（食品科学专业论文）草鱼鱼鳞胶原蛋白的提取及特性研究.pdf

草鱼鱼鳞胶原蛋白的提取及其特性研究 摘要 本文以草鱼( g r a s sc a r p ，c t e n o p h a r y n g o d o ni d e l l u s ) 鱼鳞为研究对象，采用先提取 胶原蛋白，再使用水从萃余相中提取鱼鳞胶，最后酶解鱼鳞残渣的工艺。旨在为充分利 用鱼鳞中胶原蛋白，提供一条有效的思路。并为鱼鳞的合理利用，提供了必要的科学依 据。研究结果如下： 1 采用酸性和酶提取法从草鱼鱼鳞中提取酸溶性胶原蛋白( a c i d s o l u b l ec o l l a g e n ， a s c ) 和酶促溶性胶原蛋白( p e p s i n s o l u b i l i z e dc o l l a g e n ，p s c ) 。经s d s p a g e 电泳及 红外光谱分析显示，所提取的胶原蛋白电泳区带及红外图谱与i 型胶原蛋白标准品十分 相似。氨基酸组成分析表明，a s c 和p s c 是典型的胶原蛋白。经u v 扫描分析，a s c 和p s c 在2 3 3 n m 处均有强烈吸收。热稳定性测定p s c 的热变性温度为2 5 7 。差示扫 描量热测定a s c 和p s c 的热收缩温度分别为9 9 6 和8 1 7 。 2 提取胶原蛋白后，再用热水从萃余相中提取鱼鳞胶。采用正交试验优化了提取工 艺，其工艺参数为：提取温度9 0 。c ，提取时间3 h ，料液比l ：1 0 0 ，提取率最高。得到的 鱼鳞胶样品，对其部分功能特性进行了测定，结果表明鱼鳞胶具有良好的吸水性、保水 性、乳化能力、起泡能力等功能特性。另外对其流变学行为进行了初步研究，结果表明： 鱼鳞胶的黏度与温度成反比，与鱼鳞胶浓度成正比；加入钙盐后，0 5 c a c l 2 使鱼鳞胶 黏度增至最大；p h 值对黏度的影响相对复杂，酸性条件下，黏度变化不大，而p h = 7 时黏度最大，碱性时黏度又有所降低。通过对不同浓度鱼鳞胶溶液的质构( t p a ，t e x t u r e p r o f i l ea n a l y s i s ) 分析，表明高温或者低浓度下，鱼鳞胶的凝胶性能不好。 添加不同比例鱼鳞胶到鲢鱼鱼糜制品中，观察其对鱼糜凝胶特性的影响。结果显示： 鱼糜中添加不同浓度的鱼鳞胶，均可使鱼糜凝胶的失水率显著降低( p o 0 5 ) ，失水率 随添加量的增加而减少。另外，鱼鳞胶的添加使鱼糜凝胶的白度显著增加( p 1 0 碱性溶液预处理鱼鳞后，于8 0 0 c 煅烧1 h ，可以得到较纯h a p ；而在酸性溶液预处理得 l o 草鱼鱼鳞胶原蛋白的提取及其特性研究 到的产物组成非常复杂。杜海燕等人( 2 0 0 1 ) 通过对鲢鱼鱼鳞进行水煮和煅烧处理，可 以很容易地得到单分散的亚微米p t c p 和h a p 共存的粉体。因此，鱼鳞是制各单分散 亚微米级h a p 粉体的很好原料。 1 4 3 2 羟基磷灰石的利用 1 ) 羟基磷灰石对重金属的吸附作用 羟基磷灰石晶格中的c a 2 + 对p b 2 + 、c d 2 + 、c u z + 等重金属离子具有很好的选择吸附性， 在常温下，就快速发生置换反应。因而，由鱼鳞制备廉价的羟基磷灰石产品用于废水的 处理是有前途的。 2 ) 羟基磷灰石在其他方面的应用 利用水产羟基磷灰石的安全性比较高的特点，也可以用在牙齿修复、美容、骨科、 医药化工等多个行业，日本由鳕鱼制各的磷灰石价格为5 万日元k g ，是鳕鱼鱼粉价格的 几倍。 1 4 4 鱼鳞在其它方面的应用 ps t e p n o w s k i ( 2 0 0 4 ) 将鱼鳞制成天然吸附剂，取得良好效果。