（环境科学专业论文）微生物传感器检测污染物生物毒性的研究.pdf

河北科技大学硕士学位论文 毒物绘制微生物传感器的标准曲线，通过计算得到制药废水的毒性相对于h g c l 2 的 质量浓度为1 8 1 3m g l 1 ，垃圾渗滤液的毒性相对于h g c l 2 的质量浓度为0 0 9 3m g l ； 此结果再与急性毒性分级标准对照，结果显示，石药集团欧意药业综合废水的毒性 属于剧毒；垃圾渗滤液的毒性属于重毒。 关键词微生物传感器；污染物；生物毒性；毒性测试；制药废水；垃圾渗滤液 a b s t r a c t a b s t r a c t i nr e c e n ty e a r s ，t h ec h e m i c a li n d u s t r yi sf a s td e v e l o p e d i tm a k e sal a r g en u m b e ro f t o x i cs u b s t a n c e sp o u r i n gi n t ot h ee n v i r o n m e n t i ti sh a r m f u lt ot h ee c o s y s t e ma n dh u m a n h e a l t h i ti su r g e n tt os e tu pa l la p p r o p r i a t em e t h o do fw a s t e w a t e rt o t a lt o x i c i t ye v a l u a t i o n , t or e f l e c ti t se f f e c to nh u m a nb e i n g sa n do t h e rb i o l o g i c a lo r g a n i s m s m i c r o b i a ls e n s o ri sa n e wm e t h o dt om o n i t o rd e l e t e r i o u ss u b s t a n c e s t o x i c i t yd e v e l o p i n gi nr e c e n ty e a r s i nt h i s t o p i c ，an e wt o x i c i t ym i c r o b i a ls e n s o rb a s e do nr e s p i r a t o r yi n h i b i t i o nw a sm a d e t h i s s y s t e mu s e df i x e dm i c r o o r g a n i s m sa sb i o l o g i c a lc o m p o n e n ti m m o b i l i z e do nd i s s o l v e d o x y g e ne l e c t r o d ea n di tc a nm o n i t o rt o x i c a n tq u i c k l y i nt h i sp a p e r , w ei s o l a t e dab a c t e r i as t r a i no fx 4t h a ti ss e n s i t i v et ot h eb i o t o x i c i t yf r o m s o i ls a m p l ef a ra w a yf r o mp o l l u t a n t s t h ei d e n t i f i c a t i o ni sc a r r i e do u tf r o mo b s e r v i n gt h e o m l i n ea n ds t r u c t u r e ，t h ep h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a lt e s t sa n d16 sr d n aa n a l y s i s t h e r e s u lts h o w st h a tt h es t r a i nx 4h a st h eh i g h e s ts i m i l a r i t y 谢t hm a n ys t r a i n sb e l o n g i n gt o b a c i l l u ss i m p l e xa n dt h es i m i l a r i t ye x t e n dc a r lr e a c h9 9 t h ee x p e r i m e n ti n d i c a t e dt h a t t h eo p t i m a lg r o w t ht e m p e r a t u r eo fx 4i s3 0 c ，t h ea p p r o p r i a t eg r o w t hp hi s7 8 ，a n di t w i l lr e a c has t a b l ep e r i o da t2 4 2 6hw h e ni tg r o w sa tt h eo p t i m a lc o