内科学专业毕业论文 [精品论文] 肝衰竭时肝细胞高迁移率族蛋白1的移位及释放研究.doc

内科学专业毕业论文 精品论文 肝衰竭时肝细胞高迁移率族蛋白1的移位及释放研究关键词：肝衰竭 重型肝炎 高迁移率族蛋白-1 肝细胞hmgb1 细胞因子 tnf- 免疫荧光摘要：肝衰竭是一种病死率很高的临床危重症，在我国肝衰竭最主要的原因是病毒性肝炎，其中最主要的是乙肝病毒( hepatitis bvirus，hbv)感染。而高迁移率族蛋白l(high mobility group box-1protein，hmgb1)在细胞外是一种关键的“晚期”促炎症介质，已经成为脓毒症防治研究中一个重要的新靶标。有研究表明hmgb1可能在重型肝炎肝衰竭中发挥重要作用。本研究旨在探讨肝衰竭时肝细胞hmgb1的移位及释放情况。 目的：(1)研究lps或tnf-，刺激是否可引起肝细胞hmgb1的移位及释放，检测是否同时伴有其他细胞因子的分泌；(2)研究慢性重型乙型肝炎患者肝细胞hmgb1移位；(3)研究d-gain+lps诱导的急性肝衰竭小鼠肝细胞hmgb1移位；(4)初步探讨肝细胞hmgb1移位及释放的可能机制。 方法：(1)体外用不同浓度lps或tnf-刺激肝细胞系hepg2细胞，不同时间点分别收集细胞和培养上清。mtt法测定细胞存活率，tunel法检测细胞凋亡率，同时测定培养上清中的ldh含量，以明确细胞是否凋亡或坏死。western blotting方法检测培养上清，细胞核和细胞浆组分蛋白中hmgb1的含量，免疫荧光技术观察hmgb1移位。elisa，细胞因子芯片技术检测上清中的细胞因子分泌。(2)分别收集慢性重型乙型肝炎，慢性乙型肝炎患者及正常肝组织，免疫组织化学染色观察hmgb1在肝细胞中的分布情况。同时行he染色，评估肝组织的病理学改变。(3) d-gain联合lps腹腔注射，诱导小鼠急性肝衰竭模型，同时设置生理盐水对照组。于d-galn+lps注射后3h处死动物，收集肝脏组织，进行hmgb1的免疫组织化学染色。(4)用western blotting和免疫荧光技术，分别观察来普霉素b(lmb)和曲古霉素(tsa)对lps诱导的肝细胞hmgb1移位和释放的影响。 结果：(1)体外用lps或tnf-刺激可诱导hepg2细胞释放hmgb1，释放到上清中的hmgb1量随着作用时间延长而增高，20h时达到峰值，免疫荧光观察到hepg2细胞胞核中的hmgb1发生了向细胞浆的移位。在一定剂量范围内，lps(400ng/ml)或tnf-(25ng/ml)诱导的hmgb1分泌量随lps或tnf-剂量增加而增加。mtt，tunel检测及上清中ldh含量测定排除了细胞处于凋亡及坏死状态。细胞组分蛋白westem blotting分析亦证实了细胞浆中的hmgb1表达增强。elisa和细胞因子抗体芯片检测表明lps，tnf-或重组hmgb1刺激hepg2细胞24h，仅见个别其他细胞因子的释放。(2)慢性重型乙型肝炎患者肝细胞中可观察到明显的hmgb1的移位，移位率约为32.847.13。而在慢性乙型肝炎组及正常肝组织中，肝细胞hmgb1集中分布于细胞核中，未见明显的移位。(3) d-galn+lps注射后3h，发生移位的肝细胞百分率为：27.424.99。移位率与生理盐水对照组比较，显著为高(p<0.01)。(4)体外crm1抑制剂lmb可以显著减少lps诱导的hepg2细胞hmgb1的释放，及hmgb1从细胞核向细胞浆的移位。组蛋白去乙酰化酶抑制剂tsa可以促进lps诱导的hmgb1释放，促进hmgb1从细胞核向细胞浆的移位。 结论：(1) lps或tnf-a可时间及剂量依赖性诱导体外培养的hepg2细胞核蛋白hmgb1的移位及释放。(2)慢性重型乙型肝炎患者肝细胞中存在hmgb1从细胞核向胞浆的移位，而在慢性乙型肝炎及正常对照肝细胞中并无这种移位现象。(3)d-gal+lps诱导的急性肝衰竭模型小鼠肝细胞hmgbi存在从细胞核向胞浆的移位。(4)lps诱导的hepg2细胞hmgb1的移位和释放可能存在crm1依赖的核转运，可能与乙酰化相关。正文内容 肝衰竭是一种病死率很高的临床危重症，在我国肝衰竭最主要的原因是病毒性肝炎，其中最主要的是乙肝病毒( hepatitis bvirus，hbv)感染。而高迁移率族蛋白l(high mobility group box-1protein，hmgb1)在细胞外是一种关键的“晚期”促炎症介质，已经成为脓毒症防治研究中一个重要的新靶标。有研究表明hmgb1可能在重型肝炎肝衰竭中发挥重要作用。本研究旨在探讨肝衰竭时肝细胞hmgb1的移位及释放情况。 目的：(1)研究lps或tnf-，刺激是否可引起肝细胞hmgb1的移位及释放，检测是否同时伴有其他细胞因子的分泌；(2)研究慢性重型乙型肝炎患者肝细胞hmgb1移位；(3)研究d-gain+lps诱导的急性肝衰竭小鼠肝细胞hmgb1移位；(4)初步探讨肝细胞hmgb1移位及释放的可能机制。 