（发酵工程专业论文）新型抗真菌抗生素发酵工艺的优化及其产物提取分离的初步研究.pdf

新型抗真菌抗生素产生菌发酵工艺的优化 及其产物提取分离的初步研究 摘要 本文中涉及的抗生素是一种新型抗真菌抗生素，由链霉菌f u 产 生，对引起深部真菌感染的念珠茵等具有比较好的抗菌作用。 本文采用自然选育的方法将实验室保藏的菌种进行复壮纯化处 理，得到一株生产水平稳定的菌种，该菌种的产抗水平较原始出发菌 种提高了1 8 2 。对菌种的生长过程观察发现，菌种产孢子的时间在 培养5 天后达到高峰，6 天后完全成熟。抗生素抽提实验说明，该菌 种所产抗生素主要是在发酵液中。 本文重点对菌种的发酵工艺条件进行了优化，通过单因素和均匀 设计法得到了比较理想的优化结果。优化后的培养条件是：初始p h 6 5 、培养温度3 0 、接种量1 0 、摇瓶装液量4 0 m l 2 5 0 m l 、种龄2 4 小时、培养时间7 2 小时。优化后的发酵培养基组分是：可溶性淀粉 7 、酵母粉o 2 、黄豆粉o 5 、n a c l 0 1 5 、m g s 0 4 0 0 3 、 k 2 h p o 。0 0 4 。3 l 发酵罐的发酵动力学规律表明，菌体浓度在罐培 养至4 0 h 左右达到最大；产抗水平在4 8 h 左右达到最大。 本文对抗生素可能存在的理化性质作了简单的探讨，结果表明该 抗生素具有较高的热稳定性，在酸、中性环境下比较稳定，碱性环境 下不稳定。纸层析和纸电泳结果表明，该抗生素可能是一种酸性水溶 性抗生素。紫外扫描发现该抗生素在2 8 0 n m 处有最大吸收峰。抑菌 实验表明该抗生素对白念珠菌具有很强的抑菌力。 本文采用现代分离技术将抗生素从发酵液中初步提取分离出来。 发酵液中的高价金属离子采用沉淀法除去，杂蛋白采用热和酸相结合 的方法处理。发酵液经超滤处理后，进一步除去了其中的大分子物质， 溶液颜色变浅，抗生素抑茵活性下降不大。离子交换树脂采用d o w e x 5 0 wx 1 6 ( h 型1 0 0 2 0 0 目) ，分离效果较好。s p 2 0 7 大孔吸附树脂 在分离方面的效果远比活性炭来的好，但是抗生素活性损失较大。减 压浓缩、冷冻干燥后得到的粗制品为淡黄粉末状物质，可作进一步精 制时使用。 关键词抗真菌抗生素，链霉菌f u ，自然选育，发酵，优化，分离 s t u d so nf e r a 伍n t a t i o nc o n d i o n o p r 】z a h o n0 ft h ep r o d u c i n gs t rad t o fan o v e la n r 】f u n g a i an b 1 0 t i c a n d ss e f a ra l t i o n a b s t r a c t t h ea n t i b i o t i ci n v o l v e di nt h i s p a p e rw a san o v e la n t i f u n g a l a n t i b i o t i c , p r o d u c e db ys t r e p t o m y c e sf u i tc o u l d i n h i b i t f u n g u s e f f e c t i v e l yw h i c hc a u s e ds y s t e m i cf t m g a li n f e c t i o n t h es t r a i ns t r o r e di no u rl a bw a sr e j u v e n a t e da n dp u r i f i c a t e db yn a t u r a l s c r e e n i n g ，t h ep r o d u c t i o no ft h ea n t i b i o t i cw a ss t a b l ea n di n c r e a s e db y 18 2 t h es t r a i np r o d u c e dt h em o s ts p o r e so nt h ef i f t hd a y , a n do n ed a y l a t e r , t h es p o r e sb e c a m em a t u r e t h ee x p e r i m e n t so fe x t r a c t i o ns h o w e d t h ea n t i b i o t i cw a s m a i n l yi nt h eb r o t h t h ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sw e r e o p t i m i z e db ys i n g l e f a c t o r e x p e r i m e n t a n du n i f o r m d e s i g ne x p e r i m e n t t h eo p t i m u mc u l t u r e c o n d i t i o n sw e r ea sf o l l o w s ：i n i t i a lp h6 5 ，3 0 。