n d i t i o n s s oi ti s i d e n t i f i e dt h a tt h eo p t i m u mg r o w t hc o n d i t i o n sx 4s t r a i n sa t2 4 2 6hw h e ng r o w t hr e a c h e d as t a b l ep e r i o d ，a n dt h eb e s tt i m eo fc u l t i v a t i n gt h es t r a i nx 4f o ri m m o b i l i z e dm e m b r a n ei s 2 4 2 6 h s e p a r a t e l yb a s e do nt h es t r a i nx 4 ，t h eec o l i ，t h eb a c i l l u sl i c h e n i f o r m i s ，t h eb a c i l l u s s u b t i l i s ，t h ep a e n i b a c i l l u sp o l y m y x a ，t h ep s e u d o m o n a sa e r u g i n o s a ，t h ea b n o r m a lv a r i a n t h a n s e n u t a ( 1 2 6 5 ) a n dt h ea b n o r m a lv a r i a n th a n s e n u l a ( 1 4 3 7 ) f o rt h ee x p e r i m e n t a l s t r a i n s ，p r e p a r i n g i m m o b i l i z e dm i c r o b i a lm e m b r a n e ，a s s e m b l i n gi n t ot o x i cm i c r o b i a l s e n s o r s ，a n dt e s t i n gt h ec h a n g e so fd i f f e r e n ts t r a i n s a e r o b i cr e s p i r a t o r ya c t i v i 够t oh g c l 2 t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ep s e u d o m o n a sa e r u g i n o s ac a l lu s eh g c l 2 t h er e s p i r a t o r y a c t i v i t yo ft h es t r a i nx 4 ，t h eb a c i l l u ss u b t i l i sa n dt h ee c o l ia r ei n h i b i t e db yh g c l 2 ，a n d t h ei n h i b i t i o no ft h es t r a i nx 4i ss t r o n g e s t t h eo t h e rb a c t e r i ai sn o ts e n s i t i v et oh g c l 2 t h e r e f o r e ，t h es t r a i n 一一x 4 i ss e l e c t e do ft h em o s ts e n s i t i v es t r a i nt ot h eb i o t o x i c i t yo f p o l l u t a n t s u s i n gx 4 a sam o l e c u l a rr e c o g n i t i o ne l e m e n t ，i ti si m m o b i l i z e db ys a n d w i c hw i t ht h e u s eo fc e l l u l o s ep o r o u sm e m b r a n eo fo 4 5 恤t h et o x i c i t yb i o s e n s o ri sc o m p o s e db y c o n n e c t i n gt h ei m m o b i l i z e dm i c r o o r g a n i s m sm e m b r a n ea n dt h ep o l a r o g r a p h i co x y g e n i i i 河北科技大学硕士学位论文 e l e c t r o d e t h es u i t a b l et o x i c i t yi n h i b i t i o nt i m ei sa b o u t15 m i n t h er e s p o n s ep r o p e r t i e s a n do p t i m u mm e a s u r e m e n tf o r t o x i c i t y m i c r o b i a ls e n s o rw e r e i n v e s t i g a t e d t h e e x p e r i m e n ti n d i c a t e dt h a t ，t h eo p t i m a lt e m p e r a t u r ei s3 04 - o 5 c ，t h ea p p r o p r i a t ep hr a n g e i s7 o 7 5a n dt h ea p p r o p r i a t ec o n c e n t r a t i o no fg g ai s2 0m g 。