方法：(1)体外用不同浓度lps或tnf-刺激肝细胞系hepg2细胞，不同时间点分别收集细胞和培养上清。mtt法测定细胞存活率，tunel法检测细胞凋亡率，同时测定培养上清中的ldh含量，以明确细胞是否凋亡或坏死。western blotting方法检测培养上清，细胞核和细胞浆组分蛋白中hmgb1的含量，免疫荧光技术观察hmgb1移位。elisa，细胞因子芯片技术检测上清中的细胞因子分泌。(2)分别收集慢性重型乙型肝炎，慢性乙型肝炎患者及正常肝组织，免疫组织化学染色观察hmgb1在肝细胞中的分布情况。同时行he染色，评估肝组织的病理学改变。(3) d-gain联合lps腹腔注射，诱导小鼠急性肝衰竭模型，同时设置生理盐水对照组。于d-galn+lps注射后3h处死动物，收集肝脏组织，进行hmgb1的免疫组织化学染色。(4)用western blotting和免疫荧光技术，分别观察来普霉素b(lmb)和曲古霉素(tsa)对lps诱导的肝细胞hmgb1移位和释放的影响。 结果：(1)体外用lps或tnf-刺激可诱导hepg2细胞释放hmgb1，释放到上清中的hmgb1量随着作用时间延长而增高，20h时达到峰值，免疫荧光观察到hepg2细胞胞核中的hmgb1发生了向细胞浆的移位。在一定剂量范围内，lps(400ng/ml)或tnf-(25ng/ml)诱导的hmgb1分泌量随lps或tnf-剂量增加而增加。mtt，tunel检测及上清中ldh含量测定排除了细胞处于凋亡及坏死状态。细胞组分蛋白westem blotting分析亦证实了细胞浆中的hmgb1表达增强。elisa和细胞因子抗体芯片检测表明lps，tnf-或重组hmgb1刺激hepg2细胞24h，仅见个别其他细胞因子的释放。(2)慢性重型乙型肝炎患者肝细胞中可观察到明显的hmgb1的移位，移位率约为32.847.13。而在慢性乙型肝炎组及正常肝组织中，肝细胞hmgb1集中分布于细胞核中，未见明显的移位。(3) d-galn+lps注射后3h，发生移位的肝细胞百分率为：27.424.99。移位率与生理盐水对照组比较，显著为高(p<0.01)。(4)体外crm1抑制剂lmb可以显著减少lps诱导的hepg2细胞hmgb1的释放，及hmgb1从细胞核向细胞浆的移位。组蛋白去乙酰化酶抑制剂tsa可以促进lps诱导的hmgb1释放，促进hmgb1从细胞核向细胞浆的移位。 结论：(1) lps或tnf-a可时间及剂量依赖性诱导体外培养的hepg2细胞核蛋白hmgb1的移位及释放。(2)慢性重型乙型肝炎患者肝细胞中存在hmgb1从细胞核向胞浆的移位，而在慢性乙型肝炎及正常对照肝细胞中并无这种移位现象。(3)d-gal+lps诱导的急性肝衰竭模型小鼠肝细胞hmgbi存在从细胞核向胞浆的移位。(4)lps诱导的hepg2细胞hmgb1的移位和释放可能存在crm1依赖的核转运，可能与乙酰化相关。肝衰竭是一种病死率很高的临床危重症，在我国肝衰竭最主要的原因是病毒性肝炎，其中最主要的是乙肝病毒( hepatitis bvirus，hbv)感染。而高迁移率族蛋白l(high mobility group box-1protein，hmgb1)在细胞外是一种关键的“晚期”促炎症介质，已经成为脓毒症防治研究中一个重要的新靶标。有研究表明hmgb1可能在重型肝炎肝衰竭中发挥重要作用。本研究旨在探讨肝衰竭时肝细胞hmgb1的移位及释放情况。 目的：(1)研究lps或tnf-，刺激是否可引起肝细胞hmgb1的移位及释放，检测是否同时伴有其他细胞因子的分泌；(2)研究慢性重型乙型肝炎患者肝细胞hmgb1移位；(3)研究d-gain+lps诱导的急性肝衰竭小鼠肝细胞hmgb1移位；(4)初步探讨肝细胞hmgb1移位及释放的可能机制。 方法：(1)体外用不同浓度lps或tnf-刺激肝细胞系hepg2细胞，不同时间点分别收集细胞和培养上清。mtt法测定细胞存活率，tunel法检测细胞凋亡率，同时测定培养上清中的ldh含量，以明确细胞是否凋亡或坏死。western blotting方法检测培养上清，细胞核和细胞浆组分蛋白中hmgb1的含量，免疫荧光技术观察hmgb1移位。elisa，细胞因子芯片技术检测上清中的细胞因子分泌。(2)分别收集慢性重型乙型肝炎，慢性乙型肝炎患者及正常肝组织，免疫组织化学染色观察hmgb1在肝细胞中的分布情况。同时行he染色，评估肝组织的病理学改变。(3) d-gain联合lps腹腔注射，诱导小鼠急性肝衰竭模型，同时设置生理盐水对照组。于d-galn+lps注射后3h处死动物，收集肝脏组织，进行hmgb1的免疫组织化学染色。(4)用western blotting和免疫荧光技术，分别观察来普霉素b(lmb)和曲古霉素(tsa)对lps诱导的肝细胞hmgb1移位和释放的影响。 