（植物学专业论文）盾叶薯蓣四倍体诱导及高温抗性研究.pdf

华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 摘要 盾叶薯蓣( d i o s c o r e a z i n g i b e r e n s i sc h w i g h t ) 是我国特有的甾体激素类药 源植物，也是世界上薯蓣皂甙元含量最高的植物。由于过度采挖，其野生资源濒 临枯竭。目前在人工栽培种中存在薯蓣皂甙元含量低、种质衰退严重等问题。利 用植物多倍体的生长量较高、抗逆性增强等特点，可望为改良盾叶薯蓣种质提供 一条新途径。本试验利用组织培养结合秋水仙素诱变技术，分别处理盾叶薯蓣 种子和离体培养获得的微块茎，通过根尖压片和流式细胞仪检测，鉴定处理后植 株的倍性，对离体再生的四倍体和二倍体盾叶薯蓣幼苗进行高温胁迫试验，分别 测定叶片细胞内的相对电导率和丙二醛浓度、活性氧( r o s ) 类物质的积累和抗 氧化酶类以及抗氧化物质的动态变化，以评价不同倍性盾叶薯蓣植株对高温胁迫 的抗性，为其多倍体育种提供理论依据。 主要研究结果如下： 1 盾叶薯蓣四倍体的诱导 ( 1 ) 以盾叶薯蓣种子为试材，秋水仙素设置3 个浓度梯度( o 0 5 、0 1 0 、 o 2 0 ) ，浸泡时间分别为1 2h 、2 4h 和3 6h 。结果显示，当秋水仙素浓度为0 2 0 ， 处理1 2h 时，四倍体诱导率最高，为1 1 5 。 ( 2 ) 以离体培养获得的盾叶薯蓣微块茎为材料，在秋水仙素浓度为0 1 0 0 2 0 ，处理时间为2 4h 4 8h 时均能诱导四倍体的形成。但当秋水仙素浓度为 o 15 ，处理2 4h 时四倍体诱导效果最好，诱导率为2 6 4 。 两种方法相比较，以种子为试材进行四倍体诱导，较省时省力，而且盾叶薯 蓣为异花授粉作物，用其种子作为材料形成的四倍体遗传基础差异较大，在育种 上具有一定的应用价值。以微块茎为材料进行四倍体诱导时，获得的四倍体诱导 率较高，而且快繁的微块茎来自于同一单株，遗传基础相同，便于进行遗传分析。 2 不同倍性盾叶薯蓣的高温抗性研究 将二倍体和四倍体盾叶薯蓣试管苗移栽后分别置于2 8o c ( 对照) 和4 2o c 高 温条件下( 光照培养箱中) 处理5d ，在高温处理的第0d 、1d 、3d 、5d 和7d ( 高温处理2d 后，置于2 8o c 缓苗2d ) 5 个时间点，测定叶片内j 高温胁迫相 关的各项牛理指标。具体结果如下： 盾叶薯蓣v t l g - 体诱导及高温抗件研究 ( 1 ) 相对电导率和丙二醛( m d a ) 浓度：叶片细胞的相对电导率和m d a 浓度随处理时间的增加呈上升趋势，但相对电导率和m d a 浓度变化在不同倍性间 存在差异，所有处理中四倍体幼苗叶片的相对电导率( p o 0 1 ) 和m d a 浓度 ( p o 0 1 ) 均显著小于二倍体。说明高温胁迫下四倍体具有较好的细胞膜稳定性。 ( 2 ) 超氧阴离子( 0 2 - ) 和过氧化氢( h 2 0 2 ) 等活性氧类物质：二倍体和 四倍体盾叶薯蓣幼苗叶片中的0 2 一产生速率和h 2 0 2 浓度随处理时间的延长呈上 升趋势，表明高温诱导盾叶薯蓣叶片内0 2 一和h 2 0 2 等活性氧的积累。实验结果 显示，四倍体0 2 一产生速率( p o 0 1 ) 和h 2 0 2 浓度( p o 0 1 ) 均小于二倍体， 预示四倍体植株遭受的活性氧伤害可能少于二倍体植株。 ( 3 ) 抗氧化酶类：二倍体和四倍体幼苗叶片中的超氧化物岐化酶( s o d ) 和谷胱甘肽还原酶( g r ) 的活性表现出先升后降的趋势，而过氧化物酶( p o d ) 、 过氧化氢酶( c a t ) 和抗坏血酸过氧化物酶( a p x ) 的酶活随高温处理时间的延 长而逐渐下降；但相同处理条件下四倍体植株的各类抗氧化酶活性除了p o d 以 外，均显著高于二倍体植株，说明高温胁迫下四倍体具有维持较高酶活的能力， 暗示四倍体植物在高温环境下较二倍体植物能更有效地清除植物体内的活性氧。 ( 4 ) 抗坏血酸( a s a ) 和谷胱甘肽( g s h ) 等抗氧化物质：二倍体和四倍 体中的a s a 浓度分别在高温处理的第3 天或第5 天开始下降。g s h 浓度随高温处理 时问的延长呈下降趋势。但四倍体幼苗的a s a ( p 0 。0 1 ) 和g s h ( p 0 0 1 ) 浓度 在高温处理的各个阶段均显著高于二二倍体，说明高温胁迫下四倍体植株具有较高 的清除活性氧的能力。 以上研究结果表明，与二倍体植株相比， j q 倍体盾i i l 薯蓣在高温胁迫下具有 较低的活性氧类物质的积累和较低浓度的相对电导率与丙二醛浓度，但具有较高 浓度的抗氧化物质和较高的抗氧化嗨活性。显示叫倍体植株具有较好的清除活性 氧的机制，使其对高温胁迫具有更好的耐受性。 