l i ns u b s t r a t e t h e p r e s e r v a t i o nt i m eo ft h ei m m o b i l i z e dm i c r o b i a lm e m b r a n ec a nr e a c h30 d a tt h es a m e t i m e ，w h e nm i c r o b i a ls e n s o rw a su s e di nh g c l 2t o x i c i t yt e s t , t h es t a n d a r dc u r v eo ft h e s e n s o ri sy 。1 0 5 4 7x + 0 2 10 8a n di t sl i n e a rc o r r e l a t i o ni s0 9 9 3 3 t h el i n e a rr a n g eo f e l e c t r o d ei s0 1 1 9 7m g l 一 t h ep r e s e r v a t i o nt i m ea n dt h e a c t i v a t i n gm e t h o do fi m m o b i l i z e dm e m b r a n ea r e p r e l i m i n a r i l yd e t e r m i n e d t h ep r e s e r v a t i o nt i m eo fi m m o b i l i z e dm e m b r a n e su s e di n t o x i t i t ym i c r o b i a ls e n s o r sc a ne x c e e d3 0d i ti sa c t i v a t e dd u r i n g1 - 2da tt h ep h o s p h a t e b u f f e rs o l u t i o na d d i n gg g a b a s e do nt h em i c r o b i a lb i o s e n s o rs t u d i e d , t h e ，a c u t e e e o t o x i c i t y o fp h a r m a c y w a s t e w a t e ra n dl a n d f i l ll e a c h a l ea r et e s t e d ：a n dt h es t a n d a r y 叫d g v eo fb i o s e n s o ri sm a d e b a s e do nh g c l 2 i ti sc a l c u l a t e dt h a tt h et o x i c i t yo fp h a r m a c yw a s t e w a t e ra n dl a n d f i l l l e a c h a t ei ss e p a r a t e l ye q u a lt o1 81 3m g l 叫a n d0 0 9 3m g l h g c l 2 t h er e s u l ts h o w st h a t t h et o x i c i t yo fp h a r m a c yw a s t e w a t e rc a nr e a c hh i g h l yt o x i ca n dt h el a n d f i l ll e a c h a t ea l e s e v e r et o x i c ，w h i c ha c c o r d st ot h ea c u t ee c o t o x i c i t yc l a s s i f i c a t i o no fw a t e r q u a l i t y k e yw o r d s m i c r o b i a ls e n s o r ；p o l l u t a n t s ；b i o t o x i c i t y ；t o x i c i t yt e s t ；p h a r m a c yw a s t e w a t e r ； l a n d f i l l l e a c h a t e i v 河北科技大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工 作所取得的成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方 式标明。