结果：(1)体外用lps或tnf-刺激可诱导hepg2细胞释放hmgb1，释放到上清中的hmgb1量随着作用时间延长而增高，20h时达到峰值，免疫荧光观察到hepg2细胞胞核中的hmgb1发生了向细胞浆的移位。在一定剂量范围内，lps(400ng/ml)或tnf-(25ng/ml)诱导的hmgb1分泌量随lps或tnf-剂量增加而增加。mtt，tunel检测及上清中ldh含量测定排除了细胞处于凋亡及坏死状态。细胞组分蛋白westem blotting分析亦证实了细胞浆中的hmgb1表达增强。elisa和细胞因子抗体芯片检测表明lps，tnf-或重组hmgb1刺激hepg2细胞24h，仅见个别其他细胞因子的释放。(2)慢性重型乙型肝炎患者肝细胞中可观察到明显的hmgb1的移位，移位率约为32.847.13。而在慢性乙型肝炎组及正常肝组织中，肝细胞hmgb1集中分布于细胞核中，未见明显的移位。(3) d-galn+lps注射后3h，发生移位的肝细胞百分率为：27.424.99。移位率与生理盐水对照组比较，显著为高(p<0.01)。(4)体外crm1抑制剂lmb可以显著减少lps诱导的hepg2细胞hmgb1的释放，及hmgb1从细胞核向细胞浆的移位。组蛋白去乙酰化酶抑制剂tsa可以促进lps诱导的hmgb1释放，促进hmgb1从细胞核向细胞浆的移位。 结论：(1) lps或tnf-a可时间及剂量依赖性诱导体外培养的hepg2细胞核蛋白hmgb1的移位及释放。(2)慢性重型乙型肝炎患者肝细胞中存在hmgb1从细胞核向胞浆的移位，而在慢性乙型肝炎及正常对照肝细胞中并无这种移位现象。(3)d-gal+lps诱导的急性肝衰竭模型小鼠肝细胞hmgbi存在从细胞核向胞浆的移位。(4)lps诱导的hepg2细胞hmgb1的移位和释放可能存在crm1依赖的核转运，可能与乙酰化相关。肝衰竭是一种病死率很高的临床危重症，在我国肝衰竭最主要的原因是病毒性肝炎，其中最主要的是乙肝病毒( hepatitis bvirus，hbv)感染。而高迁移率族蛋白l(high mobility group box-1protein，hmgb1)在细胞外是一种关键的“晚期”促炎症介质，已经成为脓毒症防治研究中一个重要的新靶标。有研究表明hmgb1可能在重型肝炎肝衰竭中发挥重要作用。本研究旨在探讨肝衰竭时肝细胞hmgb1的移位及释放情况。 目的：(1)研究lps或tnf-，刺激是否可引起肝细胞hmgb1的移位及释放，检测是否同时伴有其他细胞因子的分泌；(2)研究慢性重型乙型肝炎患者肝细胞hmgb1移位；(3)研究d-gain+lps诱导的急性肝衰竭小鼠肝细胞hmgb1移位；(4)初步探讨肝细胞hmgb1移位及释放的可能机制。 方法：(1)体外用不同浓度lps或tnf-刺激肝细胞系hepg2细胞，不同时间点分别收集细胞和培养上清。mtt法测定细胞存活率，tunel法检测细胞凋亡率，同时测定培养上清中的ldh含量，以明确细胞是否凋亡或坏死。western blotting方法检测培养上清，细胞核和细胞浆组分蛋白中hmgb1的含量，免疫荧光技术观察hmgb1移位。elisa，细胞因子芯片技术检测上清中的细胞因子分泌。(2)分别收集慢性重型乙型肝炎，慢性乙型肝炎患者及正常肝组织，免疫组织化学染色观察hmgb1在肝细胞中的分布情况。同时行he染色，评估肝组织的病理学改变。(3) d-gain联合lps腹腔注射，诱导小鼠急性肝衰竭模型，同时设置生理盐水对照组。于d-galn+lps注射后3h处死动物，收集肝脏组织，进行hmgb1的免疫组织化学染色。(4)用western blotting和免疫荧光技术，分别观察来普霉素b(lmb)和曲古霉素(tsa)对lps诱导的肝细胞hmgb1移位和释放的影响。 结果：(1)体外用lps或tnf-刺激可诱导hepg2细胞释放hmgb1，释放到上清中的hmgb1量随着作用时间延长而增高，20h时达到峰值，免疫荧光观察到hepg2细胞胞核中的hmgb1发生了向细胞浆的移位。在一定剂量范围内，lps(400ng/ml)或tnf-(25ng/ml)诱导的hmgb1分泌量随lps或tnf-剂量增加而增加。mtt，tunel检测及上清中ldh含量测定排除了细胞处于凋亡及坏死状态。细胞组分蛋白westem blotting分析亦证实了细胞浆中的hmgb1表达增强。elisa和细胞因子抗体芯片检测表明lps，tnf-或重组hmgb1刺激hepg2细胞24h，仅见个别其他细胞因子的释放。(2)慢性重型乙型肝炎患者肝细胞中可观察到明显的hmgb1的移位，移位率约为32.847.13。而在慢性乙型肝炎组及正常肝组织中，肝细胞hmgb1集中分布于细胞核中，未见明显的移位。(3) d-galn+lps注射后3h，发生移位的肝细胞百分率为：27.424.99。