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DNA甲基化 ConradWaddington1905 1975 Theinteractionsofgeneswiththeirenvironment whichbringthephenotypeintobeing 1942 Theterm epigenetics wasfirstcoinedinthe1940sbyBritishembryologistandgeneticistConradWaddington 表观遗传学 表观遗传学 从根本上讲 表观遗传是环境因素和细胞内的遗传物质之间发生交互作用的结果 与中心法则不同 表观遗传学认为遗传信息并非单方向传递 环境因素也能改变遗传物质 目前表观遗传学研究主要集中在甲基化 组蛋白修饰 小RNA和染色质重塑等方面 玉米中有一个编码花青素合成途径中一种关键酶的基因B I 存在于各种组织中 通常其无效等位基因b导致花青素缺乏 对B I完全隐性 另一个等位基因B 则使叶片只产生少量色素 但事实上在F2及相继的后代中 仅有B 的表现型效应出现 即所有植株均为微量色素类型 B 对B I为显性 B I仅与B 共处于同一基因型中一个世代 便彻底地 败落了 发生了永久的活性蜕变 基因一定受到了某种修饰 以至于这种修饰效应能够代代相传 副突变等位基因 骡和駃騠前者又称马骡 是公驴与母马杂交的后代 体大 耳小而尾部蓬松 后者又叫驴骡 是公马与母驴杂交的后代 相对来说体小 耳大而尾毛较少 这个现象表明 来源于不同性别亲本的遗传物质在后代表达的功能可以有差别 这就是基因印记 基因印记 Hinny駃騠 Mule 类胰岛素生长因子 2基因Igf2 位于7号染色体 在小鼠身体里是否表达 要看它是否是受之于父亲 因为来自母亲的基因拷贝是处于失活性状态的 这就是说 该基因是被母亲所印记的 相反 17号染色体上的Igf2r是被父亲所印记的 被特别关注 因为来自父亲的Igf2r是处于失活性状态的 它只有受之于母亲才在体内表达 类胰岛素生长因子 亲代印记的结果是 被印记的基因所表现的形式好像半合子的情况 尽管在每一个细胞中这种体细胞基因均成对存在 分子水平的分析发现 DNA序列并没有发生改变 那么 功能与性状的变化因何而起 X染色体失活 X连锁的O基因控制黄色毛性状 其等位基因o控制黑色毛性状 另有常染色体基因S控制白色性状 在杂合子猫XOXo 一些细胞团产生黄毛 一些细胞团产生黑毛 在白色背景下构成3色皮毛 现象与猜想 基因一定受到了某种修饰 这种修饰效应能够通过有丝分裂和减数分裂实现代间传递 甲基化的发现 1979年McGhee等发现与鸡 珠蛋白基因比邻的胞嘧啶核苷酸甲基化后 该基因转录受抑制的现象 胞嘧啶的嘧啶环上第5位碳原子加上一个甲基 DNA甲基化的可遗传特性是通过agoutiviableyellow Avy 小鼠模型研究发现的 Avy小鼠毛色控制基因agouti的第一外显子前插入了一段逆转座子 IAP 序列 agouti基因的表达间接地受到IAP的启动子调控 因而IAP启动子的甲基化状态可以通过小鼠的毛色鉴定出来 通过给孕期的母鼠补充富含甲基的食物可以改变后代中三种毛色小鼠的比例 IAP启动子被甲基化的小鼠 即棕色小鼠的比例增加了 IPA LTR LTR Phenotypediversitycontributedbydynamicsofepigenotype WT Agouti 别小看一个小小的修饰 却给DNA增加了额外的信息 