除文中己经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体己经发 表或撰写过的作品或成果。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论一虢赵确霞 沏7 年岁月瑚 指导教师签名： 加罗年月吟日 河曼匕科技大学学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留 并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本 人授权河北科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 口保密，在一年解密后适用本授权书。 本学位论文属于 母糸保密。 ( 请在以上方框虎打“”) 学位黻作者签名：赵确霰 指导教师辫： ，、jf 知哆年j 胃弓召洳7 笔，月二3 曰 第1 章绪论 第1 章绪论 1 1课题背景及意义 随着工农业生产的快速发展和人们生活水平的提高，人工合成化学物质种类及 用量急剧增加，农药、化肥、重金属、工业废水、生活垃圾等大量有毒有害物质排 入环境，对环境造成了严重污染l l 巧】，这些物质在环境中经过复杂的物理、化学和生 物转化过程，又会形成新的污染物，一些污染物还可能进入食物链并在生物体内蓄 积，最终对生物圈产生各种各样的毒性效应，给生态环境和公众健康造成严重威胁【6 】。 有些毒性物质在很低浓度水平时亦显示出对生物强烈的毒害作用，此时，b o d 、c o d 等常规指标的检测己无法满足水体污染控制的需求。因此，必须选择合适的方法对 废水的综合毒性进行评价，以反映其对人类及其他生物的危害【7 j 。 目前，用于污染物毒性测试的方法主要有理化方法瑙j 和生物学方法。前者是定量 分析某一种或某一类污染物的含量，而污染物对生态系统的综合影响往往不是每种 单一物质毒性的简单相加【9 】，因此这种方法不能直接、全面地反映各种有毒物质对环 境的综合影响，无法判定有毒物质浓度和生物效应之间的直接关系。生物毒性测试 不仅能较全面地反应废水中复合污染物的联合毒性作用，并能充分了解各种环境因 子( 3 1 n p r 值、温度、溶解度) 对污染物毒性效应的具体影响，具有很大的优势【1 引， 因此，在水污染研究中，它己经成为监测和评价水体环境质量的重要手段之一。 1 2污染物生物毒，性测试方法概述 生物毒性测试方法包括急性毒性实验、亚急性毒性实验、慢性毒性实验以及生 物致畸、致癌、致突变实验等，其中急性毒性实验可以探明环境污染物与机体短时 间接触后所引起的损害作用，找出有毒物质的作用途径、剂量与效应的关系，为进 行其他各种动物实验提供设计依据，并对环境污染提供预警，因而已成为应用最广 泛的毒性测试方法【l 。 1 2 1 鱼类毒性实验 鱼类对水环境的变化十分敏感，当水体中有毒物质达到一定质量浓度时，就会 引起一系列中毒反应，因而被广泛用于毒物和废水的生物监测、评价，进而据此进 行质量标准和排放标准的制定以及工业废水的管理等。鱼类急性毒性实验一般程序 为：在规定的条件下，使鱼接触含不同浓度受试物的水溶液，实验周期2 4 - - 9 6h ，在 2 4 、4 8 、7 2 矛d 9 6h 时汜录实验鱼类的死亡率，确定鱼类死亡5 0 时的受试物浓度，以 半数致死浓度l c 5 0 表示【l 引。目前，鱼类急性毒性实验的发展己经较为成熟和完善， 已为制定水质标准、评价环境质量和管理废水排放提供大量的数据支持，但仍存在 河北科技大学硕士学位论文 耗时较长和对操作者要求较高等不足【7 】。 1 2 2 蚤类毒性实验【1 3 】 。 水蚤是浮游动物中体形较小的一类，以藻类、真菌、碎屑物及溶解性有机物为 食，分布广泛，繁殖能力强，同时对多种有毒物质敏感，是国际上普遍采用的标准 毒性实验生物。当水体受到污染时有毒物质会影响水蚤的生长，干扰水蚤的生殖和 发育，导致蚤类个体死亡，因此，目前常用水蚤的死亡率或繁殖能力作为毒性测试 指标。利用蚤类死亡率作为测试指标，实验现象直观，易观察，但是测试灵敏度低， 实验时间长。 1 2 3藻类毒性实验 1 4 , 1 5 】 在水生生态系统及水生食物链中，藻类是初级生产者，其个体小、繁殖快、对 毒物敏感，易于分离、培养并可直接观察细胞水平上的中毒症状，是一种较理想的 生物毒性实验材料。水体中重金属和有机污染物对藻类的毒性表现在可抑制其光合 作用、呼吸作用、酶的活性和生长等。在急性毒性实验中，常用藻类的生长抑制作 为测试指标。以藻类的生长抑制效应作为测试指标，准确可靠，但是工作量大，测 定周期长，而且藻类毒性实验的重现性较差，目前用藻类进行废水综合毒性的研究 报道还很少【川。 1 2 4 微生物毒性实验 微生物毒性实验中，研究最多的是发光细菌毒性实验。发光细菌在正常条件下 能发出一定波长的光，许多有毒物质可抑制其发光强度，通过测定发光强度变化可 以实现水质的急性毒性检测，因而受到众多研究者的关注。1 9 7 8 年，美国b a c k m a n 公司首先研制成一种商品名为“m i c r o t o x ”的生物发光光度计( 即生物毒性测定仪) ，用 明亮发光杆菌发光强度的变化检测污染物的毒性，其灵敏度可与鱼类9 6h 急性毒性实 验相媲美。