移位率与生理盐水对照组比较，显著为高(p<0.01)。(4)体外crm1抑制剂lmb可以显著减少lps诱导的hepg2细胞hmgb1的释放，及hmgb1从细胞核向细胞浆的移位。组蛋白去乙酰化酶抑制剂tsa可以促进lps诱导的hmgb1释放，促进hmgb1从细胞核向细胞浆的移位。 结论：(1) lps或tnf-a可时间及剂量依赖性诱导体外培养的hepg2细胞核蛋白hmgb1的移位及释放。(2)慢性重型乙型肝炎患者肝细胞中存在hmgb1从细胞核向胞浆的移位，而在慢性乙型肝炎及正常对照肝细胞中并无这种移位现象。(3)d-gal+lps诱导的急性肝衰竭模型小鼠肝细胞hmgbi存在从细胞核向胞浆的移位。(4)lps诱导的hepg2细胞hmgb1的移位和释放可能存在crm1依赖的核转运，可能与乙酰化相关。肝衰竭是一种病死率很高的临床危重症，在我国肝衰竭最主要的原因是病毒性肝炎，其中最主要的是乙肝病毒( hepatitis bvirus，hbv)感染。而高迁移率族蛋白l(high mobility group box-1protein，hmgb1)在细胞外是一种关键的“晚期”促炎症介质，已经成为脓毒症防治研究中一个重要的新靶标。有研究表明hmgb1可能在重型肝炎肝衰竭中发挥重要作用。本研究旨在探讨肝衰竭时肝细胞hmgb1的移位及释放情况。 目的：(1)研究lps或tnf-，刺激是否可引起肝细胞hmgb1的移位及释放，检测是否同时伴有其他细胞因子的分泌；(2)研究慢性重型乙型肝炎患者肝细胞hmgb1移位；(3)研究d-gain+lps诱导的急性肝衰竭小鼠肝细胞hmgb1移位；(4)初步探讨肝细胞hmgb1移位及释放的可能机制。 方法：(1)体外用不同浓度lps或tnf-刺激肝细胞系hepg2细胞，不同时间点分别收集细胞和培养上清。mtt法测定细胞存活率，tunel法检测细胞凋亡率，同时测定培养上清中的ldh含量，以明确细胞是否凋亡或坏死。western blotting方法检测培养上清，细胞核和细胞浆组分蛋白中hmgb1的含量，免疫荧光技术观察hmgb1移位。elisa，细胞因子芯片技术检测上清中的细胞因子分泌。(2)分别收集慢性重型乙型肝炎，慢性乙型肝炎患者及正常肝组织，免疫组织化学染色观察hmgb1在肝细胞中的分布情况。同时行he染色，评估肝组织的病理学改变。(3) d-gain联合lps腹腔注射，诱导小鼠急性肝衰竭模型，同时设置生理盐水对照组。于d-galn+lps注射后3h处死动物，收集肝脏组织，进行hmgb1的免疫组织化学染色。(4)用western blotting和免疫荧光技术，分别观察来普霉素b(lmb)和曲古霉素(tsa)对lps诱导的肝细胞hmgb1移位和释放的影响。 结果：(1)体外用lps或tnf-刺激可诱导hepg2细胞释放hmgb1，释放到上清中的hmgb1量随着作用时间延长而增高，20h时达到峰值，免疫荧光观察到hepg2细胞胞核中的hmgb1发生了向细胞浆的移位。在一定剂量范围内，lps(400ng/ml)或tnf-(25ng/ml)诱导的hmgb1分泌量随lps或tnf-剂量增加而增加。mtt，tunel检测及上清中ldh含量测定排除了细胞处于凋亡及坏死状态。细胞组分蛋白westem blotting分析亦证实了细胞浆中的hmgb1表达增强。elisa和细胞因子抗体芯片检测表明lps，tnf-或重组hmgb1刺激hepg2细胞24h，仅见个别其他细胞因子的释放。(2)慢性重型乙型肝炎患者肝细胞中可观察到明显的hmgb1的移位，移位率约为32.847.13。而在慢性乙型肝炎组及正常肝组织中，肝细胞hmgb1集中分布于细胞核中，未见明显的移位。(3) d-galn+lps注射后3h，发生移位的肝细胞百分率为：27.424.99。移位率与生理盐水对照组比较，显著为高(p<0.01)。(4)体外crm1抑制剂lmb可以显著减少lps诱导的hepg2细胞hmgb1的释放，及hmgb1从细胞核向细胞浆的移位。组蛋白去乙酰化酶抑制剂tsa可以促进lps诱导的hmgb1释放，促进hmgb1从细胞核向细胞浆的移位。 结论：(1) lps或tnf-a可时间及剂量依赖性诱导体外培养的hepg2细胞核蛋白hmgb1的移位及释放。(2)慢性重型乙型肝炎患者肝细胞中存在hmgb1从细胞核向胞浆的移位，而在慢性乙型肝炎及正常对照肝细胞中并无这种移位现象。(3)d-gal+lps诱导的急性肝衰竭模型小鼠肝细胞hmgbi存在从细胞核向胞浆的移位。(4)lps诱导的hepg2细胞hmgb1的移位和释放可能存在crm1依赖的核转运，可能与乙酰化相关。肝衰竭是一种病死率很高的临床危重症，在我国肝衰竭最主要的原因是病毒性肝炎，其中最主要的是乙肝病毒( hepatitis bvirus，hbv)感染。