c ，i n o c u l u mp e r c e n t a g e 1 0 ，m e d i u ml o a d a g e4 0 m l 2 5 0 m l ，s e e dc u l t u r et i m e2 4h ，f e r m e n t a t i o n l i i t i m e7 2 h t h eo p t i m u mf e r m e n t a t i o nm e d i u mw e r e c o m p o s e d a s f o u o w s ( ) ：s o l u b l es t a r c h7 ，y e a s tp o w d e r0 2 ，s o y b e a nm e a l0 5 ，n a c l 0 1 5 ，m g s 0 4 0 0 3 ，k 2 i - i p 0 4 0 0 4 i na3 l b i o r e a c t o r , t h eb i o m a s sr e a c h e d t h eh i g h e s ti n4 0h o u r so ff e r m e n t a t i o n ，t h ea n t i b i o t i cp r o d u c t i v i t yw a s t h eh i g h e s ti n4 8h o u r s t h ep h y s i c a la n dc h e m i c a lp r o p e r t i e so ft h ea n t i b i o t i cw e r es t u d i e d t h er e s u l t ss h o w e dt h ea n t i b i o t i cw a ss t a b l ei nh o ta n da c i dc o n d i t i o n s ， b u tn o ti na na l k a l i n eo n e t h ee x p e r i m e n t so fp a p e rc h r o m a t o g r a p h ya n d p a p e re l e c t r o p h o r e s i s s h o w e dt h ea n t i b i o t i c m i g h t b ea c i da n d w a t e r - s o l u b l e b yu vs c a n n i n g ，i t sb i g g e s ta b s o r p t i o np e a kw a so b s e r v e d a t2 8 0 n m e x p e r i m e n t ss h o w e dt h a tt h ea n t i b i o t i cc o u l de f f e c t i v e l yi n h i b i t i nt h i sp a p e r , t h ea n t i b i o t i cw a ss e p a r a t e d c a 2 + ，m 9 2 + ，f e 3 + w e r e r e m o v e db yp r e c i p i t a t i o n ，p r o t e i n sw e r er e m o v e db yc a l e f a c t i o na n d a c i d i t y a f t e ri l l 删t m 蛀o t h eb r o t hh a dl e s sm a c r o m o l e c u l a rs u b s t a n c e s a n du g h t e rc o l o u r , t h ea n t i f u g a la c t i v i t i t yd i d n td e c l i n e l a r g e l y t h e a n t i b i o t i cw a st h e ns e p a r a t e db yd o w e x5 0 wx 一1 6c a t i o ne x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y w i t hr e g a r dt os e p a r a t i o n ，s p 2 0 7m a c r o p o r ea b s o r p t i o n r e s i nw a sb e a e rt h a na c t i v ec a r b o n ，h o w e v e r , t h el o s so fa n t i b i o t i cw a s l a r g e f i n a l l y , t h el i g h ty e l l o wp o w d e rw a so b t a i n e da f t e rc o n c e n t r a t i o n a n df r e e z i n gd r y , i tw o u l db eu s e df o rf l l r t h e rr e f i n e m e n t k e yw o r d ：a n t i f u n g a la n t i b i o t i c ，s t r e p t o m y c e sf u ，n a t u r a ls c r e e n i n g 。 