此后，许多学者利用这种方法研究了工业废水【1 6 1 8 1 、河流【1 9 1 、海水【2 0 1 等 样品的毒性，我国于1 9 9 5 年将这一方法列为水质急性毒性检测的标准方法【2 1 1 。但是， 发光细菌法检测毒性具有发光强度本底值差异较大，检测期间发光变化幅度宽的问 题。 综上所述，在生物毒性研究中，常规的生物毒性测试手段已有较大发展，大大 弥补了理化分析方法存在的不足。但生物实验依然存在周期长、操作繁琐等问题， 不能满足对环境质量进行实时在线监测、突发毒物泄漏应急监测等的需要，而微生 物传感器的出现填补了这一空白【2 2 1 。许多有毒化学物质与微生物接触后会抑制细胞 内的酶促反应过程、细胞代谢活性下降，导致耗氧量、c 0 2 产生量、发光强度等信号 与正常时相比发生改变，微生物传感器即通过对这些信号强度变化量的测定来分析 有毒物质毒性的大小 2 3 1 ，因其简便、快捷、成本低廉等特点，弥补了其他生物实验 2 第1 章绪论 在毒性测试中的不足，在生物毒性研究中倍受关注。 1 3 污染物生物毒性测试的微生物传感器研究进展 从1 9 6 2 年c l a r k 最先提出生物传感器的设想距今已有4 0 多年，在生物传感器发展 的最初1 5 年里，主要以酶传感器为主。随着微生物固定化技术的发展产生了微生物 传感器，微生物传感器以微生物活体作为识别元件，特别适用于需复酶和辅酶再生 系统参与的生物反应测定，在生化需氧量( b o d ) 矛1 1 生物毒性等综合指标的监测上表现 出独特优势。用于污染物毒性检测的微生物传感器常用的微生物系有细菌、酵母、 霉菌、藻类等，尤以细菌为多。 1 3 1发光微生物传感器 目前研究和应用最多的是发光细菌( 1 u m i n o u sb a c t e r i a ) 传感器。常用的两种发 光细菌是弧菌属( v i b r i o 1 q s c h e r i ) 和明亮发光杆菌( p h o t o b a c e t e r i u m p h o s p o h r e u m ) ， 均为海洋细菌。细菌发光的生物学机制 2 4 】是： f m n h 2 + r c h o + 0 2 斗f m n + h 2 0 + r c o o h + 光 发光细菌幂吐用还原型黄素单核苷酸、长链脂肪醛为底物，在氧的参与下，经细 菌荧光素酶催化，细胞可发出波长为4 2 0 6 7 0n n l 的可见光，细菌生物发光受到发 光基因( 1 u x ) 及其操纵子的调控，当环境中存在有毒物质时，因为细菌荧光素酶活 性或细胞呼吸受到抑制，发光能力受到影响而减弱，其减弱程度与毒物的毒性大小 和浓度呈一定的比例关系。因此，通过灵敏的光电检测装置，检测在毒物作用下发 光菌的光强度变化，可以评价待测物质的毒性。 许多研究是将发光细菌的发光强度作为检测指标对有毒物质进行检测，换能器 采用光电倍增管等光电检测装置。黄正等【2 5 , 2 6 】研制了一种快速测定污染物急性毒性 的生物传感器，该传感器是由明亮发光杆菌固定化膜、硅光片、微光光功率计等组 成的细菌发光传感器，测定了3 种金属离子及3 种有机化合物的急性毒性( 以抑制菌 膜发光强度5 0 所需的受试物浓度e g l ，值表示) ，并分析了毒性作用的动力学过程。 实验结果表明：在p h7 0 ，温度2 0 ，3 o n a c l 底液条件下，固定化菌膜的发光 强度达2 5 0 3 0 0 1 0 。7m w ，稳定时间达6 0 8 0m i n i 各受试物毒性强弱及e c s o 值( m g - l q ) 为：h 9 2 十( 0 1 5 ) c u 2 + ( 1 4 ) z n 2 + ( 1 3 0 ) ，苯酚( 3 5 ) 乙醛( 2 1 0 ) 醋酸乙酯( 1 2 0 0 ) ，与哺乳 动物毒性试验的l d 如值顺序一致，有较高的灵敏度和稳定性；不同毒物之间对细菌 发光反应的抑制速率有差异。李百祥、阎鹏等 2 7 , 2 8 也采用细胞固定化技术将发光菌 固定化成膜作为敏感元件，与高灵敏度的硅光二极管紧密组合，构建了一种流通式 急性毒性快速测定仪，并对苯酚、乐果、乙醛、h 9 2 + 、c u 2 + 、z n 2 + 的急性毒性进行了 测试，检测结果与哺乳动物毒性试验呈高度相关。 。 张理兵等人【2 9 】以明亮发光杆菌作为指示物，将固定化技术、生物传感器技术与 3 河北科技大学硕士学位论文 发光细菌毒性测试技术有机结合起来，建立一种快速、灵敏、简便的检测环境污染 物急性毒性的生物传感器。传感器系统采用光纤作为发光菌信号传导介质，使传感 器与后面的集成光学检测分析系统相分离，便于现场应用。用该传感器分析了z n 2 + 毒性作用的动力学过程，并测出了z n 2 + 的剂量一效应曲线，试验表明，该传感器与 传统实验方法具有很好的相关性。于海等3 0 】开发研究了一种快速、灵敏、简便的监 测水中污染物急性毒性的光纤生物传感器。