鱼鳞吸附废水中的 类胡萝h 素( a s t a x a n t l l i n ) ，最大吸附量可达3 6 0m g k g d ( 湿重) 。c h a k r a b a r t y ( 1 9 7 9 ) 通过水解皮革废料及鱼鳞，得到的水解产物具有较强的去污能力，可用于制作去污荆材 料。 鱼鳞中的蛋白质经蛋白酶水解，制得的酶解液可用于调味品的生产和功能性食品添 加剂。加入不同类型的蛋白酶将鱼鳞中的胶原蛋白大分子进行水解，得到聚合度较小的 多肽类和游离的氨基酸，首先一些游离氨基酸和短肽本身具有呈味作用，水解液可以作 为调味料的原料。另外在水解过程中还会产生具有特定功能的功能肽，已经有实验证明， 鱼鳞蛋白水解液具有抗氧化和降低血压、降低血液总胆固醇、抗衰老等功效。刘庆慧 ( 2 0 0 1 ) 研究发现鱼鳞可有效防止大鼠实验性高胆固醇血症，并可降低进食高胆固醇饲 料大鼠血清中总胆固醇( t c ) 和甘油三酸酯( 1 g ) 含量，另外鱼鳞提取物对成年大鼠 血清、肝脏丙二醛( m d a ) 含量和超氧化物歧化酶( s o d ) 活力的影响，说明鱼鳞提取物具 有延缓衰老的作用。这与m o r i m u r a s ( 2 0 0 2 ) 研究结果相一致。 另外，有人提出从鱼鳞中提取鱼银( 张俊杰，2 0 0 4 ) 。鱼银是从鳞中提取的一种价 格昂贵的特殊工业用品，外观呈纯银白色，具有高度光泽，除用作药物原料和生化剂外， 特别在珍珠装饰业和油漆制造业中具有广泛的用途。但这方面的报道并不多见，具体的 提取应用情况，有待迸一步研究查证。 华中农业大学2 0 0 5 届硕士研究生毕业论文 1 5 本研究的目的及意义 目前，传统的鱼加工业已不能实现鱼类资源的充分利用，大量的鱼副产物被抛弃或 作为粗饲料。鱼经屠宰、采肉后，出肉率仅为3 0 左右，而有6 0 以上为下脚料，如 果废弃掉这部分下脚料将是很大的浪费。目前对鱼鳞这一重要的鱼副产物的利用也 还只是处于初级阶段，因此，必须开展低值淡水鱼的深加工的研究，为提高其利用价值 和经济价值寻找新的途径。 为充分利用我国现有的丰富的淡水鱼资源，提高其商业价值，降低水产品食品的生 产成本，最大限度地提高经济效益，本研究以草鱼这种低价值的淡水鱼的鱼鳞为对象， 为淡水鱼鱼鳞的充分利用提供了一种可行的思路。本文以图l 给出过程提取鱼鳞中胶原 蛋白，并围绕其开展研究工作： ( 1 ) 从草鱼鱼鳞中提取a s c 和p s c ，并研究了它们的部分特性： ( 2 ) 利用热水从剩下的鱼鳞残渣提取鱼鳞胶，研究它的部分功能特性，并将它应 用于鱼糜制品，观察其效果； ( 3 ) 利用酶水解二次得到的鱼鳞残渣，优化了酶解工艺。 鱼鳞一簿籍一去灰处理一区至亟亘卜 一次得鱼鳞残渣- 至垂夏至三斗二次得残渣 至垂匿曼三豳 图1 从鱼鳞中提取蛋白及用酶水解提取多肽流程 f i g 1 f l o wd i a g r a mo ft o t a lp r o c e d u r ef o re x t r a c t i o no fp r o t e i na n dp r o d u c t i o no f p e p t i d e sb ye n z y m i ch y d r o l y s i sf r o mf i s hs c a l e 草鱼鱼鳞胶原蛋白的提取及其特性研究 2 材料与方法 2 1 试验材料 2 1 1 试验材料 草鱼鱼鳞：自武汉梅家山水产品市场获得 2 1 2 化学试剂 1 3 9 8 中性蛋白酶：无锡新达生物工程有限公司 f l a v o r z y m e ：诺维信天津公司 a l c a l a s e ：诺维信天津公司 p r o t a m e x ：诺维信天津公司 胃蛋白酶：s i g m a 