关键词：盾叶薯蓣；秋水仙素；多倍体；抗氧化系统；高温抗性 2 华中农业人学2 0 0 9 届硕上学位论文 a b s t r a c t d i o s c o r e az i n g i b e r e n s i sc h w i g h t ，c o n t a i n i n gh i g hc o n c e n t r a t i o no fd i o s g e n i n ， i so n eo ft h ei m p o r t a n tr a wm a t e r i a l st h a tc a nb es y n t h e s i z e ds t e r o i dh o r m o n ed r u g s s i n c ed z i n g i b e r e n s i sh a sb e e no v e r - i n t e n s i v e l yh a r v e s t e di nt h ep a s ty e a r s ，f e ww i l d p o p u l a t i o n sc a nb ef o u n da n dc u r r e n tp r o d u c t i o no f t h i sm e d i c i n a lp l a n tc o m e sf r o m c u l t i v a t i o n s i n c ep o l y p l o i di sr e p o r t e dt oh a v et h ep o t e n t i a li na c c u m u l a t i o no f s e c o n d a r ym e t a b o l i s mp r o d u c t sa n dh i g h e rt o l e r a n c et oe n v i r o n m e n t a ls t r e s s ， a p p l i c a t i o no fp o l y p l o i di nd i o s c o r e ab r e e d i n gh a sb e e nc o n s i d e r e dah o p e f u lw a y t o i m p r o v er h i z o m eq u a l i t ya n d r e s i s t a n c et oe n v i r o n m e n t a ls t r e s s i nt h i ss t u d y , c o l c h i c i n ei n d u c i n gm e t h o d w a sa p p l i e do ns e e d sa n dt i s s u ec u l t u r e dm i r c o t u b e so fd z i n g i b e r e n s i s t h et e t r o p l o i dw e r es c r e e n e do u tb yr o o tt i pc h r o m o s o m ec o u n t i n ga n d f l c ( f l o wc y t o m e t e r ) t h et o l e r a n c eo ft h e s et e t r o p l o i dp l a n t st oh i g ht e m p e r a t u r e w a se v a l u a t e dt h r o u g ht h e i rp h y s i o l o g i c a li n d i c e su n d e rc o n t r o l l e dh i g ht e m p e r a t u r e t h em a i nr e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： 1 t e t r o p l o i di n d u c t i o n ( 1 ) s e e d sa sm a t e r i a l ：t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h eh i g h e s ti n d u c i n gr a t e ( 11 5 ) w a sa c h i e v e db yt r e a t m e n tw i t h0 2 c o l c h i c i n ef o r12h ( 2 ) m i c r o t u b e sa sm a r t e r i a l ：t e t r o p l o i dc o u l db eo b t a i n e df r o ma n yc o m b i n a t i o n o f0 10 - 0 2 0 c o l c h i c i n e st r e a t i n g2 4h - 4 8h b u tt h em o s te f f i c i e n ti n d u c i n gr a t e w a sa c h i e v e db yt r e a t m e n tw i t h0 15 c o l c h i c i n ef o r12h s e e dt r e a t m e n ti sm o r ec o n v e n i e n tf o rm a n i p u l a t i o na n dp r o d u c e sh i g h e rg e n e t i c d i