而高迁移率族蛋白l(high mobility group box-1protein，hmgb1)在细胞外是一种关键的“晚期”促炎症介质，已经成为脓毒症防治研究中一个重要的新靶标。有研究表明hmgb1可能在重型肝炎肝衰竭中发挥重要作用。本研究旨在探讨肝衰竭时肝细胞hmgb1的移位及释放情况。 目的：(1)研究lps或tnf-，刺激是否可引起肝细胞hmgb1的移位及释放，检测是否同时伴有其他细胞因子的分泌；(2)研究慢性重型乙型肝炎患者肝细胞hmgb1移位；(3)研究d-gain+lps诱导的急性肝衰竭小鼠肝细胞hmgb1移位；(4)初步探讨肝细胞hmgb1移位及释放的可能机制。 方法：(1)体外用不同浓度lps或tnf-刺激肝细胞系hepg2细胞，不同时间点分别收集细胞和培养上清。mtt法测定细胞存活率，tunel法检测细胞凋亡率，同时测定培养上清中的ldh含量，以明确细胞是否凋亡或坏死。western blotting方法检测培养上清，细胞核和细胞浆组分蛋白中hmgb1的含量，免疫荧光技术观察hmgb1移位。elisa，细胞因子芯片技术检测上清中的细胞因子分泌。(2)分别收集慢性重型乙型肝炎，慢性乙型肝炎患者及正常肝组织，免疫组织化学染色观察hmgb1在肝细胞中的分布情况。同时行he染色，评估肝组织的病理学改变。(3) d-gain联合lps腹腔注射，诱导小鼠急性肝衰竭模型，同时设置生理盐水对照组。于d-galn+lps注射后3h处死动物，收集肝脏组织，进行hmgb1的免疫组织化学染色。(4)用western blotting和免疫荧光技术，分别观察来普霉素b(lmb)和曲古霉素(tsa)对lps诱导的肝细胞hmgb1移位和释放的影响。 结果：(1)体外用lps或tnf-刺激可诱导hepg2细胞释放hmgb1，释放到上清中的hmgb1量随着作用时间延长而增高，20h时达到峰值，免疫荧光观察到hepg2细胞胞核中的hmgb1发生了向细胞浆的移位。在一定剂量范围内，lps(400ng/ml)或tnf-(25ng/ml)诱导的hmgb1分泌量随lps或tnf-剂量增加而增加。mtt，tunel检测及上清中ldh含量测定排除了细胞处于凋亡及坏死状态。细胞组分蛋白westem blotting分析亦证实了细胞浆中的hmgb1表达增强。elisa和细胞因子抗体芯片检测表明lps，tnf-或重组hmgb1刺激hepg2细胞24h，仅见个别其他细胞因子的释放。(2)慢性重型乙型肝炎患者肝细胞中可观察到明显的hmgb1的移位，移位率约为32.847.13。而在慢性乙型肝炎组及正常肝组织中，肝细胞hmgb1集中分布于细胞核中，未见明显的移位。(3) d-galn+lps注射后3h，发生移位的肝细胞百分率为：27.424.99。移位率与生理盐水对照组比较，显著为高(p<0.01)。(4)体外crm1抑制剂lmb可以显著减少lps诱导的hepg2细胞hmgb1的释放，及hmgb1从细胞核向细胞浆的移位。组蛋白去乙酰化酶抑制剂tsa可以促进lps诱导的hmgb1释放，促进hmgb1从细胞核向细胞浆的移位。 结论：(1) lps或tnf-a可时间及剂量依赖性诱导体外培养的hepg2细胞核蛋白hmgb1的移位及释放。(2)慢性重型乙型肝炎患者肝细胞中存在hmgb1从细胞核向胞浆的移位，而在慢性乙型肝炎及正常对照肝细胞中并无这种移位现象。(3)d-gal+lps诱导的急性肝衰竭模型小鼠肝细胞hmgbi存在从细胞核向胞浆的移位。(4)lps诱导的hepg2细胞hmgb1的移位和释放可能存在crm1依赖的核转运，可能与乙酰化相关。肝衰竭是一种病死率很高的临床危重症，在我国肝衰竭最主要的原因是病毒性肝炎，其中最主要的是乙肝病毒( hepatitis bvirus，hbv)感染。而高迁移率族蛋白l(high mobility group box-1protein，hmgb1)在细胞外是一种关键的“晚期”促炎症介质，已经成为脓毒症防治研究中一个重要的新靶标。有研究表明hmgb1可能在重型肝炎肝衰竭中发挥重要作用。本研究旨在探讨肝衰竭时肝细胞hmgb1的移位及释放情况。 目的：(1)研究lps或tnf-，刺激是否可引起肝细胞hmgb1的移位及释放，检测是否同时伴有其他细胞因子的分泌；(2)研究慢性重型乙型肝炎患者肝细胞hmgb1移位；(3)研究d-gain+lps诱导的急性肝衰竭小鼠肝细胞hmgb1移位；(4)初步探讨肝细胞hmgb1移位及释放的可能机制。 方法：(1)体外用不同浓度lps或tnf-刺激肝细胞系hepg2细胞，不同时间点分别收集细胞和培养上清。mtt法测定细胞存活率，tunel法检测细胞凋亡率，同时测定培养上清中的ldh含量，以明确细胞是否凋亡或坏死。western blotting方法检测培养上清，细胞核和细胞浆组分蛋白中hmgb1的含量，免疫荧光技术观察hmgb1移位。