木瓜蛋白酶：广西南宁庞博生物工程有限公司 甲醛：分析纯，武汉亚泰化工试剂有限公司 硼酸：分析纯，武汉市中南化学试剂厂 氢氧化钠：分析纯，武汉连碱厂 硫酸铜：分析纯，西安化学试剂厂 硫酸钾：分析纯，西安化学试剂厂 i 型胶原蛋白( f r o mb o v i n e a c h i l l e s t e n d o n ) ：s i g m a s d s p a g e 次高分子量标准蛋白质：上海生命科学研究院 丙烯酰胺：分析纯，天津化学试剂三厂 n ，n - 亚甲基双丙烯酰胺：化学纯，上海化学试剂采购供应站 考马斯亮兰r 2 5 0 ：m m l t e s c o 分装 十二烷基磺酸钠( s d s ) ：化学纯，湘中地质实验研究所 三( 羟甲基) 胺基甲烷( t r i s ) ：生化试剂，国药集团化学试剂有限公司 过硫酸铵( a p ) ：分析纯，天津博迪化工有限公司 四甲基乙二胺( t e m e d ) 分析纯，上海水源生物科技有限公司 6 - 巯基乙醇：化学纯，上海化学试剂总厂 溴酚蓝：北京化学试剂公司 石油醚：分析纯，天津化学试剂有限公司 羟脯氨酸标准品：中国科学院上海生物化学研究所 对- 二甲氨基苯甲醛( p d a b ) ：分析纯，浙江三门开源科技实验厂 华中农业大学2 0 0 5 届硕士研究生毕业论文 高氯酸：分析纯，天津东方化工厂 氯氢t ：分析纯，天津福晨化学试剂厂 冰乙酸：分析纯，上海化学试剂有限公司 甲醇：分析纯，武汉中南化学试剂厂 氯化钠：分析纯，天津福晨化学试剂厂 盐酸：化学纯，武汉中南化学试剂厂 2 2 主要仪器 可见分光光度计：7 2 2 s 型，上海精密科学仪器有限公司 p h 计：8 1 8 型，o r i n or e s e a r c hi n c 电子分析天平：s a r t o r i u si n s t r u m e n t sl t d ，g e r m a n y 电子天平：北京赛多利斯天平有限公司 微量凯氏定氮仪：湖北恒康化玻璃仪器公司 数显恒温水浴锅：h h 一6 型，常州国华电器有限公司 真空冷冻干燥机：a l p h a i 一5 ，g e r m a n y 恒温磁力搅拌器：h j 3 型，江苏金坛国华仪器厂 紫外可见光谱仪：u v - 2 6 5 f w 型，s h i m a d z uc o r p ，j a p a n f t 红外分光光谱仪：n e x u s4 7 0 型，n i c o l e ti n s t r u m e n tc o r p 旋转黏度计：r o t o v i s c or v1 2 ，h a a k e w s c s 测色色差仪：上海物理光学仪器厂 差示扫描量热计：d s c2 0 4f 1 ，n e t z s c h 电泳仪：d y y _ i i i 型，北京六一仪器厂 凝胶成像系统：g e ll o g i c2 0 0i m a g i n gs y s t e m ，e a s t m a nk o d a kc o m p a n y 质构仪：x t p l u st e x t u r ea n a l y s e r ，s t a b l em i c r os y s t e m sl t d 马富炉：上海思尔达科学仪器有限公司 组织搅碎匀浆机：j j 2 型，常州德华电器有限公司 离心机：t g l 1 6 g a ，湖南星科科学仪器有限公司 2 3 试验方法 2 3 1 草鱼鱼鳞组成分析方法 2 3 1 1 分析前处理 新鲜的草鱼鱼鳞，自来水洗3 次，剔除混入的其它杂质。而后将鱼鳞置于阴凉处自 草鱼鱼磷胶原蛋白的提取及其特性研究 然风干，装袋阴暗处储藏备用。 