v e r s i t y , w h i c hm i g h tb ep o t e n t i a li nf u r t h e rb r e e d i n g ；m a t e r i a lo ft i s s u ec u l t u r e d m i c r o - t u b eg i v e sh i g h e ri n d u c i n ge f f i c i e n c ya n du n i f o r mg e n e t i cb a c k g r o u n d ，w h i c h m i g h tb ef a v o r a b l ef o rag i v e nc u l t i v a rt oi m p r o v er e s i s t a n c e 2 t o l e r a n c ec o m p a r i s o no fd i p l o i da n dt e t r a p l o i dp l a n t st oh i g ht e m p e r a t u r e s t r e s s t i s s u ec u l t u r e dd i p l o i da n dt e t r a p l o i df r o mt h es a m eg e n o t y p ew e r et r a n s p l a n t e d i n t op o t sa f t e ra c c l i m a t i o n t h es u r v i v a lp l a n t sw e r eg r o w nu n d e r2 8o c ( c o n t r 0 1 ) o r 4 2o cf o r5da n dt h e nr e c o v e r e da t2 8o cf o r2d l e a v e ss h o u l db es a m p l e de v e r y 3 盾叶薯蓣网倍体诱导及高温抗性研究 t w od a y sf r o mt h ef i r s td a yt o7 md a yt oe x a m i n et h ep h y s i o l o g i c a li n d i c e sr e l a t e dt o h e a t r e s i s t a n c e t h er e s u l t sa r el i s t e da sf o l l o w i n g ： ( 1 ) r e la n dm d ac o n c e n t r a t i o n ：r e l ( p o 0 1 ) a n dm d a ( p 0 0 1 ) c o n c e n t r a t i o ni nt e t r a p l o i dw e r es i g n i f i c a n t l yl o w e ra ta l lt r e a t m e n t st h a ni nd i p l o i d t h er e s u l ts u g g e s t st h a tt e t r a p l o i dp l a n t sh a v eg r e a t e rm e m b r a n es t a b i l i t yu n d e rh i g h t e m p e r a t u r es t r e s s ( 2 ) r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ( r o s ) ：s u p e r o x i d er a d i c a l ( 0 2 _ ) p r o d u c t i o nr a t e a n dh e 0 2c o n c e n t r a t i o nw e r ea c c u m u l a t e dw h e nt h ep l a n t se x p o s e dt oh i g h t e m p e r a t u r e t h ei n d i c e so fr o s i nt e t r a p l o i dw e r el o w e rt h a nt h a ti nd i p l o i d ，w h i c h i m p l i e st h a tt h es a m eh i g ht e m p e r a t u r es t r e s sd i dl e s si n j u r yt ot h et e t r a p i o i d ( 3 ) a n t i o x i d a n te n z y m e s ( s o d 、p o d 、c a t 、a p xa n dg r ) ：u n d e rh i g h t e m p e r a t u r es t r e s s ，t h ea c t i v i t i e so fs o da n dg rd i s p l a y e ds i m i l a rt r e n d ，w h i c h c l i m b e ds l i g h t l yw i t