该传感器由固定了明亮发光杆菌的光纤 探头构成，生物发光信号经光纤传输到检测系统，用该传感器检测了z n 2 + 、n h 3 、硝 基苯和甲酚4 种典型污染物的剂量效应曲线，通过计算确定了其e c 5 0 分别为： 5 1 、1 0 2 、7 0 4 、7 7 0m g l ，通过与“水质急性毒性的测定发光细菌法”的比较实 验表明，发光细菌光纤传感器与标准法具有良好的相关性，能反映水中污染物的总 毒性，传感器操作简单、携带方便，适合现场监测。 1 3 2 基因工程微生物传感器 近年来，随着基因工程技术的发展+ ，将重组发光微生物应用于重金属+ 、农药等 有毒物质检测的研究和报道日益增多。目前，已构建成功并用于毒性检测传感器的 基因工程发光微生物有e s c h e r i c h i ac o l i 3 1 刁3 1 、b u r k h o l d e r i as p r a s cc 2 t 蚓、s a l m o n e l l a s t r a i n 3 5 1 、s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e 3 6 3 s 1 等，它们表现出一些新的特点，使得一个菌 株同时具备二种不同的代谢指征( 发光特性、原受体微生物的特性) 用于生物毒性 检测。重组发光酵母微生物传感器【3 5 】贝0 能够检出具真核生物毒性的物质，显示出了 真核微生物传感器的重要性。 现有的重组发光微生物传感器基本基于以下两种原理【3 9 j ：发光菌所携带的，缎基 因按照其功能可分为“l i g h to i l ”和“l i g h to f f 两种模式。“l i g h to n ”模式将目的基因和，掰 基因融合构成重组体，当目的基因对应的特异化学物质存在时，l u x 基因将被一同表 达，重组体是否发光和环境中是否含有该物质相关。f a c h i n a l i a 等p 4 j 在对比研究 b u r k h o l d e r i as p r a s cc 2 和其携带有发光基因( 1 u x ) 的基因工程菌对2 ，4 二氯酚及铜、 锌的生物降解过程的代谢特征时，即应用了这些物质刺激基因工程菌发光的特性。 “l i g h to f f 模式中则延用天然发光菌遇毒性物质发光减弱的特点，将l u x 基因和有机体 存活状态下始终表达的启动子融合，构建的指示菌发光的强弱能反映污染物毒性的 强弱。b y o u n gc h a nk i m 掣3 2 】将从v i b r i of i s h e r i 提取的荧光素酶基因导入大肠杆菌体 内，得到重组发光大肠杆菌d p d 2 5 4 0 、d p d 2 5 1 1 、d p d 2 7 9 4 和g c 2 ，选择最优的细 胞固定化条件将其固定，制成毒性微生物传感器，其发光强度会随着添加有毒化学 物质的多少而增强或减弱。试验采用酚化合物作为受试毒物，所得的e c s o ( g c 2 ) 或 e c 脚( d p d 2 5 4 0 ) 值与水蚤的l d s o 值作比较。结果表明，在对d p d 2 5 4 0 的毒性试验中， 在一定的浓度范围内受试微生物发光强度与苯酚、膜损伤型化学毒物的浓度具有相 关性，尽管d p d 2 5 4 0 的特异刺激反应结果不能和水蚤的三历d 值相比较，试验却提供 4 第1 章绪论 了一些其他有用的信息，比如关于样品中毒性作用的方式。这种生物传感器可以检 测任何可溶物质的毒性，并可作为毒性检测的种标准化工具。 1 3 - 3呼吸机能型微生物传感器 好氧型微生物呼吸时要消耗氧，而产生二氧化碳，因此，把固定化好氧微生物 膜和氧电极或二氧化碳电极组合起来，就可以通过测量溶解氧或c 0 2 的生成量来探 知生理状态，即呼吸机能型微生物传感器是由微生物固定化膜和溶解氧电极( 或c 0 2 电极) 组成。 一 硝化细菌( 包括亚硝化细菌、硝化细菌) 是专性好氧菌，易受到外界环境因素 的影响，重金属、农药、有机污染物等可以通过抑制硝化作用的酶类( 如氨单加氧 酶、羟氨氧化酶、亚硝酸氧化酶) 而影响这一过程的进行，常被用做毒性测试中。 a n d r e a sk o m g 等 4 0 】使用硝化细菌制成了硝化菌传感器，该传感器使用溶解氧探头， 通过测试水样中溶解氧的变化来评价水样毒性的大小。在实验室试验和实际污水厂 的在线监泓过程中都能够在较短时问内得到可重现的结果，但是该生物传感器通嵩 只能正常工作一周，其长期稳定性较差，原因是异养菌在传感器表面的生长降低了- 传感器的灵敏度。m a r i n e l l af a r r 6 等 4 l 】利用假单胞菌尸p 甜f f 幽作为生物敏感元件制成安 培型生物传感器，以不同物质为标准毒物进行毒性试验，分析比较其半数有效浓度 e c 5 0 、毒性抑制曲线的标准偏差、相关系数r 2 等，试验结果分别与之前做过的使用 e c o l i 、矿加c h e r i 作为敏感元件的传感器所测结果相比较，并对多种实际废水样品的 急性毒性进行检测，结果表明，与标准的发光细菌急性毒性试验相比，虽然敏感度 稍差一些，但是该传感器有一个明显的优势就是能在浊度、色度较高的样品中工作。 