蛋白质的分离纯化技术研究进展.doc

蛋白质的分离纯化技术研究进展刘京（江南大学食品学院，江苏无锡，214122）摘要：蛋白质分离纯化是蛋白质产品工业化生产的关键之一。文中分析了蛋白质分离纯化的特点, 指出了分离纯化蛋白质应解决的一些问题。根据蛋白质的酸碱性质、分子大小与形状、溶解性质及其与配体亲和性等, 对其分离纯化方法进行了综述。关键词：蛋白质; 提取; 分离; 纯化Abstract：The protein mass separation purification is one of protein product industrialization production keys. In the article has analyzed the protein mass separation purification characteristic, had pointed out the separation purification protein should solve some questions. According to protein acid and alkali nature, molecular size and shape, dissolved nature and with ligand endophilicity and so on, separated to it purifies the method to carry on the summary.Keywords：protein; extraction; separation; purification具有生理活性的蛋白质类物质在维持现代人类健康方面已必不可少，在医疗和食品领域已逐渐得到应用。蛋白质具有广泛的功能性质，每一种性质都会给食品及其加工过程带来特定的效果。因而可将这些功能蛋白质如乳清蛋白、蛋清蛋白、大豆蛋白等添加到食品中制得各种功能性食品。正是由于蛋白质与人类生活密切相关，所以对其质量和纯度要求也越来越高。蛋白质常存在于复杂的混合体系中，且稳定性较差，对温度、pH、机械剪切力等非常敏感、易于变性。因此本文针对近年来有关蛋白质的分离纯化技术所取得的进展进行了综述, 为今后的理论和应用研究提供依据。1 蛋白质分离纯化的特点和存在的问题1.1 蛋白质分离纯化的特点1) 大多数蛋白质产品是生物活性物质, 在分离纯化过程中, 有机溶剂、溶液pH 值、离子强度的变化均可使蛋白质变性失活。2) 蛋白质产品在物料中含量很低, 且物料组成非常复杂。例如, 利用基因工程菌发酵生产蛋白质, 物料中含有大量组成复杂的培养基、菌体生产代谢物等, 目标蛋白质的含量常常不到蛋白质总量的1%。有些目标蛋白质存在于细胞内或在胞内形成包含体, 为获取蛋白质, 还需进行细胞破碎, 结果物料中含有大量的细胞碎片和胞内产物。3) 含蛋白质产品的物料不稳定, 蛋白质产品易受料液中蛋白水解酶降解。4) 很多蛋白质产品作为医药、食品被人类利用, 因而要求蛋白质产品必须是高度纯化的,产品无菌、无致热源等。1.2 实现蛋白质产品的分离纯化应解决的问题1) 设计蛋白质产品分离纯化的最佳工艺, 用最少的分离步骤获得最大的产率, 同时确保蛋白质产品的纯度。2) 发展蛋白质纯度的快速分析检测技术。在下游的各道工序, 准确、快速地对蛋白质产品进行纯度分析和活性检测, 以保证产品的质量。3) 搞好上、中、下游技术的配合, 便于蛋白质产品的分离纯化。大多数蛋白质产品的分离纯化, 需消耗大量的人力、物力, 因此应尽可能改进上、中游技术, 减少下游过程负荷。2 蛋白质的分离纯化技术2.1 根据蛋白质分子大小不同的分离技术蛋白质是一种大分子物质, 并且不同蛋白质的分子大小不同, 因此可以利用一些较简单的方法使蛋白质和小分子物质分开, 并使蛋白质混合物也得到分离。2.1.1 超滤1,2 超滤法是利用压力或离心力, 使用一种特制的薄膜对溶液中各种溶质分子进行选择性过滤, 强行使水和其他小分子溶质通过半透膜, 而蛋白质被截留在膜上, 以达到浓缩和脱盐的目的。因此根据蛋白质分子大小的不同, 选择不同规格的滤膜进行超滤, 从而使蛋白质得到分离。樊晶等应用萃取- 超滤两步法从过期人血中提取人血红蛋白.2.1.2 凝胶过滤层析3,4凝胶过滤层析是一种简单而又有效的液相层析色谱技术。具有设备简单、操作方便、分离迅速及不影响分子的生物学活性等优点。目前已广泛应用于各种生物大分子物质的分离和纯化。