h i nf i r s t1o r3da n dt h e nd e c l i n e dg r a d u a l l y ，w h e r e a st h e a c t i v i t i e so fp o d ，c a ta n da p xw e r ed e c l i n i n gw i t ht h ec o n t i n u a n c eo ft r e a t m e n t t i m e e x c e p tp o d ，a l lt h ea n t i o x i d a n te n z y m e se x h i b i t e dh i i g h e ra c t i v i t i e si nt h e t e t r a p l o i dp l a n t st h a ni nt h ed i p l o i d ，a n dt h ed i f f e r e n c e sa r es i g n i f i c a n c e ，w h i c h i n d i c a t e dt h a tt e t r a p l o i dp l a n t sh a v et h ea b i l i t yt om a i n t a i nh i g hl e v e lo fa n t i o x i d a n t e n z y m ea c t i v i t i e st or e m o v a lo fo x y g e ns u b s t a n c e s ( 4 ) a n t i o x i d a n t ( a s aa n dg s h ) ：u n d e rh i g ht e m p e r a t u r es t r e s s ，a s aa n dg s h c o n c e n t r a t i o nd e c r e a s e dw h e np l a n t se x p o s e di nh i g ht e m p e r a t u r es t r e s s ，b u tt h e t e t r a p l o i dp l a n t sm a i n t a i n e dh i g h e rl e v e lo fa s a ( p o o1 ) a n dg s h ( p o 01 ) t h a n t h ed i p l o i d ，s u g g e s t i n gt h et e t r a p l o i dh a v eg r e a t e ra b i l i t yt os c a v e n g er o s i nc o n c l u s i o n ，c o m p a r i n gw i t hd i p l o i d ，t h et e t r o p l o i dh a sl o w e ra c c u m u l a t i o no f r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ( r o s ) ，l o w e rr e la n dm d a c o n c e n t r a t i o n ，b u th i g h e r p r o d u c t i o n so fa n t i o x i d a n ta n da n t i o x i d a n te n z y m ea c t i v i t i e s ，w h i c hi n d i c a t e dt h e y h a ss u f f e r e dl o w e ri n j u r ya n db e t t e rp r o t e c t i n gm e c h a n i s m ，a l l o w i n gt h e mt ot o l e r a t ea c e r t a i ne x t e n to f h i g ht e m p e r a t u r es t r e s s k e y w o r d s ：d i o s c o r e az i n g i b e r e n s i sc h w i g h t ；t e t r a p l o i d ；a n t i o x i d a n ts y s t e m ； h i g ht e m p e r a t u r es t r e s s 4 华中农业人学2 0 0 9 届硕j j 学位论文 缩略词表 5 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 是否保密否 如需保密，解密时间年 月 日 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位 或证书而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究 所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研究生签名： 歃袋时间：砌7 年6 月 占日 学位论文使用授权书 本人完全了解华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按照 学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电 子版，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文。