使得有限的基因组遗传信息的表现呈现出丰富的多样性和可塑性 简单地把DNA甲基化理解为 一把锁 凡是被DNA甲基化标记的部分 大都是需要被 尘封 监禁 的基因 比如基因组的 捣蛋鬼 转座子 就是被甲基化这把 锁 管制着 失去管制或管制不严 这些 捣蛋鬼 会在基因组里跳来跳去 把基因组搞得一团糟 会引起很多问题 如肿瘤 精神疾病等 酵母与果蝇基因组中未能检测到任何甲基化CpG 这两种生物并不依赖DNA甲基化的方式来控制基因活性 它们采用其它的机制来达到同一目的 脊椎动物与高等植物普遍利用DNA甲基化作为重要的调控机制 指在DNA甲基转移酶 DNMTs 的作用下 以S 腺苷甲硫氨酸 SAM 为甲基供体 将甲基添加在DNA分子中的碱基上 常见的DNA甲基化发生在DNA链上的胞嘧啶第5位碳原子和甲基间的共价结合 胞嘧啶由此被修饰为5甲基胞嘧啶 5mC DNA甲基化的分子机理 哺乳动物基因组中约有5 10 是CpG位点 其中约有70 为mCpG CpG位点不是均匀分布 而是呈现局部聚集倾向 形成一些GC含量较高 CpG双核苷酸相对聚集的区域 即CpG岛 CpG岛CpG岛主要位于基因的启动子区 少量位于基因的第一个外显子区 其甲基化状态直接影响基因表达 甲基化的CpG双核苷酸通过募集转录抑制因子或者阻碍转录激活因子的结合抑制基因的表达 CpG岛一般是非甲基化的 而在失活X染色体 印记基因和非表达的组织特异基因中则是甲基化的 成体基因组通常中 奢侈基因呈现高密度甲基化 而含有丰富CpG岛的管家基因则呈非甲基化 基因组甲基化的特点 可逆性 许多甲基化位点可以根据细胞活性的要求重新甲基化或去甲基化 组织特异性 不同的组织细胞具有不同的甲基化模式 为基因表达设定程序 异常的甲基化可分为高甲基化和低甲基化 前者指正常组织中不发生甲基化的位点被甲基化 后者是指在正常组织中发生甲基化的位点去甲基化 Dnmts 3a 3b 1 DenovoDNAmethylation Maintenancemethylation Howmethlgroupadded 甲基化酶 一般按甲基化的方式将甲基化酶 DNAmethytransferase DNMT 分为2类 一种是维持型甲基转移酶 需以半甲基化的双链DNA为模板 指导新合成的链甲基化 一种是全新甲基化酶 不依赖半甲基化DNA分子中的甲基化模板而从新开始合成5mC 哺乳动物细胞中已知有活性的DNMT有3种 它们是DNMT1 DNMT3a DNMT3b DNMT1的主要功能是作为DNA复制复合物 DNAsynthesome 中的组分 催化子链DNA半甲基化位点甲基化 维持复制过程中甲基化位点的遗传稳定性 DNMT3a和DNMT3b主要催化从头甲基化 以非甲基化的DNA为模板 催化新的甲基化位点形成 在胚胎发育中起重要作用 甲基化酶 CpG岛的形成 虽然人类基因组上有的CpG岛处于甲基化状态 但是大部分CpG岛是不易被甲基化的 这同基因组上约80 的CpG双核苷酸处于甲基化状态的现象形成鲜明对比 该现象促使人们思考为什么CpG岛不易被甲基化 去甲基化酶 哺乳动物体内可能存在去甲基化的酶 这种酶可能为一种糖基化酶 核酸内切酶或真正的去甲基化酶 近2年来 对去甲基化酶的研究有所突破 一般认为 DNA甲基化有两种方式 一种是主动去甲基化 另一种是复制相关的DNA去甲基化 DNA甲基化抑制转录的机制 DNA轴的主沟是许多蛋白因子与DNA结合的部位 当胞嘧啶被甲基化后 5mC则突出至主沟中 从而干扰了转录因子与DNA结合 体外研究发现 