f e r m e n t a t i o n ，o p t i m i z a t i o n ，s e p a r a t i o n v 浙江工业大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行 研究工作所取得的研究成果。除文中已经加以标注引用的内容外，本论文 不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得浙江 工业大学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作出 重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人承担本声明的 法律责任。 作者签名： 井出互- 日期：p 水牛月刁日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意 学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文 被查阅和借阅。本人授权浙江工业大学可以将本学位论文的全部或部分内 容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存 和汇编本学位论文。 本学位论文属于 1 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密囱。 ( 请在以上相应方框内打“、”) 日期：烈年q 月刁日 日期：。l 啤l f 月叼日 浙江工业大学研究生学位论文 1 1 立题背景及研究意义 第一章文献综述 生长在我们周围的大多数真菌都是无害的。常见的病原真菌主要是导致手 足头癣等浅部真菌病的真菌，这些真菌病虽然顽固但不致命。随着现代医疗水平 的提高，癌症、艾滋病、器官移植等病人的存活率大大上升，但是这些病人由于 经常使用大剂量抗生素、抗肿瘤药物、激素、免疫抑制剂等药物以及使用放射和 化疗，病人的免疫力下降，极易被本来不显病原性的条件致病真菌侵入造成深部 真菌病，这种病往往是致命的。深部真菌感染( s y s t e m i ef t m g a li n f e c t i o n ) 正越 来越严重地威胁到患者的健康和生命。据近几年来的数据调查，真菌感染的发生 率呈逐年上升趋势【1 - 2 1 。深部真菌病的病原菌主要为念珠菌属，其次为酵母菌属、 曲菌属、霉菌属等嘲。 近几年来，微生物来源的抗真菌抗生素得到了飞速发展。尽管通过化学合成 的方法获得了大量临床有效的抗真菌药物，但是，从微生物次级代谢产物中发现 新型抗真菌抗生素，一直是人们关心并取得显著成果的另一条有效的途径。然而， 我国的药物开发工作远远落后于发达国家，无论是在生产还是研发方面，目前国 内生产的大多数产品都是仿制国外产品，在如今全球化的市场背景下，积极开发 拥有自己独立知识产权的新产品，迎接世界市场的挑战成为当务之急。 1 2 微生物来源的抗真菌抗生素综述 抗真菌抗生素根据作用的靶位分为抑制细胞膜的合成、抑制细胞壁的合成、 抑制蛋白质合成、抑制电子传递和抑制核酸合成的抗真菌抗生素。本章将分门别 类作一概述。 浙江工业大学研究生学位论文 1 2 1 作用于真菌细胞膜的微生物来源的抗真菌抗生素 这类抗生素主要是以两性霉素( a m p h o t e r i c i n b ，a m b ) 和制霉菌素( n y s t a t i n ， n v s ) 为代表。 a m b 是唯一可以静脉注射临床使用的多烯类抗真菌抗生素。这类抗生素发 挥作用时首先与膜结合，其结合程度与膜内甾醇含量成正比。结合后生成的膜一 抗生素复合物，使细胞膜结构发生改变，在膜脂质双层中形成有多烯大环内酯抗 生素与胆固醇结合的环状化合物，构成亲水通道，致使细胞内容物向胞外泄漏。 所泄漏的物质种类与抗生素的性质、浓度及其作用时间有关，从而达到杀菌的目 的 4 - 5 1 。但是a m b 有较强的肾毒性，由于对细胞膜酯质中的固醇类结合专一性 不强而损伤正常人体细胞。为了改变这个情况，近年来，对两性霉素脂质体的研 究取得了很大的成功。这类新制剂的特征及开发情况见表1 1 嘲。 表1 1 a m b 的新制剂 a ：d m p c l - q 一二肉豆莞酸磷酸酯酰胆碱；b ：d m p g l - a 一二肉豆莞酸磷酸酯酰甘油 对于制霉菌素而言，其结构和两性霉素类似，同属于多烯类抗生素。与a m b 一样，在l 临床应用上有较大的毒性。a r o n e x 公司j o h n s o n 7 1 等研制了脂质体 n y o t r a n ，极大地提高了疗效，降低了毒副作用，目前已完成期临床，进入注 册前阶段。除了临床应用外，制霉菌素也可用于植物霜霉病的防治，家畜真菌病， 并在食品保藏和运输中可用作防腐剂，以及还能用于珍贵书籍的长期保存防霉。 除了两性霉素和制霉菌素外，作用于真菌细胞膜的微生物来源的抗生素还有 很多。