本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学 位论文的全部或部分内容，同时本人保留在其他媒体发表论文的权力。 注：保密学位论文( 即涉及技术秘密、商业秘密或申请专利等潜在需要提交保密的 论文) 在解密后适用于本授权书 学位论文作者签名：歌袋钆 导师签名：拶塍吾。念 签名日期：砷口7 年月侍日 签名日期：夕c 卯夕年占月纱日 注：淆：瞄本表直接装订在学位论文的扉页和口录之问 盾叶薯蓣四倍体诱导及高温抗性研究 1 月i j 吾 1 1 课题的提出 高温是限制植物生长和提高植物生产力的重要非生物因子之一。高温胁迫条 件下，植物受到的伤害主要有光合作用受到抑制，细胞膜受到伤害，细胞出现衰 老甚至死亡( w a h i d2 0 0 7 ；x ue ta 1 2 0 0 6 ) 。高温对植物伤害的主要机制是活性氧 ( r o s ) 产生过剩，如超氧阴离子自由基( 0 2 0 - ) 、羟自由基( o h ) 、过氧化氢 ( h 2 0 2 ) 和单线念氧( 1 0 2 ) 等( l i ua n dh u a n g ，2 0 0 0 ) 。r o s 的积累常导致膜脂 过氧化、蛋白质变性、d n a 链断裂等，最终导致植物体内代谢的紊乱( m i t t l e r , 2 0 0 2 ) 。然而，植物体内有特殊的保护机制以减轻或消除r o s 造成的伤害。r o s 的清除机制主要有抗氧化酶系统，包括超氧化物岐化酶( s o d ) 、过氧化物酶 ( p o d ) 、过氧化氢酶( c a t ) 、抗坏血酸过氧化物酶( a p x ) 、谷胱甘肽还原酶 ( g r ) ；以及非酶活系统，包括抗坏血酸( a s a ) 和谷胱甘肽( g s h ) 等。因此 植物体内这些生理指标可以反映其对高温胁迫的抗性( a l m e s e l m a n ie ta 1 ，2 0 0 6 ) 。 利用生物技术培育多倍体是目前药用植物常用的育种手段之一。植物多倍体 一般具有不同器官的巨型性( c h e na n dg a o ，2 0 0 7 ；l i ue ta 1 ，2 0 0 7 ；n i g e le ta 1 ， 2 0 0 7 ；a l l u me ta 1 ，2 0 0 7 ) 以及抗逆性强( s h a n ge ta 1 ，2 0 0 3 ；l i ue ta 1 ，2 0 0 2 ； n o n t u t h u k oa n da l p h e u s ，2 0 0 8 ；b a s e le ta 1 ，2 0 0 8 ) 、药用成分含量高等特点 ( s v e h l i k o v aa n dr e p c a k ，2 0 0 0 ；b e r k o w , 2 0 01 ；j e s u s - g o n z a l e za n dw e a t h e r s ，2 0 0 3 ； k i me ta 1 ，2 0 0 4 ) ，可满足中药材优质高产的需要。b e r k o w ( 2 0 0 1 ) 的研究表明 四倍体曼陀罗d a t u r ai n n o x i a 并n d a t u r as t r a m o n i u m 的种子中含有的生物碱是其 对应二倍体的2 倍。而四倍体青蒿中的青蒿素含量是二倍体的6 倍( j e s u s g o n z a l e z a n dw e a t h e r s ，2 0 0 3 ) 。刘惠吉等( 2 0 0 3 ) 的研究表明，四倍体白菜的抗热性高于 其相应的二倍体。b a s e l 等的研究表明，与二倍体相比，四倍体柑橘对盐胁迫的 耐受性增加( b a s e le ta 1 ，2 0 0 8 ) 。 盾叶薯蓣( d i o s c o r e az i n g i b e r e n s i sc h w i g h t ) 为薯蓣科薯蓣属多年生藤本 植物，原产于中国，自然分布区为北亚热带及中亚热带地区。其根状茎中的薯蓣 皂甙元含量较高，是合成甾体激素类药物的重要原料之一。盾叶薯蓣也是一种传 统的中药材，具有清肺止咳、解毒消肿的功能和降低胆固醇、抗炎、抗肿瘤等作 6 华中农业人学2 0 0 9 届硕十学位论文 用。由于过度采挖，其野生资源濒临枯竭，种质衰退严重( c h 吼e ta 1 ，2 0 0 3 ；y u a n e ta 1 ，2 0 0 5 ) 。目前盾叶薯蓣己转为人工栽培，主要利用盾叶薯蓣根状茎进行繁殖， 但生产中出现薯蓣皂甙元含量逐年下降的问题。为此，有些育种工作者开展了盾 叶薯蓣种子繁殖研究。张友德等通过先期在苗床上育苗以提高种子萌发率及幼苗 质量，但是他们发现当幼苗移栽到田间时常会遭受n 3 0o c 左右的高温，从而导 致幼苗的生长速度降低，还会引起根系老化，代谢失调，形成僵苗或弱苗，影响 其生长和根状茎产量( 张友德等，2 0 0 5 ) 。