沈慧芳等【4 2 】以 r u ( b a t h o p h e n ) 3 ( c l 0 4 ) 2 c a b 0 s i l s i l i c o n e 膜为氧感应膜，研制了一种 非接触式光导纤维氧传感器，该传感器能在计算机控制下同时对大批样品进行扫描 检测，并根据有毒物质对细胞呼吸速率的抑制进行生物毒性试验，用该传感器检测 了多种重金属离子( 包括c d + 、z n 2 + 、n i 2 + 、c r 3 + 、c d 2 + 、c r 2 0 7 2 一) 对活性污泥和大 肠杆菌的毒性影响，试验表明，所试重金属离子对活性污泥毒性影响的大小顺序为 n i 2 + ( 9 0m g l 1 ) c d + ( 18 0m g l 1 ) c ，( 18 0m g l 1 ) c r 2 0 2 ( 18 0m g l 1 ) ；大肠杆菌 对所有试验中用到的重金属离子都较敏感，适合用于生物毒性试验，所用大肠杆菌 浓度不同，灵敏度和试验时间也不同，大肠杆菌浓度越低，灵敏度越高，但实验时 间越长。结果表明用该传感器进行毒性试验是可行的，且可用于任何对微生物有呼 吸抑制作用的毒性物质的检测一 1 3 4 代谢机能型微生物传感器 微生物同化有机物后，可生成h 2 、c 0 2 、n h 3 和有机酸类等电化学活性代谢物， 这些代谢物中含有能在电极上响应或与之反应的物质( 即电活性物质) 。于是，将固 5 河北科技大学硕士学位论文 定化微生物膜与燃料电池型电极、离子选择性电极或气体电极等组合在一起就可以 构成代谢机能测定型微生物传感器。t s ：h a n 等f 4 3 ，删将p s e u d o m o n a sa e r u g i n o s a 固定 于聚四氟乙烯膜上并附于氯离子电极表面制成电位型微生物传感器，用于测定地下 水或工业废水中三氯乙烯( t c e ) 的含量。a m u l c h a n d a n i 等将携带有机磷水解酶基 因的e c o l i 基因工程菌固定于低熔化温度琼脂糖的尼龙膜上，连接于双臂光纤束的共 同端，在酶催化作用下的有机磷酸盐的水解产物用光纤检测。有机磷酸水解酶表达 的大肠杆菌细胞催化有机磷杀虫剂的水解，形成在特定波长吸收光的发色产物，使 用光电倍增管检测器测定特定波长入射光反向散射的辐射强度与有机磷酸酯浓度有 一定的相关性。在最佳实验条件下，生物传感器在约1 0m i n 内高灵敏度地测量了对 氧磷、对硫磷和蝇毒磷杀虫剂相对于三嗪和氨基甲酸酯杀虫剂，最低检测限是3 州 对氧磷和对硫磷，5 州蝇毒磷1 45 j ；又将携带有机磷水解酶基因的e c o l i 基因工程菌 和p h 电极结合制成微生物传感器，通过测定有机磷农药水解过程产生的氢离子浓度 间接测定有机磷农药的浓度 4 6 | 。 1 4 本课题研究内容 本文依据有毒物质抑制微生物呼吸活性的原理，利用固定化微生物膜作为生物 敏感元件，极谱型溶解氧电极作为换能器，旨在研制一种对污染物生物毒性进行快 速测试的微生物传感器。 本论文研究的主要内容包括： ( 1 ) 筛选对有毒物质敏感的微生物菌株适合于毒性测试的微生物传感器的微 生物菌株应具备的要求：微生物菌株对毒性敏感性强；微生物菌株的性质稳定， 使用寿命长。 ( 2 ) 微生物传感器的集成与性能测试选择合适的固定化方法制备微生物膜， 与溶解氧电极集成传感器，选择传感器的最佳工作条件，并对传感器的性能如稳定 性、重现性、线性范围等进行测试。 ( 3 ) 微生物传感器在环境样品测试中的应用考察所研制的微生物传感器在制 药废水和垃圾渗滤液毒性测试中的应用性能。 6 第2 章试验方案的选择 第2 章试验方案的选择 微生物传感器以活的微生物作为敏感材料，利用其体内的各种酶系及代谢系统 来测定和识别相应底物。微生物传感器主要由三部分组成：第一部分是微生物膜， 此膜是由微生物与基质( 如醋酸纤维素等) 以一定的方式固化形成；第二部分是换 能器( 如氧电极、气敏电极或离子选择电极) ；第三部分是信号输出装置。将这三部 分耦合便可构成微生物传感器。其工作原理为：被分析物扩散进入固定化微生物膜， 经分子识别，发生生物学反应，产生的信息被相应的化学换能器或物理换能器转变 成可定量的和可处理的电信号，再经检测放大器放大并输出，即可定量待测物质。 2 1毒性微生物传感器工作原理 用细菌来评价有毒物质的毒性是基于毒性效应对细菌的某些可见特性的作用， 如细胞生长、运动性、呼吸速率和生物发光、酶活性变化、a t p 。水平、微热量等的 变化。这种生物学反应产生的信息被相应的换能器转变成可定量的和可处理的电信 号，电信号的大小可以间接的反映待测物质的毒性。 课题选择微生物呼吸活性抑制原理来检测有毒物质的毒性，其原理是：微生物 的外源呼吸是微生物对底液的好氧代谢，是在有氧条件下微生物细胞对底液中外源 物质的氧化和同化过程，以微生物细胞对氧的消耗作为检测指标。当不给予有毒物 质时，微生物维持正常的生理代谢，此时，扩散到分子识别元件中的氧是一个恒定 值，即输出的电信号也是一个定值；当给予一定浓度的有毒物质时，扩散到微生物 膜中的有毒物质会抑制微生物的呼吸作用，此时微生物消耗的氧减少，扩散到氧电 极中的氧增加，输出的电信号也将增加，依此即可反映有毒物质的毒性。 2 2 微生物传感器用于毒性测试的响应机理 用于毒性检测的微生物传感器由溶解氧电极、固定化微生物膜和信号输出装置 组成，微生物传感器的结构如图2 1 所示。 