比如同样是多烯类抗生素的四烯类的匹马菌素( p i m a r i c i n ) 口】，七烯类的 克念菌素( c a n n i t r a c i n ) | 9 1 和杀假丝菌素( c a n d i c i d i n ) 【。另外，还有以细胞膜 中的鞘磷脂为作用靶位的来自真菌代谢产物分离得到的澳苍萝菌素 浙江工业大学研究生学位论文 ( a u s 奸a l i f u n g i n ) i l l 它可以抑制神经鞘氨醇_ n 一乙酰转移酶1 越。而以真菌细胞 表面结构为作用靶位的抗生素主要是影响细胞膜表面张力，形成膜表面小孔，从 而导致胞内钾离子和其他离子的泄漏。这类抗生素主要有b a c i l o m y c i nf 和l ， s y i n g o m y c i ne ( s e ) 等。 1 2 2 作用于真菌细胞壁的微生物来源的抗真菌抗生素 以真菌细胞壁为靶点的新型抗真菌药物的研究是近年来的热点。真菌细胞壁 由p ( 1 ，3 ) 一葡聚糖、甘露糖和几丁质等成分组成，在维持细胞的生长和正常的生 理功能中起了重要的作用。由于哺乳动物没有细胞壁，因而作用于真菌细胞壁生 物合成相关酶的药物具有高效、低毒的特点。按作用机制不同，作用于细胞壁的 抗真菌药物可分为b - ( 1 ，3 ) 一葡聚糖合成酶抑制剂、几丁质合成酶抑制剂、甘露聚 糖蛋白质复合物抑制剂【1 4 】。 1 2 2 1 8 ( 1 3 ) 一蓖聚糖合成酶抑制剂 3 - ( 1 ，3 ) 葡聚糖合成酶位于细胞膜，它催化转运尿苷二磷酸中的葡萄糖基生成 1 3 - ( 1 ，3 ) 一葡聚糖。b 一( 1 ，3 ) 一葡聚糖合成酶为真菌生长所必需，抑制该酶可使细胞壁 结构异常，致使细胞破裂，细胞内容物渗漏。近年来对棘球自素作了大量的 结构改造，并广泛考察其安全性、有效性和耐受性，并有几个衍生物已进入临床 研究。表1 2 列出了进入临床及正在研究的1 3 - 1 ，3 - 葡聚糖合成酶抑制剂类抗真 菌抗生素的特点及研究状况”6 1 。 3 浙江工业大学研究生学位论文 脂肽类 棘球白素类棘球白素b a e u l e a c i n a p n e u m o c a n d i n b m u l u n d o c a n d i n f l t 9 0 1 3 7 9 l - - 7 3 3 5 6 0 c a s p o f u g i n ( 卡泊芬净) 默克 a n i d u l a f i m g i n ( l y - 3 0 3 3 6 6 ) 礼莱 i v l i c a f u n g i a ( 米卡芬净 藤泽 c i l o f i m g i f r 9 0 1 4 6 9 类f r 9 0 1 4 6 9 糖脂类 阜孢毒索类 环肽类a r b o r c a n d l n s ( a ，b c ，d ，e f ) e 。g o n k u i n a m - u n d i f u n g i n e i l i 砷a 劬g i i l 水溶性较差。化学改造成其他衍生物 溶血作用强或 体内抗菌效率不高 p n c u m o c 自m d i n b 的衍生物，有更强，更广的抗真菌活性进入临床 l - - 7 3 3 5 6 0 y 取代衍生物，水溶性好，低毒高效期临床，上市 棘球白素b 的半台成衍生物，有一个三联头部 期临床，上市 和一个5 c 尾 h o m o b 血e 上修饰一个类脂尾及一个硫酸盐期临床上市 增加水溶性 与其相连的载体有毒性及琉水性i i 期临床被中止 很强的体内外抗真菌活性，溶血作用很强已有一系列降低 溶血作用的优化 结构衍生物 仅抗念珠菌，虽经化学修饰，但体内效率不高 没有继续研究 具有新的不同于其他类的环肽结构研究阶段 有可能成为有效的口服抗生素 研究阶段 1 2 2 2 几丁质合成酶抑制剂 几丁质是1 3 - 0 , 4 ) 连接的n 一乙酰葡萄糖胺( n g l c n a c ) 的链状聚合物，是细 胞壁的支架结构。几丁质合成酶催化n g i c n a c 的聚合，在真菌的细胞分裂和 成熟中起了重要作用。真菌体内有3 种几丁质合成酶：c h s l ，c h s 2 ，c h s 3 。其 中c h s l 是修复酶，不是必需的，而c h s 2c h s 3 非常重要 1 7 o 多氧霉素( p o l y o x i n s ) 4 浙江工业大学研究生学位论文 和尼克霉素( n i k k o m y c i n ) 是两类具有代表性的几丁质合成酶抑制剂f 1 8 。 鉴于本论文研究的新型抗真菌药物波洛辛霉素与多氧霉素和尼可霉素在结 构及作用机理等诸多方面具有相似性，因此着重对多氧霉素和尼可霉素这两种核 苷肽类的抑制几丁质合成酶的抗生素作了一番重点介绍。 1 ) 多氧霉素和尼克霉素的来源 6 0 年代，i s o n o 1 9 1 等发现了链霉菌& c a c a o i 阳ea s o e n s i s 代谢产物多氧霉素 ( p o l y o x i n s ) ；之后陆续从一些链霉菌属中发现了不同组分的多氧霉素，如多氧 霉素a ，b ，c ，d 等。国内，中科院微生物研究所报道通过卫星搭载、高能粒子辐射 等技术，筛选出一株稳定的新多氧霉素高产株刚。 