为解决盾叶薯蓣栽培实践中种质退化 的问题，有些研究者还开展了盾叶薯蓣的多倍体育种尝试，王志安等( 1 9 9 5 ) 曾 用秋水仙素浸泡盾叶薯蓣种子获得了多倍体植株，但这种方法诱导效率较低，而 且缺乏对诱导的四倍体植株的进一步研究。李运合等( 2 0 0 5 ) 用0 1 的秋水仙 素处理带芽点的盾叶薯蓣愈伤组织块，获得了四倍体盾叶薯蓣新材料。周媛等 ( 2 0 0 5 ) 进一步观察比较了四倍体与二倍体盾叶薯蓣的田间生物学习性，发现四 倍体与二倍体植株相比，在展叶、开花、结实和倒苗时间上延迟，总的生长时间 延长，但育性降低；他们还利用高效液相色谱分析的方法，测定出四倍体植株薯 蓣皂甙元含量比二倍体植株高2 7 ( 周媛等，2 0 0 6 ) 。虽然这些研究结果显现出 盾叶薯蓣的多倍体育种有较大的应用前景，但是要培育出产量和有效成分含量 高、抗逆性强的盾叶薯蓣多倍体新品种，尚需要进一步提高盾叶薯蓣多倍体诱导 率和稳定性，并研究和评价其对非生物胁迫如高温的抗性，为多倍体材料的应用 提供理论依据。 1 2 多倍体研究 1 2 1 多倍体产生途径 多倍体产生途径有自然突变和人工诱导两种方式。自然条件如紫外线照射、 温度聚变等可诱发多倍体的产生，例如四倍体梨树的形成( 刘凤君等，2 0 0 3 ) 。 但是自然突变产生多倍体的概率很低，所以倍性育种过程中主要通过物理因素、 化学试剂以及组织培养等人工方式诱导多倍体的产生。 用于诱导多倍体的物理方法有温度聚变、机械损伤、电离辐射、离心力等， 例如用6 0 c o 射线处理萌动的杜仲种子可以产生多倍体( 毕春侠等，1 9 9 9 ) 。但 物理方法诱导效率低且不稳定。 7 盾叶薯蓣四倍体诱导及高温抗性研究 化学诱导多倍体指利用秋水仙素、富民隆、吲哚乙酸、除草剂等化学药剂处 理正在分裂的细胞以诱导染色体加倍。例如l e i r e 等( 2 0 0 6 ) 用o r y z a l i n 处理 二倍体土豆获得了四倍体和非整倍体单株，运泓( 1 9 8 0 ) 等用0 0 1 富民隆处理 当归幼苗生长点获得当归四倍体植株。但目前使用范围最广，最简单有效的多倍 体诱导方法是使用秋水仙素诱导多倍体。用秋水仙素诱导多倍体，只有处于正在 分裂的细胞才能获得多倍体，通常以愈伤、茎端分生组织或萌发的种子为材料。 但不同植株种类，同一植株种类不同材料对秋水仙素的敏感程度不同。因此秋水 仙素处理浓度和时间的选择是能否获得成功诱导结果的关键。秋水仙素有效浓度 一般在o 0 1 0 4 ，以0 2 最为常用；处理时间，一般不少于2 4h ，浓度高 时处理时间相应短些( 张旺凡和汪友蓉，2 0 0 6 ) 。 秋水仙素是一种微管解聚剂，当秋水仙素与正在进行有丝分裂的细胞接触 时，秋水仙素能与微管蛋白异二聚体结合，可以阻断微管蛋白组装成微管，并引 起原有微管的解聚，使细胞中与微管相关的功能受到阻碍或丧失，不能形成仿缍 丝。没有纺缍丝的牵引，染色体不能排列在赤道板上，也不能使已经复制的染色 体分向两极，从而阻碍了中期以后的细胞分裂进程( 彭尽晖等，2 0 0 4 ) 。因为不 同植物不同组织中的微管蛋白与秋水仙素的结合能力不同，所以不同秋水仙素浓 度、不同处理时间以及不同处理方法等都会对植物细胞核的加倍进程产生不同程 度的影响。用秋水仙素处理黄芪丛生芽，当秋水仙素浓度为0 2 ，处理3 6h ，四 倍体的诱导率高达3 5 3 ( c h e na n dg a o ，2 0 0 7 ) 。s h a o 等( 2 0 0 3 ) 在对石榴 同源四倍体的诱导中发现，把石榴的茎尖接种到含有1 0m g l 秋水仙素的m s 培养 基中培养3 0 天，四倍体的诱导率可达2 0 ，而用5 0 0 0m g l 的秋水仙素处理茎尖 11 4h ，则没有得到四倍体植株，说明处理方法对四倍体的诱导具有重要的影响。 l i u 等( 2 0 0 7 ) 的研究表明，与处理茎尖相比，用秋水仙素浸泡种子以获得多倍 体的方法是乎更有效，但由于秋水仙素影响后期幼苗的生长，因而没有得到成熟 的四倍体植株。用秋水仙素处理子叶期幼苗，叶和茎的生长很快受到影响，但植 株最终能恢复生长，从而获得了成熟的四倍体植株。r u b u l u z a 等( 2 0 0 7 ) 用0 0 5 和0 1 ( w v ) 的秋水仙素浸泡c o l o p h o s p e r m u mm o p a n e 种子4 8h 可以获得四 倍体幼苗，当秋水仙素的浓度大于0 1 ，处理h 、j 。间大于4 8h 能严重影响幼苗的 生长，降低幼苗的成活率。 8 华中农业人学2 0 0 9 届顾十学位论文 另外，在组织培养尤其是在愈伤组织培养过程中，常可产生多倍化现象。例 如番木瓜在体细胞胚继代过程中可以产生不同倍性的多倍体( w e l l i n g t o ne ta 1 ， 2 0 0 7 ) ，组织培养过程中能否形成多倍体以及多倍体诱导率的高低可能与材料的 种类、材料的基因型、取材部位、培养基类型、培养条件以及激素种类及其浓度 等有关。 1 2 2 多倍体鉴定方法 植物多倍体鉴定常采用间接法( 如形态学观察、气孔观察、蛋白质电泳、染 色体核型分析等) 和直接法( 如染色体记数、d n a 含量测定等) 相结合来确定 其倍性。