某些特异转录因子与甲基化靶序列的亲和力明显降低 序列特异性甲基化结合蛋白 MBD MeCP 与启动子区甲基化CpG岛结合 阻止转录因子与启动子靶序列的结合 从而影响基因的转录 1998年 英国爱丁堡大学的Nan和美国马里兰州的Johes等各自独立发现 选择性地结合于甲基化DNA上的特异的转录抑制因子MeCP2与组蛋白脱乙酰化酶 histonedeacetylase HDAC 在细胞中可存在于同一个复合物中 组蛋白H3 H4的N端尾部的赖氨酸发生去乙酰化 从而导致组蛋白上正电荷增加 与带负电荷的DNA相互作用 使染色体结构压缩 进一步限制转录因子的结合 引起转录抑制 组蛋白密码 DNA甲基化与小RNA的关系 近年研究表明 siRNA和miRNA能在哺乳动物细胞中介导DNA甲基化 RdDM 组蛋白修饰及异染色质的形成 从而导致转录基因沉默 TGS 目前研究表明 Argonautes蛋白家族 AGO1及AGO2 DNMT3a 组蛋白去乙酰化酶 Histonedeacetylase 1 HDAC 1 和Polycomb蛋白家族 Polycombgroup PcG 的EZH2 Enhancerofzestehomolog2 参与了siRNA诱导的转录水平基因沉默 TGS 组蛋白甲基化酶 甲基化CpG结合蛋白 染色质域蛋白及组蛋白去乙酰化酶等基因均是miRNA潜在的作用靶标 piRNA是真核生物中主要控制转座子活性的一类24 31nt的RNA分子 这类小分子RNA与Argonaute蛋白家族中的Piwi亚家族蛋白相互结合 故命名为Piwi interactingRNAs Piwi为一表观遗传学调控因子 能与PcG蛋白共同结合于基因组PcG应答元件上 协助PcG沉默同源异型基因 甲基化与发育 DNA甲基化与配子形成 胚胎发育的关系 哺乳动物生殖细胞在形成受精卵后的最初几次卵裂中 发生DNA的去甲基化 即在去甲基化酶的作用下 去除DNA分子上几乎所有从亲代遗传来的甲基化标记 此过程包括非特异性去甲基化和特异性去甲基化 胚胎早期的植入期前 整个基因组发生了普遍的非特异性去甲基化 非甲基化状态保持到细胞的桑葚期前 此后的胚胎植入期间 组织特异性基因经历选择性的特异性甲基化 因此 成体基因组通常呈现2种DNA甲基化形式 奢侈基因呈现高密度甲基化 而含有丰富CpG岛的管家基因则呈非甲基化 当细胞内新的甲基化模式形成后 即可通过甲基化酶以 甲基化维持 的形式将新的DNA甲基化传递给所有子细胞 印记基因 哺乳动物配子形成晚期 绝大多数顺序按程序去甲基化 这一阶段遗传印记基因以性别专一性方式确定甲基化模式 从受精卵到胚泡阶段 基因组范围的甲基化均被抹去 但某些印记基因保持甲基化 当胚胎发育进入原肠胚期 细胞开始分化 重新设定基因组范围的甲基化模式 以决定细胞的命运 精子和卵子的原核在受精后仍有一段时间的分离状态 可以在显微操作下进行原核去除或移植 全套染色体均来自雄亲的小鼠或均来自雌亲的小鼠均在发育过程中夭折 Memoryatthecellularlevel 甲基化与发育 性成熟个体 配子母细胞 成熟配子 早期胚胎 成体模式的胚胎 体细胞 生殖细胞 原始生殖细胞 甲基化清洗 印记 保持印记 部分保持印记 保持印记 保持印记 甲基化清洗重塑 X染色体失活 基因的时空特异性表达 甲基化异常导致的疾病 衰老 DNA甲基化同众多疾病的发生与发展密切相关 比如 型糖尿病 自身免疫疾病以及各种癌症 特别是癌症 其发生过程中癌细胞基因组整体的欠甲基化和局部区域的超甲基化是其典型特征 