elisa，细胞因子芯片技术检测上清中的细胞因子分泌。(2)分别收集慢性重型乙型肝炎，慢性乙型肝炎患者及正常肝组织，免疫组织化学染色观察hmgb1在肝细胞中的分布情况。同时行he染色，评估肝组织的病理学改变。(3) d-gain联合lps腹腔注射，诱导小鼠急性肝衰竭模型，同时设置生理盐水对照组。于d-galn+lps注射后3h处死动物，收集肝脏组织，进行hmgb1的免疫组织化学染色。(4)用western blotting和免疫荧光技术，分别观察来普霉素b(lmb)和曲古霉素(tsa)对lps诱导的肝细胞hmgb1移位和释放的影响。 结果：(1)体外用lps或tnf-刺激可诱导hepg2细胞释放hmgb1，释放到上清中的hmgb1量随着作用时间延长而增高，20h时达到峰值，免疫荧光观察到hepg2细胞胞核中的hmgb1发生了向细胞浆的移位。在一定剂量范围内，lps(400ng/ml)或tnf-(25ng/ml)诱导的hmgb1分泌量随lps或tnf-剂量增加而增加。mtt，tunel检测及上清中ldh含量测定排除了细胞处于凋亡及坏死状态。细胞组分蛋白westem blotting分析亦证实了细胞浆中的hmgb1表达增强。elisa和细胞因子抗体芯片检测表明lps，tnf-或重组hmgb1刺激hepg2细胞24h，仅见个别其他细胞因子的释放。(2)慢性重型乙型肝炎患者肝细胞中可观察到明显的hmgb1的移位，移位率约为32.847.13。而在慢性乙型肝炎组及正常肝组织中，肝细胞hmgb1集中分布于细胞核中，未见明显的移位。(3) d-galn+lps注射后3h，发生移位的肝细胞百分率为：27.424.99。移位率与生理盐水对照组比较，显著为高(p<0.01)。(4)体外crm1抑制剂lmb可以显著减少lps诱导的hepg2细胞hmgb1的释放，及hmgb1从细胞核向细胞浆的移位。组蛋白去乙酰化酶抑制剂tsa可以促进lps诱导的hmgb1释放，促进hmgb1从细胞核向细胞浆的移位。 结论：(1) lps或tnf-a可时间及剂量依赖性诱导体外培养的hepg2细胞核蛋白hmgb1的移位及释放。(2)慢性重型乙型肝炎患者肝细胞中存在hmgb1从细胞核向胞浆的移位，而在慢性乙型肝炎及正常对照肝细胞中并无这种移位现象。(3)d-gal+lps诱导的急性肝衰竭模型小鼠肝细胞hmgbi存在从细胞核向胞浆的移位。(4)lps诱导的hepg2细胞hmgb1的移位和释放可能存在crm1依赖的核转运，可能与乙酰化相关。肝衰竭是一种病死率很高的临床危重症，在我国肝衰竭最主要的原因是病毒性肝炎，其中最主要的是乙肝病毒( hepatitis bvirus，hbv)感染。而高迁移率族蛋白l(high mobility group box-1protein，hmgb1)在细胞外是一种关键的“晚期”促炎症介质，已经成为脓毒症防治研究中一个重要的新靶标。有研究表明hmgb1可能在重型肝炎肝衰竭中发挥重要作用。本研究旨在探讨肝衰竭时肝细胞hmgb1的移位及释放情况。 目的：(1)研究lps或tnf-，刺激是否可引起肝细胞hmgb1的移位及释放，检测是否同时伴有其他细胞因子的分泌；(2)研究慢性重型乙型肝炎患者肝细胞hmgb1移位；(3)研究d-gain+lps诱导的急性肝衰竭小鼠肝细胞hmgb1移位；(4)初步探讨肝细胞hmgb1移位及释放的可能机制。 方法：(1)体外用不同浓度lps或tnf-刺激肝细胞系hepg2细胞，不同时间点分别收集细胞和培养上清。mtt法测定细胞存活率，tunel法检测细胞凋亡率，同时测定培养上清中的ldh含量，以明确细胞是否凋亡或坏死。western blotting方法检测培养上清，细胞核和细胞浆组分蛋白中hmgb1的含量，免疫荧光技术观察hmgb1移位。elisa，细胞因子芯片技术检测上清中的细胞因子分泌。(2)分别收集慢性重型乙型肝炎，慢性乙型肝炎患者及正常肝组织，免疫组织化学染色观察hmgb1在肝细胞中的分布情况。同时行he染色，评估肝组织的病理学改变。(3) d-gain联合lps腹腔注射，诱导小鼠急性肝衰竭模型，同时设置生理盐水对照组。于d-galn+lps注射后3h处死动物，收集肝脏组织，进行hmgb1的免疫组织化学染色。(4)用western blotting和免疫荧光技术，分别观察来普霉素b(lmb)和曲古霉素(tsa)对lps诱导的肝细胞hmgb1移位和释放的影响。 结果：(1)体外用lps或tnf-刺激可诱导hepg2细胞释放hmgb1，释放到上清中的hmgb1量随着作用时间延长而增高，20h时达到峰值，免疫荧光观察到hepg2细胞胞核中的hmgb1发生了向细胞浆的移位。在一定剂量范围内，lps(400ng/ml)或tnf-(25ng/ml)诱导的hmgb1分泌量随lps或tnf-剂量增加而增加。mtt，tunel检测及上清中ldh含量测定排除了细胞处于凋亡及坏死状态。