7 0 年代，德国的z i i h n c r 口1 1 等首先在唐德链霉菌( s t r e p t o m y c e s t e n d a et f l 9 0 1 ) 的发酵液中分离到了尼可霉素( n i k k o m y c m so rn e o p o l y o x i n s ，或称华光霉素，日 光霉素) 。早期采用了紫外线( u v ) 、甲基磺酸乙酯( e m s ) 、亚硝基胍o 盯b ) 等物理 化学方法或用酶法 ：2 2 - 2 3 获得一系列的尼可霉素产生阻断突变株，它们能产生许 多新的尼可霉素组分。近年来还通过基因破坏的方法获得了产n i k k o m y c mb x ， b z ，l x ，l z 的突变株 z 4 - - z s 。该四种组分均有较高的抗真菌活性，其中n i k k o m y c i n b x 对白色念珠菌有很高的抑制活性。 2 ) 多氧霉素和尼克霉素的理化性质 多氧霉素属农用抗生素类杀菌剂嘲。易溶于水，不溶于无水有机溶剂。在酸 性和中性溶液中稳定，碱性溶液中不稳定，在p h 4 - - 5 具有等电点的两性物质。 常温条件下可贮存2 年以上。尼可霉素是一类两性水溶性核苷类物质矧，在自 然界中极易被降解。 3 ) 多氧霉素和尼克霉素的结构与作用机理 i 多氧霉素和尼克霉素的结构 自多氧霉素发现以来，由于其作为农用抗生素的巨大应用价值，许多科学家 对此进行了卓有成效的工作，图1 1 【2 踟是他们几十年研究积累下来的几种多氧霉 素组分的结构示意图。 浙江工业大学研究生学位论文 p b i y o 刊糠l b d 嚣 f g l i j x l r c量io i i x 图1 1 多氧霉素各组分结构 其中多氧霉素b 和d 被认为是迄今为止所知的最主要的有效组分。 尼可霉素是由肽基和核苷两部分组成。肽基组分为一种不常见氨基酸羟 基吡啶同型苏氨酸( h y d r o x y p y r i d y lh o m o t h r e o n i n e ，r i p h t ) ，又称n i k k o m y c i n d ： 核苷组分称为n i k k o m y c i n c ，在n i k k o m y c i n x 和z 中同a 一氨基己糖醛酸以n c 糖苷键相连的碱基分别为4 甲酰- 4 咪唑2 酮和尿嘧啶，相应称为n i k k o m y c i n c x ， c z 。n i k k o m y c i n c ，d 均为a 一氨基酸结构，它们通过肽键相连形成了二肽 n i k k o m y c i n x 和z 。三肽n i k k o m y c i n i ，j 分别是n i k k o m y c i n x 和z 中的氨基己 糖醛酸的6 羧基同谷氨酸形成肽键而成。如图1 2 例。 图1 2 尼克霉素的结构 对傩=盏h似器雠时x舯舯舯xx时x盼壶基蓍： 芦一 蕞 浙江工业大学研究生学位论文 其中尼克霉素z 和x 被认为是迄今为止所知的最主要的有效成分。 尼克霉素和多氧霉素的作用机理 多氧霉素和尼可霉素都是抑制真菌细胞壁合成的一类抗生素。它们的抗菌杀 虫机理是相似的，即该类物质与真菌和昆虫细胞壁重要组成成分几丁质的底物 切) p n 一乙酰葡萄糖结构类似，是几丁质合成酶的竞争性抑制剂，抑制几丁质 的合成，导致细胞的死亡。由于动物和人的细胞没有细胞壁，因此该类物质 对人畜无害。图1 3 【3 1 1 是n i k k o m y c i nz 和u d p - g l c a c 的结构示意图。 图1 3 尼克霉素z 和u d p n 一乙酰葡萄糖的结构 由图1 - 3 可知，两者之间存在较强的结构类似性。 研究表明，虽然多氧霉素也能抑制人体病原真菌如白色念珠菌( c a n d i d a a l b i c a n s ) 、新型隐球菌( c r y p t o c o c c u sn e o f o r m a n s ) 和厌酷球孢子菌( c o c c i d i o d e s i m m i t i s ) 3 2 。3 3 ，但是尼可霉素比多氧霉素更为有效，两者结构上的主要差别在肽 链的组成上，多氧霉素之所以活性较差是由于它渗透进入真菌胞内的能力较差， 以及水解的不稳定性弭8 司。尼可霉素的主要有效成分为尼可霉素z 和x ，比较 n i k k o m y c i n x ，z 的结构可以看出高抗真菌活性的尼可霉素都具有完整的肽基核 苷组分，可能是几丁质合成酶同时具有核苷附着位点和氨基酸附着位点，完整的 肽基核苷组分提高了尼可霉素对几丁质合成酶的亲和力：肽基组分中的甲基与抗 真菌活性直接相关。核苷组分中的n - c 糖苷键是生物活性所必需的。同时，能 够高效率利用细胞的肽基转运系统及在胞内不易被降解的结构都保证了抗真菌 活性 2 7 1 。 4 ) 多氧霉素和尼克霉素的合成 i 多氧霉素的合成 自多氧霉素发现以来，主要发展了两个合成研究领域：其一主要集中在合成 。齿 激 硷 浙江工业大学研究生学位论文 方法学的研究上，寻找一种有效方法得到新多氧霉素组分；另外一种则主要集中 在寻找更强效，更安全的多氧霉素的结构类似物上嘲。大多数多氧霉素的合成 应用了自然界存在的物质，特别是如碳水化合物，核苷，以及环多醇等。