超甲基化体现在抑癌基因的启动子区被异常甲基化 整体的欠甲基化同重复序列 如转座子 以及癌基因的启动子区的甲基化程度减小 基因组遗传不稳定性的增加密切相关 甲基化异常与疾病 Alu序列是重新甲基化过程中的甲基化中心 在甲基化转移酶的作用下 DNA甲基化从Alu序列出发往外延伸 当CpG岛周围富集的转录因子结合位点同具有锌指结构的转录因子结合以后则可以阻止甲基化向CpG岛的蔓延 因此在这种阻止与蔓延的作用达到动态平衡以后 就形成了比较稳定的甲基化模式 当细胞所在的环境发生变化时 这种平衡可能会被打破 阻止功能的增强或者侵入能力的提高则可能使DNA甲基化往CpG岛外或者往内移动 从而建立新的平衡 比如 如果某些顺式元件发生突变 则本可以结合并阻碍DNA甲基化蔓延的特定转录因子可能因为结合能力的减弱使其阻碍功能变弱甚至消失 这种情况下 其附近的CpG岛可能会被甲基化 因此 发生癌变的组织中抑癌基因的异常甲基化以及与老化过程相关的甲基化可能是由于这种保护机制的减弱造成的 Bibikova等对结肠癌 乳腺癌 肺癌和前列腺癌细胞系以及正常细胞中371个基因中的1536个位点的甲基化状态进行聚类分析 发现各种癌症都存在其特异的DNA甲基化生物标记 甲基化的分析检测 DNA甲基化的检测大体分为两个步骤 a 待检测样品的前期处理 b 目标序列的定位和甲基化状态的量化 待检测样品的前期处理方法主要包括三大类 a 亚硫酸氢钠法 亚硫酸氢钠把非甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶 而保持甲基化的胞嘧啶不变 以此实现两类的分离 b 限制性内切酶法 限制性内切酶可以切割非甲基化的位点 而甲基化以后的识别位点将被保留 c 利用特定抗体对甲基化的胞嘧啶进行免疫沉淀反应 前期处理实现了甲基化和非甲基化的胞嘧啶分离以后 可以对分离出的甲基化DNA片段进行基因芯片杂交或者大规模深度测序 实现高通量的检测 酶切法 对甲基化敏感程度不同的一对同裂酶HpaII和MspI 这对酶可识别CCGG位点 但对甲基化的敏感程度不同 HpaII对内 外侧胞嘧啶甲基化敏感 MspI只对外侧胞嘧啶甲基化敏感 而绝大多数基因组甲基化发生在胞嘧啶内侧 因此可以用MspI来识别CCGG 用HpaII来鉴别这些序列是否甲基化 亚硫酸氢钠 PCR法 在PCR反应时 设计两套不同的引物对 一对引物序列针对经亚硫酸氢钠处理后的甲基化DNA链设计 若用该对引物能扩增出片段 说明该检测位点发生了甲基化 另一引物针对经亚硫酸氢钠处理后的非甲基化DNA链设计 若用该对引物能扩增出片段 说明该检测位点没有甲基化 对引物的选择和设计要求非常高 目前英国科学家提出 单分子纳米孔测序仪能直接分辨出甲基化胞嘧啶和未修饰的胞嘧啶 当核酸外切酶消化单链DNA后 单个碱基落入孔中 它们瞬间与环式糊精相互作用 并阻碍了穿过孔中的电流 每个碱基ATGC以及甲基胞嘧啶都有自己特有的电流振幅 因此很容易转化成DNA序列 纳米孔技术就能直接读出这5 甲基胞嘧啶 DNA甲基化的生物信息学研究进展 由于DNA甲基化在基因调控中的重要功能 以Sanger研究所为代表的人类表观基因组联盟 于2000年10月发起了人类表观基因组计划 humanepigenomeproject HEP 试图获得人类多个组织中的DNA甲基化模式 目前发表的较大规模的DNA甲基化相关数据库有4个 MethDB MethyCancer PubMeth和MethCancerDB DNA甲基化的预测 分析 对单个CpG双核苷酸的甲基化状态预测 