成分整体相关质量评价的关键技术, 也是石斛中药创新、研究开发、质量鉴别、鉴定的必要技术手段。尽管现代分析技术在石斛研究中的方法较多, 但高效液相色谱法应是主流方法, HPLC色谱技术已成为大家所公认的3种常规分析手段, 是目前我们研究中药指纹图谱应优先考虑的方法。随着各种分析技术的创新和提高以及世界各国对天然药物了解和研究的不断深入, 石斛的研究将会从方法学的层面逐渐向实际规范标准的方向发展, 使其在方法学和技术方面都更趋成熟和完善, 其研究成果将大大提升石斛质量控制的水平, 为加快实现中药现代化和国际化奠定坚实的技术基础。参考文献1 王康正. 石斛属植物化学成分与药理活性研究进展. 中草药, 1997, 28( 10): 633.2 陈小明. 石斛属植物化学成分及药用活性研究. 天然产物研究与开发, 2001, 13( 2): 70 74.3 国家药典委员会. 中华人民共和国药典: 一部M . 9 版. 北京: 中国医药科技出版社, 2010: 85.4 张婷( Zhang T ) . 中药石斛的分子鉴定及质量评价研究 D . 南京: 中国药科大学, 2005.5 于世林. 高效液相色谱方法及应用. 化学工业出版社, 2001,北京.6 马国祥, 徐国均. 反相高效液相色谱法测定18种石斛类生药中chrysotoxene, erian in 及chrysotoxine 的含量. 中国药科大学学报, 1994, 25( 2):103105.7 徐培，杨莉，王铮涛.高效液相色谱法评价中药石斛的质量.中国药科大学学报，2010,41（5）：467470.8 郝冉, 邵海峰. 石斛爽目软胶囊的质量控制方法探讨. 临床合理用药.2010,3(14).9 李琰，傅欣彤. 石斛明目丸质量标准研究. 中国实验方剂学杂志.2010,16(18).10 张尊建, 王源园. 五种石斛的指纹图谱研究. 中国药科大学学报, 2003, 34( 6): 534 540.11张尊建, 王兴旺. 密花石斛的HPLC/UV /MS指纹图谱研究. 中草药,