首先要对处理的材料进行形态学观察，选择生长迅速，具有器官巨大型 的植株，观察其气孔大i j , 矛n 叶绿体含量。一般四倍体的气孔比二倍体大，叶绿体 含量高于二倍体。例如四倍体玫瑰的花大于其对应的二倍体( a l l u me ta 1 ，2 0 0 7 ) ， 可以直观的辨别出来；而四倍体枣树叶片上的气孔体积大于二倍体，保卫细胞中 的叶绿体含量高于二倍体，通过显微镜很容易把它们区别开来( g ue ta 1 ，2 0 0 5 ) 。 但由于在诱导过程中常出现植株形态变异及环境影响，次方法只能作为辅助手 段。 在间接鉴定的基础上，还需要进行直接鉴定。先是采用流式细胞仪测定单个 细胞的d n a 含量，如果d n a 含量是处理自i 的倍数，则可判定为已经加倍，再进 行染色体制片，观察染色体数目。流式细胞仪能测定细胞d n a 含量，其原理是 先用染色剂对细胞进行染色，然后检测样品的荧光密度值。因为荧光密度与d n a 含量成讵比，所以d n a 含量的柱形图就可直观地反映出染色体的倍性水平，该 方法虽然可以快速鉴定染色体倍性，但测定成本较高。因此，常用流式细胞仪与 染色体计数相结合来鉴定多倍体( 曹艳春，2 0 0 6 ) 。 另外，组织培养技术已成为一种基本的生物学研究方法，而组培芽材料丰富， 取材方便，染色体很少发生变异，故用组培芽进行染色体鉴定也是一种快速而有 效的方法。该方法在小染色体型的甜瓜属和大染色体型的百合与马铃薯上都得到 了应用( 武振华等，2 0 0 5 ) 。 1 2 3 多倍体的应用 与二倍体相比，多倍体植株一般具有器官的巨型性，如多倍体茎秆粗壮，叶 片变大，花、果实等体积增大( l i ue ta 1 ，2 0 0 7 ；a l l u me ta 1 ，2 0 0 7 ) 。在生理特性 9 盾叶薯蓣四倍体诱导及高温抗性研究 上，多倍体对病虫害和不良环境条件的抵抗力增强( s h a n ge ta 1 ，2 0 0 3 ；l i ue ta 1 ， 2 0 0 2 ) 。另外，许多多倍体植物形成的次生代谢产物含量增加( j e s u s g o n z a l e za n d w e a t h e r s ，2 0 0 3 ；k i me ta 1 ，2 0 0 4 ) ，有的还可能产生新的性状和化学成分，如福 录考四倍体中含有二倍体没有的酮类成分，菘蓝同源四倍体中游离氨基酸成分组 成与二倍体相比也不尽一致( 张旺凡和汪友蓉，2 0 0 6 ) 。 1 3 植物的高温抗性研究 1 3 1 高温对植物的伤害 1 3 1 1 高温对植物伤害的外在形态表现 当环境温度超过植物生长的最适温度范围，就会对植物造成伤害，使植株生 长发育受阻、植株矮小、生长势变弱，叶片提早衰老，新叶失水枯黄、出现水浸 状斑点、进而变黄，从而缩短植物生育期，缩短有效光合生产期，减少光合产物 的积累。如果温度继续上升，则会发生更直接的伤害，导致果实和枝干“日烧” 等甚至引起植物死亡。植物生长发育受温度影响最敏感的时期是幼苗期和开花结 实期( 潘瑞炽等，2 0 0 4 ) 。植物在幼苗期遭受高温胁迫时，很容易引起“烧苗” 或烂秧。盾叶薯蓣在育苗移栽过程中如遇到高温，会使其幼苗生长发育受阻，形 成僵苗或弱苗，严重时整株枯死( 张友德等，2 0 0 5 ) 。 1 3 1 2 高温对细胞膜系统的伤害 细胞结构特别是膜结构的稳定性与植物的耐热性有密切关系。细胞膜系统是 热损伤和抗热的中心，细胞膜的热稳定性反应了植物耐热能力的大小( 徐小万等， 2 0 0 8 ) 。高温条件下细胞膜蛋白变性，膜脂液相化，膜透性增大，导致电解质大 量外渗，从而表现出热损害( 黄希莲和宋丽莎，2 0 0 7 ) 。大量试验结果表明，品 种的耐热性越强，相对电导率越低。田学军等( 2 0 0 8 ) 在测定萝芙木叶片高温胁 迫后的外渗电导率时，发现电解质伤害性的渗透量随胁迫温度的增加而升高。王 凤兰等( 2 0 0 8 ) 对麝香百合的研究结果显示，随着温度的升高，麝香百合叶片细 胞膜热稳定性逐渐下降，且抗热性强的品系较抗热性弱的品系保持了更大的膜稳 定性。 高温对细胞膜的伤害还表现在膜脂过氧化上，膜脂过氧化指发生在细胞膜上 的不饱和脂肪酸双键上的一系列自由基反应。植物在高温、干旱等逆境条件下， 细胞膜内能积累大量的自由基，自由基能使膜内拟脂双分子层中的不饱和脂肪酸 1 0 华中农业人学2 0 0 9 届顾+ 学位论文 链氧化分解，从而造成膜结构破坏。膜脂过氧化的中间产物自由基和最终产物丙 二醛( m d a ) 都会对生物膜产生严重损伤，膜脂过氧化对生物膜的影响除了引 起膜中类脂的变化外，还会使膜蛋白质发生聚合和交联( 庞勇，2 0 0 4 ) 。许多研 究表明，在高温逆境条件下，m d a 含量增加。李衍素等( 2 0 0 7 ) 的研究表明， 在高温胁迫条件下，随高温处理时间的延长，豇豆幼苗叶片中m d a 含量明显增 加，并且耐热品种中m d a 的含量始终低于耐热性差的品种。叶儿等( 2 0 0 7 ) 对 两个耐热性不同的不结球白菜品种进行了高温处理，测定了高温胁迫对不结球白 菜叶片中m d a 含量的影响，结果表明，高温胁迫使两个不结球白菜品种叶片中 的m d a 含量均显著增加，都明显高于对照水平，且耐热性品种叶片中的m d a 含 量在处理过程中始终低于不耐热品种，这表明高温对耐热性品种的膜脂过氧化作 用较小。 