2 3 1 2 水分测定 1 0 5 c 干燥至恒重法( 无锡轻工业学院，1 9 9 4 ) 2 3 1 3 粗蛋白质含量测定 微量凯氏定氮法( 无锡轻工业学院，1 9 9 4 ) 2 3 1 4 粗灰分测定 马福炉挥发恒重法( 无锡轻工业学院，1 9 9 4 ) 2 3 1 5 粗脂肪测定 索氏抽提法( 无锡轻工业学院，1 9 9 4 ) 2 3 2 胶原蛋白的提取及部分特性试验研究 2 3 2 1 鱼鳞胶原蛋白的提取( 永井裕，1 9 9 2 ：t o s h i y u k i ，2 0 0 3 b ；刘庆慧，2 0 0 0 ) ( 1 ) 鱼鳞前处理：将鱼鳞浸于1 h c l 溶液中，不停搅拌，浸泡2 4 h ，期间换酸液 一次。浸泡后的鱼鳞用自来水和蒸馏水反复冲洗，而后沥干备用。 ( 2 ) 胶原蛋白的提取：取经前处理的鱼鳞，按料液比1 ：2 5 比例加入o 5 m o l l 醋酸， 用组织搅碎匀浆机高速搅打5 m i n ，而后于4 c 下提取2 4 h ，2 层纱布过滤，滤液以 8 0 0 0 r r a i n 离心2 0 m i n ，残渣再提取1 次，合并上清液。得酸溶性胶原蛋白( a s c ) 粗制 液。离心得沉淀置于o 5 t o o l 1 醋酸中，加入胃蛋白酶( 0 5 ) ，4 c 下，不时搅拌，提取 2 4 hr 2 层纱布过滤，滤液以8 0 0 0 r m i n 离心2 0 r n i n ，残渣再用酶提取1 次，合并上清夜， 得胃蛋白酶促溶性胶原蛋白( p s c ) 粗制液。剩余不溶物为不溶性胶原蛋白( i n s o l u b l e c o l l a g e n ) 。 ( 3 ) 胶原蛋白的提纯；向a s c 和p s c 粗制液中加入n a c ! 固体，边加边搅拌，使 n a c i 浓度到0 7 m o l h ，混和液静置4 h 使胶原蛋白充分沉淀，以8 0 0 0 r r a i n 离心2 0 r a i n ， 得沉淀用0 5 m o l l 醋酸重新溶解。重复盐析离心一次，得沉淀用o 5 m o l 1 醋酸溶解，注 入透析袋，先用自来水流水透析2 4 h ，再用0 1 m o l 1 醋酸透析2 4 h ，中间更换透析外液 一次。透析好后冷冻干燥得a s c 和p s c 样品。 2 3 2 2 胶原蛋白部分特性试验研究 2 3 2 2 1u v 扫描分析 华中农业大学2 0 0 5 届硕士研究生毕业论文 室温条件下，用o 5 m o l o 醋酸作溶剂，将a s c 和p s c 分别配成1 0 m g m l 溶液。样 品于紫外一可见光全程扫描仪上进行7 0 0 19 0 r i m 全程扫描。 2 3 2 2 2 红外光谱分析 取微量a s c 和p s c 样品，经k b r 压片，全反射光谱测定法( a t r ) 进行测定。光 谱测定范围为4 0 0 0 c m q - 4 0 0 c m l ，仪器分辨率为0 5 c m ，扫描次数为3 2 次。 2 3 2 2 - 3 十二烷基磺酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳( s d s p a g e ) s d s p a g e 法( 张龙翔，1 9 9 7 ) 。分离胶浓度7 5 ，浓缩胶浓度3 5 。取a s c 和 p s c 各l m g ，用样品处理液配成l m g m l 溶液。电泳上样2 0 u l ，直流稳压电源，浓缩胶 8 0 v ，分离胶1 2 0 v 。电泳5 6 h 。电泳结束后，凝胶用考马斯亮兰r 一2 5 0 染色，而后用7 5 醋酸、5 ，o 甲醇溶液脱色。使用凝胶成像系统分析各条带的分子量。 