细胞组分蛋白westem blotting分析亦证实了细胞浆中的hmgb1表达增强。elisa和细胞因子抗体芯片检测表明lps，tnf-或重组hmgb1刺激hepg2细胞24h，仅见个别其他细胞因子的释放。(2)慢性重型乙型肝炎患者肝细胞中可观察到明显的hmgb1的移位，移位率约为32.847.13。而在慢性乙型肝炎组及正常肝组织中，肝细胞hmgb1集中分布于细胞核中，未见明显的移位。(3) d-galn+lps注射后3h，发生移位的肝细胞百分率为：27.424.99。移位率与生理盐水对照组比较，显著为高(p<0.01)。(4)体外crm1抑制剂lmb可以显著减少lps诱导的hepg2细胞hmgb1的释放，及hmgb1从细胞核向细胞浆的移位。组蛋白去乙酰化酶抑制剂tsa可以促进lps诱导的hmgb1释放，促进hmgb1从细胞核向细胞浆的移位。 结论：(1) lps或tnf-a可时间及剂量依赖性诱导体外培养的hepg2细胞核蛋白hmgb1的移位及释放。(2)慢性重型乙型肝炎患者肝细胞中存在hmgb1从细胞核向胞浆的移位，而在慢性乙型肝炎及正常对照肝细胞中并无这种移位现象。(3)d-gal+lps诱导的急性肝衰竭模型小鼠肝细胞hmgbi存在从细胞核向胞浆的移位。(4)lps诱导的hepg2细胞hmgb1的移位和释放可能存在crm1依赖的核转运，可能与乙酰化相关。肝衰竭是一种病死率很高的临床危重症，在我国肝衰竭最主要的原因是病毒性肝炎，其中最主要的是乙肝病毒( hepatitis bvirus，hbv)感染。而高迁移率族蛋白l(high mobility group box-1protein，hmgb1)在细胞外是一种关键的“晚期”促炎症介质，已经成为脓毒症防治研究中一个重要的新靶标。有研究表明hmgb1可能在重型肝炎肝衰竭中发挥重要作用。本研究旨在探讨肝衰竭时肝细胞hmgb1的移位及释放情况。 目的：(1)研究lps或tnf-，刺激是否可引起肝细胞hmgb1的移位及释放，检测是否同时伴有其他细胞因子的分泌；(2)研究慢性重型乙型肝炎患者肝细胞hmgb1移位；(3)研究d-gain+lps诱导的急性肝衰竭小鼠肝细胞hmgb1移位；(4)初步探讨肝细胞hmgb1移位及释放的可能机制。 方法：(1)体外用不同浓度lps或tnf-刺激肝细胞系hepg2细胞，不同时间点分别收集细胞和培养上清。mtt法测定细胞存活率，tunel法检测细胞凋亡率，同时测定培养上清中的ldh含量，以明确细胞是否凋亡或坏死。western blotting方法检测培养上清，细胞核和细胞浆组分蛋白中hmgb1的含量，免疫荧光技术观察hmgb1移位。elisa，细胞因子芯片技术检测上清中的细胞因子分泌。(2)分别收集慢性重型乙型肝炎，慢性乙型肝炎患者及正常肝组织，免疫组织化学染色观察hmgb1在肝细胞中的分布情况。同时行he染色，评估肝组织的病理学改变。(3) d-gain联合lps腹腔注射，诱导小鼠急性肝衰竭模型，同时设置生理盐水对照组。于d-galn+lps注射后3h处死动物，收集肝脏组织，进行hmgb1的免疫组织化学染色。(4)用western blotting和免疫荧光技术，分别观察来普霉素b(lmb)和曲古霉素(tsa)对lps诱导的肝细胞hmgb1移位和释放的影响。 结果：(1)体外用lps或tnf-刺激可诱导hepg2细胞释放hmgb1，释放到上清中的hmgb1量随着作用时间延长而增高，20h时达到峰值，免疫荧光观察到hepg2细胞胞核中的hmgb1发生了向细胞浆的移位。在一定剂量范围内，lps(400ng/ml)或tnf-(25ng/ml)诱导的hmgb1分泌量随lps或tnf-剂量增加而增加。mtt，tunel检测及上清中ldh含量测定排除了细胞处于凋亡及坏死状态。细胞组分蛋白westem blotting分析亦证实了细胞浆中的hmgb1表达增强。elisa和细胞因子抗体芯片检测表明lps，tnf-或重组hmgb1刺激hepg2细胞24h，仅见个别其他细胞因子的释放。(2)慢性重型乙型肝炎患者肝细胞中可观察到明显的hmgb1的移位，移位率约为32.847.13。而在慢性乙型肝炎组及正常肝组织中，肝细胞hmgb1集中分布于细胞核中，未见明显的移位。(3) d-galn+lps注射后3h，发生移位的肝细胞百分率为：27.424.99。移位率与生理盐水对照组比较，显著为高(p<0.01)。(4)体外crm1抑制剂lmb可以显著减少lps诱导的hepg2细胞hmgb1的释放，及hmgb1从细胞核向细胞浆的移位。组蛋白去乙酰化酶抑制剂tsa可以促进lps诱导的hmgb1释放，促进hmgb1从细胞核向细胞浆的移位。 结论：(1) lps或tnf-a可时间及剂量依赖性诱导体外培养的hepg2细胞核蛋白hmgb1的移位及释放。