1 3 1 2 高温胁迫与活性氧 正常情况下，细胞内活性氧( r o s ) ，如超氧阴离子( 0 2 - - ) 、羟自由基( o h ) 、 过氧化氢( h 2 0 2 ) 和单线态氧( 1 0 2 ) 等的产生和清除处于动念平衡状态，活性 氧水平很低，不会伤害细胞。另外，0 2 。和h 2 0 2 等活性氧是木质化过程所必须 的，它们还在防御反应中发挥信号功能( b u c h a n a ne ta 1 ，2 0 0 0 ) 。可是当植物受 到逆境胁迫时，活性氧产生和清除这个平衡就被打破。活性氧累积过多，就会伤 害细胞。活性氧伤害细胞的主要途径可能是逆境加速膜脂过氧化链式反应，活性 氧增多，而保护酶系统又被破坏，于是积累许多有害的过氧化产物，如m d a 等， 破坏膜结构、损伤大分子生命物质、引起一系列生理生化紊乱，导致植物死亡( 潘 瑞炽等，2 0 0 4 ) 。 1 3 2 植物对高温胁迫的响应 1 3 2 1 高温胁迫与抗氧化系统 植物细胞在逆境胁迫下通过多种途径产生r o s ，它们有很强的氧化能力， 对许多功能大分子具有破坏作用。植物体中也有相应的防卸系统，降低或消除活 性氧对膜脂的攻击能力以及对其它大分子生命物质的伤害。r o s 的清除机制主 要有抗氧化酶系统和非酶活系统。 抗氧化酶系统包括s o d 、p o d 、c a t 、a p x 和g r 等，它们能有效清除植物体 内的活性氧，使植物免受活性氧的伤害。所以植物体内保护酶活性高低是衡黾植 盾叶薯蓣网倍体诱导及高温抗性研究 物抗逆性的重要指标。s o d 的作用主要是清除0 2 ，它可以把0 2 。转化为h 2 0 2 和 0 2 。p o d 和c a t 可以清除h 2 0 2 ，并把它转化为h 2 0 。a p x 和g r 是a s a g s h 循环 中重要的保护酶，它们与抗氧化物质协同作用能清除植物体内的h 2 0 2 。 百合和不结球白菜等植物受高温胁迫后s o d 活性的变化趋势在不同的试验 中有着不同的研究结果，且同种植物对高温耐受性不同的品种其s o d 活性的变化 也不同。把百合幼苗置于短暂高温下，耐热性品种中s o d 活性随温度梯度的增 加呈上升趋势，不耐热品种中s o d 活性在温度较低时呈上升趋势，然后开始下降 ( 尹慧等，2 0 0 7 ) 。叶凡等( 2 0 0 7 ) 的研究结果表明，高温胁迫后，随高温处理 时间的延长，耐热性不结球白菜幼苗叶片中的s o d 活性变化表现出先上升后下降 再上升的趋势，而不耐热品种中的s o d 活性变化趋势为先下降后上升再下降，说 明耐热品种在热胁迫条件下能很好的平衡细胞内自由基的产生和清除，使s o d 活性始终保持在一个相对稳定的范围内。与s o d 类似，p o d 、c a t 、a p x 和g r 等抗氧化酶对高温的响应也表现出复杂的结果。 非酶活系统，包括a s a 、g s h 、维生素e 和类胡萝b 素等，它们都具有清除 活性氧的功能，共同维持着细胞内活性氧产生和清除代谢的平衡。在脂类过氧化 过程中起连锁反应关键作用的脂质过氧化物自由基( r o o ) 在遇到维生素e 时， 可以被转变为稳定的脂质过氧化物( r o o h ) ，从而终止脂类过氧化。类胡萝b 素能通过电子转移等途径清除活性氧( 赵文恩等，1 9 9 9 ) 。a s a 和g s h 可以通过 a s a g s h 循环以清除活性氧，并把它们转化为无毒物质，图1 为a s a g s h 循环 清除r o s 的机制。 在对百合的研究中发现，高温胁迫后，随高温处理时间的延长，a s a 和g s h 含量表现出先上升后下降的趋势，且温度越高，a s a 和g s h 含量维持在较高水 平的时间越短，说明百合对短暂高温具有一定的耐受性，随温度梯度的增加及高 温处理时间的延长，百合表现出明显的伤害性状( y i ne ta 1 ，2 0 0 8 ) 。m a 等( 2 0 0 8 ) 的研究结果表明，高温胁迫下，苹果叶片中的a s a 和g s h 含量为也表现出先升 高后下降的趋势。因此，a s a 和g s h 可以作为植物抗逆性的重要指标。可以推 断，抗高温胁迫强的植物相对抗逆弱的植物在逆境胁迫下a s a 和g s h 含景要高。 1 2 华中农业大学2 0 0 9 届硕十学位论文 oj h 2dh 图1 除去h 2 0 2 的a s a g s h 循环 删 f i g u r e1r e m o v eo fh 2 0 2i na s a g s hp a t h w a y ( 引自：潘瑞炽，2 0 0 4 其中d h a r 为脱氢抗坏血酸还原酶) 1 3 2 2 高温胁迫与热激蛋白 在高于生物正常生长温度8o c , - - 一1 2o c 的条件下，生物体内能合成一些新的 蛋白质称为热激蛋白( h s p ) ，其相当一部分属于监护蛋白，主要参与生物体内 新生肤的运输、折叠、组装、定位以及变性蛋白的复性和降解等过程。有研究表 明，高温热激下产生的h s p 可以提高植物的抗热性。热锻炼过程中有大量h s p 的表达，大量的h