对CpG岛片段以及CpG岛的甲基化状态预测 对CpG岛的甲基化状态与组蛋白修饰之间的关系的分析 体细胞分裂形成的 女儿 细胞 还可以继续分裂 不仅继承了 母亲 细胞的基因组DNA序列 还十分忠实地拷贝了 母亲 细胞基因组DNA的甲基化模式 但是 在生殖细胞形成过程中 还有受精卵向胚胎分化的过程中 基因组DNA的甲基化要经过一个大规模的 重塑 而且时间窗口很短 最新研究 DNA主动去甲基化的机理 DNA甲基化在这么短的时间内事如何被 清洗 掉的 回答这个问题的关键就是找到能够将DNA的甲基化基团去掉的DNA去甲基化酶 DNAdemethylase 2005年 北大尚永丰实验室报道了在卵巢癌细胞有基因特异性 主动DNA去甲基化 的现象 2006年 美国朱健康实验室在植物发现并鉴定了DNA去甲基化酶 2007年 海德堡的发育生物学家Niehrs在Nature上发文报道一个DNA损伤诱导蛋白Gadd45a促进DNA去甲基化 美国加州贝克曼研究所的Pfeifer实验室在PLoSGenet 上发文否定Niehrs的结果 题目针锋相对 GADD45AdoesnotpromoteDNAdemethylation DNA去甲基化的机理 后来相继有几篇来自不同实验室的报道肯定了Niehrs的结果 仅管如此 还是有些问题 Gadd4a基因敲除病不妨碍胚胎发育 也不会影响受精卵分裂前的去甲基化过程 2 Gadd4a其实并不是真正的去甲基化酶 它只是启动核酸切除修复 主要用来修复紫外线对DNA的损伤 把一段甲基化的DNA切了 重新合成新链 但在全基因组水平上用切除DNA的方法进行甲基化重塑貌似不合理 2010年 剑桥的M AzimSurani和WolfReik先后在Nature和Science上报道 AID 胞嘧啶核苷脱氨酶 基因敲除的精子的去甲基化受到显著影响 甲基胞嘧啶通过脱氨作用形成的尿嘧啶 尿嘧啶只能在RNA出现 如果在DNA出现 细胞会触发碱基切除反应 他们都证实AID参与的去甲基化是通过对甲基化胞嘧啶的脱氨作用启动碱基切除修复完成的 DNA去甲基化的机理 2009年 斯坦福大学医学院的院士HelenM Blau证明诱导哺乳动物iPS需要AID蛋白参与启动细胞的DNA去甲基化 并启动细胞核重新编程过程 为了研究iPS诱导过程中的相关机制 他们构建了一个异核体细胞 融合了小鼠胚胎干细胞和人类成纤维细胞 这种异核体诱导的速度比正常的体细胞诱导速度快很多 仅需1天时间 诱导效率高达70 用RNAi进行扫描发现 异核体诱导启动依赖一种蛋白 这种蛋白就是AID AID不仅促进细胞重排过程中的去甲基化 更是可以诱导OCT4和NANOG基因的表达 2种iPS诱导过程中的转录因子 AID蛋白对成纤维细胞上的OCT4与NANOG发挥作用 对胚胎干细胞不发挥作用 利用RNAi筛选系统寻找DNA去甲基化酶 2009年 张毅实验室设计了一个能检测活细胞基因组DNA甲基化状态方法 并用受精卵细胞进行筛选 拿到了一个效果肯定的候选基因 转录延长因子ELP3 把MBPD与绿色荧光蛋白连起来 融合 相当于给MBPD加上了一个荧光标签 可以在显微镜下直接观察和追踪MBD的位置 一般情况下 MBPD GFP是与基因组上甲基化的DNA结合 在在荧光显微镜下呈现绿色的斑点 在基因组甲基化被清除时 MBPD GFP就无处可以结合 因此就分散在细胞核内 在显微镜下 原来那些绿色荧光斑点消失 而变成了弥散的绿色 这样通过观察荧光信号的变化来判断基因组甲基化的变化 通过RNA干扰技术 把选定的基因