(2)慢性重型乙型肝炎患者肝细胞中存在hmgb1从细胞核向胞浆的移位，而在慢性乙型肝炎及正常对照肝细胞中并无这种移位现象。(3)d-gal+lps诱导的急性肝衰竭模型小鼠肝细胞hmgbi存在从细胞核向胞浆的移位。(4)lps诱导的hepg2细胞hmgb1的移位和释放可能存在crm1依赖的核转运，可能与乙酰化相关。肝衰竭是一种病死率很高的临床危重症，在我国肝衰竭最主要的原因是病毒性肝炎，其中最主要的是乙肝病毒( hepatitis bvirus，hbv)感染。而高迁移率族蛋白l(high mobility group box-1protein，hmgb1)在细胞外是一种关键的“晚期”促炎症介质，已经成为脓毒症防治研究中一个重要的新靶标。有研究表明hmgb1可能在重型肝炎肝衰竭中发挥重要作用。本研究旨在探讨肝衰竭时肝细胞hmgb1的移位及释放情况。 目的：(1)研究lps或tnf-，刺激是否可引起肝细胞hmgb1的移位及释放，检测是否同时伴有其他细胞因子的分泌；(2)研究慢性重型乙型肝炎患者肝细胞hmgb1移位；(3)研究d-gain+lps诱导的急性肝衰竭小鼠肝细胞hmgb1移位；(4)初步探讨肝细胞hmgb1移位及释放的可能机制。 方法：(1)体外用不同浓度lps或tnf-刺激肝细胞系hepg2细胞，不同时间点分别收集细胞和培养上清。mtt法测定细胞存活率，tunel法检测细胞凋亡率，同时测定培养上清中的ldh含量，以明确细胞是否凋亡或坏死。western blotting方法检测培养上清，细胞核和细胞浆组分蛋白中hmgb1的含量，免疫荧光技术观察hmgb1移位。elisa，细胞因子芯片技术检测上清中的细胞因子分泌。(2)分别收集慢性重型乙型肝炎，慢性乙型肝炎患者及正常肝组织，免疫组织化学染色观察hmgb1在肝细胞中的分布情况。同时行he染色，评估肝组织的病理学改变。(3) d-gain联合lps腹腔注射，诱导小鼠急性肝衰竭模型，同时设置生理盐水对照组。于d-galn+lps注射后3h处死动物，收集肝脏组织，进行hmgb1的免疫组织化学染色。(4)用western blotting和免疫荧光技术，分别观察来普霉素b(lmb)和曲古霉素(tsa)对lps诱导的肝细胞hmgb1移位和释放的影响。 结果：(1)体外用lps或tnf-刺激可诱导hepg2细胞释放hmgb1，释放到上清中的hmgb1量随着作用时间延长而增高，20h时达到峰值，免疫荧光观察到hepg2细胞胞核中的hmgb1发生了向细胞浆的移位。在一定剂量范围内，lps(400ng/ml)或tnf-(25ng/ml)诱导的hmgb1分泌量随lps或tnf-剂量增加而增加。mtt，tunel检测及上清中ldh含量测定排除了细胞处于凋亡及坏死状态。细胞组分蛋白westem blotting分析亦证实了细胞浆中的hmgb1表达增强。elisa和细胞因子抗体芯片检测表明lps，tnf-或重组hmgb1刺激hepg2细胞24h，仅见个别其他细胞因子的释放。(2)慢性重型乙型肝炎患者肝细胞中可观察到明显的hmgb1的移位，移位率约为32.847.13。而在慢性乙型肝炎组及正常肝组织中，肝细胞hmgb1集中分布于细胞核中，未见明显的移位。(3) d-galn+lps注射后3h，发生移位的肝细胞百分率为：27.424.99。移位率与生理盐水对照组比较，显著为高(p<0.01)。(4)体外crm1抑制剂lmb可以显著减少lps诱导的hepg2细胞hmgb1的释放，及hmgb1从细胞核向细胞浆的移位。组蛋白去乙酰化酶抑制剂tsa可以促进lps诱导的hmgb1释放，促进hmgb1从细胞核向细胞浆的移位。 结论：(1) lps或tnf-a可时间及剂量依赖性诱导体外培养的hepg2细胞核蛋白hmgb1的移位及释放。(2)慢性重型乙型肝炎患者肝细胞中存在hmgb1从细胞核向胞浆的移位，而在慢性乙型肝炎及正常对照肝细胞中并无这种移位现象。(3)d-gal+lps诱导的急性肝衰竭模型小鼠肝细胞hmgbi存在从细胞核向胞浆的移位。(4)lps诱导的hepg2细胞hmgb1的移位和释放可能存在crm1依赖的核转运，可能与乙酰化相关。肝衰竭是一种病死率很高的临床危重症，在我国肝衰竭最主要的原因是病毒性肝炎，其中最主要的是乙肝病毒( hepatitis bvirus，hbv)感染。而高迁移率族蛋白l(high mobility group box-1protein，hmgb1)在细胞外是一种关键的“晚期”促炎症介质，已经成为脓毒症防治研究中一个重要的新靶标。有研究表明hmgb1可能在重型肝炎肝衰竭中发挥重要作用。本研究旨在探讨肝衰竭时肝细胞hmgb1的移位及释放情况。 目的：(1)研究lps或tnf-，刺激是否可引起肝细胞hmgb1的移位及释放，检测是否同时伴有其他细胞因子的分泌；(2)研究慢性重型乙型肝炎患者肝细胞hmgb1移位；(3)研究d-gain+lps诱