混合物随流动相流经装有凝胶作为固定相的层析柱时, 混合物中各物质因分子大小不同而被分离,在洗脱过程中, 分子质量最大的物质因不能进入凝胶网孔而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外, 分子量最小的物质因能进入凝胶网孔而受阻滞, 流速缓慢, 致使最后流出柱外.凝胶层析的具体过程包括：1.凝胶的选择。2.凝胶的处理。3.装柱。4.加样。5.洗脱。6。保存。目前常用的凝胶有交联葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶等。在甘露糖蛋白提纯的过程中使用凝胶过滤方法可以得到很好的效果, 纯度鉴定证明产品为分子量约为32 kDa、成分是多糖：蛋白质、多糖为甘露糖的单一均匀糖蛋白。凝胶过滤在抗凝血蛋白的提取过程中也被用来除去大多数杂蛋白及小分子的杂质。2.2 根据蛋白质溶解度不同的分离技术影响蛋白质溶解度的外部条件有很多, 比如溶液的pH 值、离子强度、介电常数和温度等。但在同一条件下, 不同的蛋白质因其分子结构的不同而有不同的溶解度, 根据蛋白质分子结构的特点, 适当地改变外部条件, 就可以选择性地控制蛋白质混合物中某一成分的溶解度, 达到分离纯化蛋白质的目的。2.2.1 蛋白质的盐析5盐析沉淀是蛋白质和酶提纯工艺中最早采用，且至今仍广泛应用的方法。其原理是蛋白质在高浓度盐溶液中，随着盐浓度的逐渐增加，由于蛋白质水化膜被破坏、溶解度下降而从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀分离各种蛋白质。盐析法的特点是成本低，不需要特别设备，操作简单、安全，对蛋白质的一些生物活性成分破坏较少，缺点是选择性不强。应用实例有大豆异黄酮的提取和大豆蛋白质的分离，其基本工艺流程为：大豆豆粕乙醇提取过滤盐析离心。2.2.2 有机溶剂沉淀法5向蛋白质溶液中加入丙酮或乙醇等水溶性有机溶剂，降低水的活度，随着有机溶剂浓度的增大，水对蛋白质分子表面荷电基团或亲水基团的水化程度降低，溶液的介电常数下降，蛋白质分子间的静电引力增大，从而使蛋白质凝聚和沉淀。有机沉淀剂沉淀分离技术的特点是：1.选择性较高，即一定浓度的有机溶剂只沉淀分离某一种或某一类组分；2.沉淀后所得产品不需脱盐，残留的沉淀剂通过挥发即可除去。而有机沉淀剂对具有生物活性的蛋白质、酶类具有失活作用，因而常常需在低温下进行操作。应用实例有高粱蛋白质的提取，其基本工艺流程为：高梁粉萃取离心沉淀水洗烘干。2.2.3 等电点沉淀法5两性电解质在溶液pH值处于等电点时，分子表面净电荷为零，导致赖以稳定的双电层及水化膜的削弱或破坏，分子间引力增加，溶解度降低。等电点沉淀分离法的基本原理即通过调节溶液的pH值，使两性电解质的溶解度下降，从而沉淀析出。蛋白质是多价的两性电解质，通常在偏酸性溶液中带正电，在偏碱性溶液中带负电。一般蛋白质的等电点多在偏酸性范围内，故在等电点沉淀操作中，大多通过加入无机酸如盐酸、磷酸和硫酸等调节pH值。应用实例有大豆蛋白的“ 碱提酸沉”法，基本工艺流程为：豆粕原料二次碱提粗滤酸沉打浆回调改性喷粉成品。2.2.4 反胶团萃取法6,7反胶团是表面活性剂分子在非极性溶剂中自发形成聚集体。其中，表面活性剂分子亲水基向内、非极性疏水基朝外，形成球状极性核，核内溶解一定数量水后，形成宏观上透明、均一热力学稳定的微乳状液，微观上恰似钠米级大小微型“水池”。这些“水池”可溶解某些蛋白质，使其与周围有机溶剂隔离，从而避免蛋白质失活。通过改变操作条件，又可使溶解于“水池”中蛋白质转移到水相中，这样就实现不同性质蛋白质间分离或浓缩。胶团是表面活性剂分子在极性溶剂中形成一种亲水基团朝外，而疏水基团朝内的具有非极性内核多分子聚集体。与此相反，反胶团是表面活性剂分子在非极性溶剂， 如在某些有机溶剂中形成一种亲水基团朝内，而疏水基团朝外的具有极性内核多分子聚集体。反胶团内核可不断溶解某些极性物质，且还可溶解一些原来不能溶解物质， 因此具有二次增溶作用。反胶团核内溶解一定量水后，形成宏观上透明热稳定体系，微观上纳米级大小微型“水池”，可迸一步溶解核酸危氨基酸危蛋白质等生物活性物质。反胶团萃取技术可用于萃取蛋白质，包括-蛋白酶，细胞色素，核糖核酸酶，溶菌酶，脂肪酶，胰蛋白酶，胃蛋白酶，过氧化氢酶等。反胶团萃取技术在日化行业中，可用于一些化妆品原料及功能性添加剂如植物油、氨基酸及维生素等的提取。