只有 v o g e l 3 8 1 等做了关于胸腺嘧啶多氧霉素从一种a c h i r a l 物质开始的完全不对称的 合成。此外，由于多氧霉素本身结构的特点，也允许做一些有意义的修饰。比较 常用到的有：n 一末端氨基酸的修饰3 9 1 ，嘧啶碱基的置换，用其他原子来代替 呋喃糖环的氧原子【4 1 1 等。 尼可霉素的合成 尼可霉素的生物合成分为两个部分：肽基和核苷成分是分开合成，然后通过 肽键相连接的。肽基中的吡啶环及羟甲基c 原子来自l - 赖氨酸，尼可霉素的氨 基己糖醛酸部分被认为同多氧霉素一样由来源于尿嘧啶和磷酸烯醇式丙酮酸的 辛酸前体衍生而来。就n i k k o m y c i n sx 和n i k k o m y c i n sz 来说，它们的核苷部分 的碱基分别来源于组氨酸和尿嘧啶1 4 2 。 近年来，一些研究小组一直试图通过修饰末端氨基酸，达到提高 n i k k o m y c i n s z 的生化活性的目的h 3 1 。s c h e r i n g - p l o u g h t 4 4 小组于1 9 9 3 年报道了 有关合成n i k k o m y c i n sz 的研究，但是对于几丁质抑制的结构一活性之间的具体 联系还不是很清楚。k i k o ho b i l 4 1 1 等设计合成了具有高效几丁质抑制活性的 n i k k o m y c i n sz 的衍生物，合成步骤见图1 4 。 3 们f 张 2 i o i “嘶螂壮 o 譬廿 h 0b h 6 b 。c ：抑砷幢似怿蜊 图1 4 新型尼克霉素的合成 如图1 4 ，以尿嘧啶多氧霉素c ( 图中3 ) 作为合成的起始材料，它的5 一氨基 基团与氨基酸衍生物n t e r t b u t o x y c a r b o n y l ( 图中4 ) 发生酰化反应。这个过程需要 n h y d r o x y s u c c i n i m i d e d c c 的参与，以使氨基酸衍生物能顺利参加反应。最后一 步反应中，5 中的保护基团b o c 被t f a 置换，同时6 中的t f a 又通过离子交换 浙江工业大学研究生学位论文 树n 旨( d o w e xx f s - 4 3 2 7 9 ) 被移走。产品冻干后，在最终获得的灰白黄色粉末中， 这种具有高效活性的n i k k o m y c i n s z 的衍生物含量在1 9 9 8 。 5 ) 多氧霉素和尼克霉素的应用 1多氧霉素的应用 多氧霉素属农用抗生素类杀菌剂。在其他病害防治的多种农用抗生素中，经 受了长期考验的当属多氧霉素，它集众多优点于一身，主要有：杀菌谱广，有良 好的内吸传导性能，并有保护和治疗作用，低毒，无残留，对环境不污染，对天 敌和植物安全，生命周期长，不易产生抗药性，高效性，成本低廉 2 6 1 。 多氧霉素对瓜果蔬菜的立枯病、白粉病、灰霉病、炭疽病、茎枯病、枯萎病、 黑斑病等多种病害防效优良，同时对防治水稻纹枯病、稻瘟病，小麦锈病，赤霉 病等作物病害也有明显效果。对苹果斑点落叶病、梨黑斑病、草莓灰霉病、烟草 赤星病的防效尤其显著，是这些病害防治的首选杀菌剂 4 5 】。 在多氧霉素的研制过程中，我国科研人员在国内首先将等离子体注入等高新 技术应用于微生物育种，育成了超高产菌株，并建立了配套的低成本、连续、稳 定、高产的发酵新工艺，使发酵成本大大降低，达到国内领先、国际先进水平。 生产成本的降低使市场价格的降低有了可靠的基础，农民用药成本也必将有较大 幅度的降低，从而在限制多氧霉素应用的瓶颈使用的经济性上有了突破性的进 展，使多氧霉素极有可能成为继井冈霉素、阿维菌素后，第三个在我国农业生产 中大规模应用、在病虫害防治上发挥重要作用的大吨位生产的农用抗生素。 i i 尼克霉素的应用 尼可霉素可用于杀虫杀螨剂。后来的研究表明，该类抗生素对人体的条件致 病真菌白色念珠菌( c a n d i d a a l b i c a n s ) 也有效，因此开展了此类物质的医用研究。 1 9 9 5 年，美国的s h a m a n 制药公司从欧洲的b a y e r a g 公司获得对尼可霉素进行抗 真菌药物开发的许可。以鼠科动物为对象的研究表明，尼可霉素z 对美国的地方 性病原真菌病：组织胞浆菌病( h i s t o p l a s m o s i s ) i 4 7 】、芽生菌病( b l a s t o m y c o s i s ) 【4 司和球孢子菌病( c o c c i d i o d o m y c o s i s ) 1 4 9 均有效，其抗菌能力与两性霉素b 相当， 优于唑类冈。它对条件致病菌白色念珠菌5 ”、隐球菌、毛霉病、镰孢菌( f u s a r i u m ) 1 5 2 等造成的真菌病也有效。现已完成临床i 期实验。该药为口服剂型，人体对 尼可霉素z 的耐受性超过2 0 0 0 m g k g ，尼可霉素z 对白色念珠菌的m i c ( 最小抑制 浙江工业大学研究生学位论文 浓度) 1 4 叫m h 。研究表明，如果尼可霉素z 与两性霉素b ，唑类临3 刊】，葡聚 糖合成酶抑制剂l y 3 0 3 3 6 6 t s 5 】、p a p u l a c a n d i nb t 5 6 1b c l b u p r o f e n t 5 7 两两使用有协同 抗真菌作用。