2 3 2 2 4 差示扫描置热法测试热收缩温度( s h r i n k a g et e m p e r a t u r e ，t s ) 仪器采用金属铟进行校正( 铟的熔融焓h 为2 8 4 5 1 j g ，熔点为1 5 6 4 ) 。精确称取 定量( 3 5 m g ) 样品于d s c 铝坩埚中，坩埚加盖密封后，以空坩埚作为参比，从5 。c 自n 热至1 2 0 ，升温速率1 0 k m i n 。样品室氮气流量2 0 m l m i n ，保护气6 0 m l m i n 。 2 3 2 2 5 变性温度( t d ) 测定 变性温度( t d ) 的测定方法参照文献( n a g a i ，y a m a s h i t ae ta 1 ，2 0 0 1 ；1 9 9 9 ) 。用 o 2 t o o l 1 醋酸作溶剂，将胶原蛋白配成o 3 m g m l 溶液。使用r o t o v i s c or v l 2 旋转黏度计， 选用s e n s o rs y s t e mn v ，上样1 0 m l ，剪切速率为6 9 2 5 s 。测定温度为1 5 5 0 c ( 间隔5 c ) ， 每个温度点保温3 0 r a i n 。当黏度变化5 0 时所对应的温度即为t d 。 2 3 2 2 6 胶原蛋白氨基酸组成分析 ( 1 ) 样品水解 取蛋白样品1 0 2 0 m g ，加入6 m o l lh c l 真空充氮后，封管，1 1 0 士1 烘箱水解2 4 h ， 定容，过滤备用。 ( 2 ) 干燥衍生 取滤液真空干燥后，加入a c c q t a g 衍生试剂反应，上机分析。 ( 3 ) 色谱条件 分离系统：w a t e r s5 1 0 - 7 1 7 2 4 8 7 分离柱：a c c q - t a g t m 专用氨基酸柱，3 9 x 1 5 0 m m 流动相a ：p h 4 9 5 醋酸钠缓冲液 流体相b ：6 0 乙腈水溶液 苎鱼鱼壁鉴壁篓自盟塑壁垒墨堑丝型塑一 紫外检测波长：2 4 8 n m 紫外检测柱温：3 7 紫外检测进样量：1 0 m 紫外检测流速：1 0 m v m i n t ：a s c 和p s c 氨基酸组成送于中国农业科学院油料作物研究所测试中心检测。羟 脯氨酸：氯氨t 法( 冯志民，1 9 9 9 ；修海霞，2 0 0 3 ) 。 2 3 3 水提取鱼鳞胶及其应用研究 一般来说，含胶原组织经酸性及酶提取反复抽提2 3 次后的残渣，即为不溶性胶原。 但此“不溶性”的定义仍是相对的，仅表示胶原蛋白“尚不溶解”之意( 永井裕，1 9 9 2 ) 。 因而鱼鳞经提取完胶原后，还有很多胶原蛋白以不溶物的形式存在，故下面考虑用水提 取鱼鳞中剩余的蛋白。 2 3 3 1 鱼鳞胶的提取 将提取过a s c 和p s c 的鱼鳞残渣冷冻干燥，粉碎，作为研究水提取鱼鳞胶得率的 原料。 2 3 3 1 1 水提取鱼鳞胶提取率的计算 + 。，。，、蛋白溶于水中的质量 提取率( ) = 皇旦荣寿薷盖警坚 2 3 3 1 2 水提取鱼鳞胶条件的初步确定 ( 1 ) 提取温度的确定：提取温度分别为3 0 c 、4 5 c 、6 0 c 、7 5 。c 、9 0 ，料液比 为1 ：2 0 0 ，提取l h 。以提取率为指标，确定适宜的提取温度。 ( 2 ) 提取时间的确定：提取时间分别为1 h 、2 h 、3 h 、4 h 、5 h 、6 h ，料液比1 ：2 0 0 ， 提取温度为上步确定适宜的提取温度。以提取率为指标，确定适宜的提取时间。 ( 3 ) 料液比的确定：料液比为1 ：5 0 、1 ：1 0 0 、l ：2 0 0 、1 ：3 0 0 、1 ：4 0 0 ，提取时间和温 度为前步中确定的适宜的时间和温度。以提取率为指标，确定适宜的料液比。 