反胶团萃取在药物方面的应用主要集中在各种蛋白、抗体、抗生素的萃取上。2.3 根据蛋白质带电性质不同的分离技术根据蛋白质的电荷即酸碱性质不同分离蛋白质的方法有电泳和离子交换层析两类。2.3.1 电泳8,9在外加电场的影响下, 如果蛋白质不处于等电点状态, 它将向着与其自身电性相反的电极移动, 这种现象称为电泳。电泳是分离蛋白质和鉴定蛋白质纯度的重要方法, 由于不同的蛋白质分子所带的净电荷及分子大小和形状不同, 因而泳动速度不同, 移动距离不同, 从而得到分离。电泳的类型很多, 常用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳和等电聚焦电泳。孙臣忠等研究了聚丙烯酰胺电泳、等电聚焦电泳和等速提纯电泳在分离纯化蛋白质中的应用。结果发现, 聚丙烯酰胺电泳的条带分辨率低, 加样量不高; 等电聚焦电泳分辨率最高, 可以分离同种蛋白的亚成分, 加样量最小; 等速提纯电泳区带分辨率较高, 可将样品分成单一成分, 加样量最大。2.3.2 离子交换层析3离子交换剂是以纤维素或葡聚糖凝胶等不溶性物质为母体，通过酯化、醚化或氧化等化学反应，引入阳性或阴性离子基团的特殊制剂，可与带相反电荷的化学物质进行交换吸附。蛋白质在不同的pH 值缓冲液中，可带有游离的氨基（正电荷）或羧基（负电荷）。它们可以与离子交换剂的阴性或阳性基团进行交换吸附。当缓冲液中的离子基因与结合在离子交换剂上的蛋白质离子基团相竞争时， 亲合力小的蛋白质分子先被解吸而洗脱下来，而亲合力大者则后被解吸，而后洗脱下来。因此依靠增加缓冲液的离子强度和（或）改变酸碱度，即可改变蛋白质的吸附状态，使不同亲合力的蛋白质得以分离。离子交换层析优点是层析条件温和，分离能力强，洗脱缓冲液选择范围广泛等，也是目前广泛应用的大分子物质提纯的方法之一。离子交换层析可以应用于浓缩苹果汁中蛋白质的提纯。另外, 离子交换层析还用于抗凝血蛋白的提取。2.4 根据配体特异性的分离技术-亲和层析3,10蛋白质亲合层析是一种吸附层析， 它通过固定于水不溶性的支持物（载体）上的互补物（配体）的特异性和可逆性的吸附而使所需要物质获得纯化。其优点是条件温和、过程简单、纯化率高，而且活性物质回收率高，尤其对含量极少又不稳定的生物活性物质极为有效。但此法有其局限性，并不是任何生物大分子间都具有特异的亲合力。而且针对某一分离对象就要制备一种专门的吸附剂和寻找一种层析条件。先把待提纯的某一蛋白质的特异配基, 通过适当的化学反应共价地连接到象琼脂糖凝胶一类的载体表面的功能基上。一般在配基与多糖基质之间插入一段所谓连接臂或间隔臂使配基与凝胶之间保持足够的距离， 不致因载体表面的空间位阻妨碍待分离的大分子与其配基结合。这类多糖材料在其他性能方面允许蛋白质自由通过。当含有待提纯的蛋白质的混合样品加到这种多糖材料的层析柱上时， 待提纯的蛋白质则与其特异的配体结合因而吸附在配体的载体琼脂糖颗粒的表面上， 而其它的蛋白质，因对这个配体不具有特异的结合位点，将通过柱子而流出。被特异地结合在柱子上的蛋白质可用自由配体分子溶液洗脱下来。层析过程包括装柱、加样、洗涤收集等步骤，与凝胶过滤层析相同。近年来, 亲和层析技术被广泛应用于靶标蛋白尤其是疫苗的分离纯化, 特别是在融合蛋白的分离纯化上, 亲和层析更是起到了举足轻重的作用, 因为融合蛋白具有特异性结合能力。亲和层析在基因工程亚单位疫苗的分离纯化中应用也相当广泛。3.展望在实际工作中, 很难用单一方法实现蛋白质的分离纯化, 往往要综合几种方法才能提纯出一种蛋白质。理想的蛋白质分离提纯方法, 要求产品纯度和总回收率越高越好, 但实际上两者难以兼顾, 因此, 考虑分离提纯的条件和方法时, 不得不在两者之间作适当的选择; 一般情况下, 科研上更多地选择前者, 工业生产上更多地选择后者。因此, 每当需要提纯某种蛋白质时,首先要明确分离纯化的目的和蛋白质的性质, 以便选择最佳的分离纯化方法, 从而得到理想的效果。今后, 蛋白质提纯技术的发展将不断促进对蛋白质性质的研究, 同时对蛋白质性质的研究也将反过来提高蛋白质分离纯化技术, 两者的互相促进终将会对生命科学的进步作出重大贡献。参考文献1 樊晶, 陈连旺. 应用萃取-超滤两步法从过期人血中提纯人血红蛋白J.天津药学, 2002, 14( 1 ) : 33-35.2 A. 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