目前，又筛出一个新型的几丁质合成酶抑制剂a r t h f i c h i f i n 。a r t h r i c h i t i n 克服了尼柯霉素抗菌谱窄的缺点，对念珠菌、隐球菌等具有广谱活性，但其活性 还有待于进一步提高。 1 2 2 3 甘露聚糖一蛋白质复合物抑制剂 甘露聚糖和甘露聚糖蛋白质复合物( 甘露糖蛋白，m a n n o p m t e i n ) 是真菌细 胞壁的中、外层结构。它是细胞壁中含量最多的一类糖，主要是通过n 一乙酰一 葡糖胺残基上的b 一( 1 ，4 ) 二糖共价地连接在蛋白质上形成甘露蛋白复合物。在 细胞膜的糖化合物中，甘露聚糖的含量高达5 0 ，在真菌细胞壁的外周，这种 糖蛋白的含量最高，是构成这种细胞的主要抗原，它可以作为抗菌药物的作用靶 位【l 羽。 普那米星( p r a d i m i c i n ) 和b e n a m o n i c i n 类药物通过c a 2 + 选择性地与真菌细胞 壁上的甘露聚糖和甘露聚糖复合物桥连，使甘露聚糖的空间结构发生改变，从而 引起细胞壁破裂，细胞膜通透性增加，导致细胞死亡【5 删。普那米星类抗真菌 药物具有广谱的体内、体外活性，并对氮唑类和耐5 氟胞嘧啶的菌株有活性。虽 然该类药物的活性只有两性霉素b 的1 1 5 0 1 4 0 ，但其毒性仅为两性霉素b 的 o 8 t 6 。通过对普那米星的改造，目前发现其水溶性类似物b m s 一1 8 1 1 8 4 抗茵谱 较广，并且活性较高1 6 2 。此外，l o c n a m o n i c i n 及类似物目前用于治疗受机会性真 菌感染的艾滋病患者。随着对甘露聚糖和甘露糖蛋白三维结构的深入了解，将有 助于设计出高活性的新结构类型化合物。 1 2 3 抑制真菌蛋白质生物合成的微生物来源的抗真菌抗生素 1 2 3 1 真菌延长因子抑制剂 延长因子( e l o n g a t i o nf a c t o r ，e f ) 是真菌和哺乳动物细胞中蛋白质的生物合 成所必需的。延长因子有3 种，e f l 和e f 2 为真菌和哺乳动物所共有，e f 3 为真 菌特有，并且真菌和哺乳动物细胞中的e f l 和e f 2 结构差异较大。因此e f 是抗 真菌药物设计中的重要靶点。 粪壳菌素( s o r d a r i n ) 及其衍生物是选择性的e f 2 抑制剂，它作用于蛋白质 1 0 浙江工业大学研究生学位论文 的翻译过程。该类化合物对念珠菌和隐球菌效果较好，但抗菌谱相对较窄。 最近发现3 种新型的粪壳菌素衍生物g m 2 1 1 6 7 6 ，g m 一2 3 7 3 5 4 和g m 1 9 3 6 6 3 ， 它们在小鼠网状内皮细胞真菌病模型中有非常好的体外抑制活性畔】。 英国研究人员从g r a p h i m u mp u t r e d i n i sf 1 3 3 0 2 菌株发酵液中分离得到 g r l 3 5 4 0 2 ( 葛兰素) 。它能抑制白色念珠菌的蛋白合成，但不能作用于兔网状细 胞。这也是第1 个报道具有抗真菌活性但不抑制哺乳动物细胞的抗生素瞄】。 日本研究人员从p e n i c i l l i u mm i n i o l u t e u mf 3 1 4 0 5 菌株的培养液中分离而得的 又一种不抑制哺乳动物细胞的抗真菌抗生素b e 2 3 1 4 0 5 ( 万有) 。它对白色念珠菌、 新型隐性球菌均具有抑制活性，对哺乳动物不会产生细胞毒。其作用机制研究表 明，它能抑制白色念珠菌的蛋白合成 6 6 1 。 另外，还有从紫红球菌变种r h o d o c o c c u sm e r n l 0 3 3 中获得五组分的环状四 肽类抗生素，分别称为紫红肽( r h o d o p e p t i n s ) c i ，c 2 ，c 3 ，c 4 和c 5 。其分子结构 中含亲脂性b 一氨基酸的长烷烃基，这在微生物代谢产物中从未发现过。它对白 色念珠菌、假丝酵母和新型隐球酵母菌均有很强的抗菌活性1 6 7 1 。s t r e p t o m y c i n h y g r o s c o p i c u s 的次级代谢产物雷帕霉素( r a p a m y c i n ) 的衍生物p r o l y r a p m y c i n ， d e s m e t h y l r a p a m y e i n 和d e s m e t h o x y r a p a m y c i n 嘲，从真菌m u c e n as p h k l 0 1 5 3 中 分离获得的新抗9 一羟基o u d e m a i l s i n a 【6 9 1 等等，它们都具有良好的抗真菌活性， 其作用机制正在研究中。 对e f 3 抑制荆的研究相对较少，目前还没有发现选择性作用于e f 3 的化合 物。由于e f 3 为真菌所特有，因此选择性e f 3 抑制剂可能是一类很有潜力的抗 真菌药物。 1 2 3 2n 一肉豆蔻酰基转移酶抑制剂 在白色念珠菌、新型隐球菌和其他一些真菌中，n 肉豆蔻酰基转移酶 ( n m y r i s t o y l t r a n s f e r a s e ，n m t ) 催化将n 一肉豆蔻酰基从c o a 转移至蛋白质氨基 酸末端的反应是必需的。