2 3 3 1 3 水提取鱼鳞胶条件的优化 依据单因素试验初步确定的酶解条件，选择提取温度( a ) 、提取时间( b ) 、料液 比( c ) 作为试验因子，以提取率为指标，采用l 9 ( 3 3 ) 正交试验设计，对水提取鱼鳞 胶的提取条件进行优化。得出最佳提取工艺。 提取鱼鳞胶样品步骤：热水浸提鱼鳞残渣，提取完毕，经二层纱布过滤，滤液趁热 以8 0 0 0 r m i n 离心1 0 m m ，分离取上清液冷冻干燥，得鱼鳞胶样品。 华中农业犬学2 0 0 5 届硕士研究生毕业论文 2 3 3 2 鱼鳞胶的部分功能特性研究 2 3 3 2 1 吸水性测定( 王碧，2 0 0 2 ) 准确称取1 0 0 0 0 9 鱼鳞胶样品及对照明胶，均匀平铺于预先称重的培养皿中，置于 恒温恒湿生化培养箱中，每隔6 h 测定一次培养皿的质量m i ，至培养皿质量不再增加时 停止测定，此时培养皿的质量为m z ，则：吸水性( g ) = ( m l m 2 ) 1 0 0 0 0 。 2 3 3 2 2 保水性测定( 贾冬英，2 0 0 2 ) 准确量取l m l 0 5 鱼鳞胶溶液，将其平铺于培养皿中，置于恒温恒湿的培养箱中， 每隔1 0 m i n 测次样液的水分残存率。同时用o 5 明胶和o 5 丙三醇做对比试验。 2 3 3 2 3 乳化能力 浊度法( 江志炜，2 0 0 3 ) 。取0 5 的鱼鳞胶溶液6 0 m l ，边搅拌边加入纯大豆色拉 油2 0 m l ，然后以1 0 0 0 0 r m i n 高速匀浆2 m i n 制成乳状液。用微量注射器从底部抽取乳状 液5 0 9 l ，注入一试管中。然后加入2 5 m i 0 1 的十二烷基磺酸钠( s d s ) 溶液制成混合 液。在5 0 0 n m 的波长下测定吸光值。 乳化活力指数尉，：一2 x ( 2 3 _ 0 3 _ e ) x 一1 0 - 4 。稀释倍数 口l 。c 式中：e a i - - 每克蛋白质的乳化面积( m 2 g p r o ) ： q 一油相所占的分数，本方法中油相占l 3 ； c 一蛋白的浓度，0 5 ； l 一比色池的厚度，1 0 m m ； 一在5 0 0 r i m 下测得吸光值。 2 3 3 2 4 起泡能力与泡沫稳定性 取1 鱼鳞胶溶液1 0 0 m l ，然后在1 0 0 0 0 r r a i n 的高速均质机中均质2 r a i n ，记录均质 停止时泡沫的体积。同时用明胶做对照试验，起泡性计算如下： 起泡性( ) ：望堕堡些堕塑鎏塑堡墼! 里! ! 。l o o 1 0 0 m l 记录均质停止1 0 、3 0 、6 0 、9 0 r a i n 后泡沫体积，用来衡量泡沫稳定性，计算同上。 2 3 3 2 5 黏度特性的研究 使用r o t o v i s c or v l 2 旋转黏度计，选用s e n s o rs y s t e mn v ，测定鱼鳞胶在不同条件 下的黏度，观察其变化规律。 草鱼鱼鳞胶原蛋白的提取及其特性研究 ( 1 ) 温度的影响：配制1 0 和4 o 鱼鳞胶溶液，在6 9 2 ，5 s 1 剪切速率下，测定 2 0 6 0 每隔l o 下鱼鳞胶溶液的黏度。 ( 2 ) 质量分数的影响：精确配制不同质量分数( 0 2 5 ，0 5 ，1 o ，2 0 ，4 0 ) 的鱼鳞胶蛋白液，在6 9 2 5 s 1 剪切速率，3 0 。c 下测定其黏度。 ( 3 ) p h 的影响：将l 鱼鳞胶溶液分别用浓度为o 1 m o l l h c l 和0 i m o v l n a o h 调 整口h 值至3 1 2 ，然后在2 0 。c ，剪切速率为6 9 2 5 s 1 下，测定不同p h 值下液体的黏度。 ( 4 ) c a c