7 河北科技大学硕士学位论文 l 一塑料管2 一内充液扣聚四氟乙烯薄膜4 - 压帽 5 - 微生物膜6 - 金电极( 阴极) 7 - a g x g c i 电极( 阳极) 图2 1微生物传感器结构示意图 f i g 2 - l s t r u c t u r eo fm i c r o b i a lb i o s e n s o r 氧电极的极化电极( 阴极) 为妒4n t m 的黄金片，参比电极( 阳极) ： 两极间充以氯化钾四硼酸钠电解液，顶端以聚四氟乙烯薄膜覆盖。但疋傲化电怂源 输出0 7 2v 电压施加于a g a g c l 电极( 接正极) 和黄金电极( 接负极) 上。 当在氧电极的聚四氟乙烯薄膜上再紧贴一固定化微生物膜时，就构成了微生物电 极。将电极浸入温度、通气速度均恒定的含有一定浓度底物的磷酸盐缓冲溶液时， 则微生物膜内的微生物内源呼吸活性一定，溶液中溶解氧分子扩散进入传感器氧电 极的速率一定，此时电极输出一稳定的电流值( 基线) 而。 如果将有毒物质加入到含有一定浓度底物的磷酸盐缓冲溶液中时，则有毒物质的 分子也扩散进入微生物膜。因有毒物质对微生物的呼吸活性有抑制作用，使其呼吸 活性迅速降低，故其同化作用要消耗氧的量降低，因此使氧分子扩散进入氧电极的 速率升高，导致氧电极输出电流升高，并在几分钟内建立起新的动态平衡，再一次 获得稳定的电流值( 五) ，如图2 2 所示，两次稳定电流之差，即输出电流升高值。 刖赳一而( 2 1 ) 8 第2 章试验方案的选择 g g a _ 底液中未加商霉物质时b 底液中加入有毒物质时 l 一氧电极2 一微生物3 一固定化微生物膜 图2 - 2 微生物传感器响应机理示意图 f i g 2 - 2r e s p o n s ep r i n c i p l eo fm i c r o b i a ls e n s o r 当有毒物质在一定范围内时，值的大小取决于微生物耗氧速率，而耗氧速率 又取决于溶液中有毒物质的浓度。与被测溶液中有毒物质浓度之间的关系可用如 下数字模式描述： 甜书( 【d 2 】旷 d 2 】) 书( d s d o ) ( s o - s ) ( 2 2 ) 式中卜溶解氧浓度和电极电流之间的比例常数； 【q o 一主体溶液中溶解氧质量浓度( m g l 。) ； 【d 2 】电极表面附近溶液中溶解氧质量浓度( m g l 卅) ； 阎伊一主体溶液中有毒物质质量浓度( m g l 。) ； 阎扩散进入微生物膜溶液的有毒物质质量浓度( m g l d ) ； d s 溶液中有毒物质扩散系数； d ( 广一溶液中溶解氧的扩散系数； 如果考虑在世与溶液中有毒物质浓度为线性关系的范围内，式( 2 2 ) 可写成如下 形式： a l = f l ( d s d o ) p ( 1 印) 【翻o( 2 - 3 ) 式中卜定量表征有毒物质扩散限度的系数； 式( 2 3 ) 说明在其它条件一定时，电极的灵敏度随系数p 变化，当p 1 时，灵敏 度达最大值；当p s ；b m t e n 蝴，c l 5 9n 一j 叫1 5 5r r n ag 帅乞i s o l mc l5 9 7 0b c i l l u s ；de p 2 ；1 6 5r r n 9 e n e 0b i , c i l i u s 邓5 1p u n a j1 6 5r r n a9 e n e i s o l k t e5 5 - 1 1 争 一粕l i r m c u h ，i2l e l v e s o b 翻c i l l u ss i m p l e x g e n e 协r 1 6 5r r n d a 巾剐s e q u e r l u e , ；枷n ：n b r c $ 7 2 0 一b m 川m t 砧b 虻f e n u mc 1 p 蚋甜6 sr r n a9 e n i ；o i 小c l + ，、b “i u 5j d v i 州c5 9 91 6 5r i b o s o m 副r n 9 e r i e , p a r t i a ls e q u e n c e 客自m 托；l l e ” 瞥b “t e n u mi d 4 4 0 21 6 5h b o s o m gr h g e n e , p a r l i gs e q u e n c e o b 馘忆n u m 岳9 w 1 - 21 6 5h b o s o m 耐r n a9 e n e p a r l i a ds e q u e n c e 磅帅c r 。c o c c i n e 融b k t e h u mb f l 0p a i 甜1 6 5r r n a9 e n e t s o 瞳t eb f l 0 争 f i r m i c u t e s 2i e e s b k m e 稚b k 如h u m8 f 6d 椭甜1 6 5r r n ag e l s , i s o l - | t * b f 蓐 0 b a c i l l u ss p1 9 1 8 9 6 5r r n a9 e n s t r a i nl m 61 9 4 8 9 锯b , 卸c i l l u s ，d 卜1 71 6 5d b o s o m