因此，n 一肉豆蔻酰基转移酶抑制剂可抑制某些真菌蛋白 质的生物合成。目前，真菌n 一肉豆蔻酰基转移酶的三维晶体结构已经测出， 提示可根据真菌n 肉豆蔻酰基转移酶三维结构的活性位点，设计出与真菌专一 性结合的抗真菌药物。 浙江工业大学研究生学位论文 1 2 4 抑制真菌电子转移的微生物来源的抗真菌抗生素 抗霉素a ( a n t i m y c i na ) 、u k 2 a 和u k 3 a 是一类具有广谱抗真菌活性的化 合物7 1 1 。这类电子转移( e l e c t r o nt r a n s p o r t ) 抑制剂都具有双内酯结构，它们对 线粒体呼吸链的电子转移有抑制作用，从而干扰线粒体的有氧呼吸，引起真菌细 胞死亡m 1 。其中u k 一2 a 是链霉菌变种5 1 7 一0 2 产生的抗霉素a 3 结构类似物， 结构上含9 个双乳糖骨架，n 一( 3 一羟基一4 甲氧吡啶) 丝氨酸和2 一苯基一3 一异丁醇基一4 一羟基戊酸。本品与抗霉素a 3 具有相同的抗菌作用机制，都是 通过穿透细胞膜，抑制线粒体电子传递系统从而杀灭真菌，后者毒性很强，而本 品毒性微弱。即使在1 0 倍浓度下，也不会激活释放活性氧系统 7 3 - 7 4 ，具有比 较好的应用价值。 1 2 5 抑制真菌核酸合成的微生物来源的抗真菌抗生素 灰黄霉素( g r i s e o f u l v i n ) 是由o x f o r d 等于1 9 3 9 年首先发现，从而开创了抗 真菌抗生素的历史【7 5 】。灰黄霉素口服后主要在十二指肠吸收，吸收后广泛分布 在全身各组织和血液中，能与角蛋白结合防止敏感菌的继续侵入；灰黄霉素主要 治疗由大小孢子菌，毛藓霉菌和表皮藓菌等菌属所引起的头、皮肤、指甲等部位 的真菌病【7 6 】。其作用机制可能是具有鸟嘌呤相似结构的灰黄霉素以竞争性抑制 作用干扰真菌细胞的d n a 合成，从而抑制其生长，它作用于敏感真菌后可致菌 丝肿胀成球形，细胞壁丧失其完整性，胞浆膜近乎消失，仅遗留少量皱缩的残余 物和巨大的脂类贮存颗粒。灰黄霉素结构见图1 5 7 7 】。 h 3 0 g h 3 0 图1 5 灰黄霉素的结构 利福霉素类抗生素属于安莎霉素类抗生素，可通过抑制依赖d n a 的r n a 多聚酶的活性来影响蛋白质合成的启动。第一种天然的利福霉素于1 9 5 8 年从地 中海链霉菌s t r e p t o m y c e sm e d i t e r r a n e i ( 后来被分类为地中海若卡氏菌n o c a r d i a m e d i t e r r a n e i ，最近又分为地中海拟无枝酸菌a m y c o l a t o p s i sm e d i t e r r a n e i ) 发酵产物 浙江工业大学研究生学位论文 中分离得到”。利福霉素是唯一的商业上投入生产的安莎霉素，其中的利福霉 素衍生物利福布汀的体外实验显示：其与两性霉素b 具有协同抗真菌作用，且 组织穿透性强m 】。 1 3 微生物发酵工艺优化策略的研究胁8 3 1 7 0 年代以来，我国推广“正交设计”方法并取得丰硕的成果。然而当实验 需考察的因素较多，且每个因素有较多的水平时，运用“正交设计”方法所需做 的实验次数仍会较多，以至难于安排实验。为解决该难题，我国著名的数理统计 专家方开泰与数论专家王元合作，将数论理论成功地应用于实验设计问题中，创 立了一种全新的实验设计方法一“均匀设计实验法”。1 0 多年来，“均匀设计” 方法已广泛应用于国内的军工、化工、医药等领域，并取得了显著的成效。在国 际上，“均匀设计”也己得到承认和应用，引起了国际数学界的重视。本节简要 介绍了“均匀设计”方法及其应用。 1 3 1 均匀设计的思想 正交设计法是从全面实验中挑选部分实验点进行实验，它在挑选实验点时有 两个特点，即“均匀分散，整齐可比”。“均匀分散”使实验点具有代表性，“整 齐可比”便于实验的数据分析。然而，为了照顾“整齐可比”，实验点就不能充 分的“均匀分散”，实验点的数目就会比较多( 实验次数随水平数的平方而增加) 。 “均匀设计”方法的思路是去掉“整齐可比”的要求，通过提高实验点“均匀分 散”的程度，使实验点具有更好的代表性，能用较少的实验获得较多的信息。与 正交实验相比，均匀设计给研究人员提供了更多的选择。均匀设计利用综合设计 和数学建模，通过全局实验回归拟和因素和方法问的全局函数关系，从而可以得 到较为准确的实验结论。 1 3 2 均匀设计表及其特点 1 3 2 1 均匀设计表及其使用表 均匀设计和正交设计相似，也是精心构造一套实验表( 方开泰，1 9 9 4 ) ，利用实 验表来安排实验。均匀设计表的代号u n ( q s ) 或u n 。( q s ) 中的“u ”表示均匀 浙江工业大学研究生学位论文 设计，“n ”表示要做n 次实验，“q ”表示每个因素有q 个水平，“s ”是表中列 的数目，表示最多可安排s 个因素，u 的右上角的“t ”代表不同类型的均匀设 计表。例如u 6 ( 6 4 ) 表示要做6 次实验，每个因素有6 个水平，该表有4 列。通 常带“t ”的均匀设计表有更好的均匀性，应优先选用。 每张均匀设计表都附有一张使用表，它指示我们如何从均匀设计表中选用适