（生物化学与分子生物学专业论文）基础稳态重链铁蛋白和可诱导重链铁蛋白在肿瘤坏死因子诱导l929细胞死亡中的不同作用.pdf

图表索引 图表索引 图1 1t n f rl 信号转导通路的上游信号分子5 图1 2t n f 诱导激活n f 1 c b 的信号通路6 图1 3 主要的凋亡信号途径9 图1 4 人铁蛋白重链亚基二级结构示意图2 l 图1 5 铁蛋白二十四聚体示意图2 2 图2 1p b l u e s c r i p ti is k ( + ，) 载体示意图2 9 图2 2p c d n a 6 载体示意图3 0 图2 3p c d n a 3 载体示意图3 0 图2 4k b l 5 1 载体示意图3 l 图2 5 载体p d i s r u p 示意图3 2 图2 6 点突变流程示意图4 l 图3 1f 酽瞳细胞中n e o 和内源基因形成融合m r n a 5 7 图3 2 酽细胞中重链铁蛋白基因m r n a 减少5 8 图3 3f c r m 眦细胞对t n f 诱导细胞死亡有抗性5 9 图3 4r t - p c r 验证重建细胞系中h - f e r r i t i n 的表达水平5 9 图3 5 重建细胞系恢复对t n f 诱导细胞死亡的敏感性6 0 图3 6 重链铁蛋白的铁氧化酶活性是重建f d 眦对t n f 敏感性所必需的6 l 图3 7 酽细胞对t n f 的抗性有选择性6 3 图3 8z v a d 增强t n f 对f d 嘣细胞的细胞毒性6 5 图3 9 重链铁蛋白缺失导致细胞内铁含量减少6 6 图3 1 0 重链铁蛋白缺失导致细胞内基础l i p 上升6 7 图3 ilt n f 处理后野生型和f e l 9 2 9 细胞内r o s 变化情况6 8 图3 1 2t n f 处理后f e r l 眦细胞内l i p 上升比野生型l 9 2 9 细胞少6 9 图3 1 3 去铁胺对t n f 诱导r o s 产生和细胞死亡的影响7 0 图3 1 4l 9 2 9 细胞中t n f 诱导l i p 上升所需的铁离子由内源的储存铁来补 充j 7 2 图3 1 5t n f 处理后l 9 2 9 和a 5 4 9 细胞内重链铁蛋白的表达情况7 4 图3 1 6t n f 处理后l 9 2 9 和a 5 4 9 细胞内l i p 变化7 4 图表索引 图3 1 7t n f 处理后l 9 2 9 和a 5 4 9 细胞内r o s 的变化7 5 图3 1 8t n f 处理后稳定细胞株耵h f e r d t i n 内h f e r r i t i n 的诱导表达情况7 6 图3 1 9 在l 9 2 9 细胞中异位表达t n f 诱导的重链铁蛋白能抑制t n f 诱导的l i p 、 r o s 上升和细胞死亡7 7 图3 2 0l 9 2 9 野生型和f e l l i | 毗细胞经t n f 处理后n f 诏结合d n a 的情况7 9 图3 2 1 重链铁蛋白和l i p 调节t n f 诱导的r o s 产生和r o s 依赖的细胞死亡 的假设模型8 l 1 1 0 缩略语及中英文对照 缩写 a p 1 峨p a r f 2 a s k l b a d b a k b a x b c l c d n a c f l 口 - l p c p c p r o m o t e r c l 心 c o n a d d d i s c d m 匝m 缩略语及中英文对照 全称( 英文) a c t i v a t o rp r o t e i i a - 1 a d a ：1 0 s i n e5 - t r i p h o s p h a t e a c t i v a t i n gt m m c r i p t i o nf a c t o r2 a p o p t o s i ss i g n a l - r e g u l a t i n gk i n a s el b c l 2 b c l 一) ( l a n t a g o n i s t , c a u s i n gc e nd e a t h b c l 2h o m o l o g o u sa n t a g o n i s t k i l l e r b c l - 2 一a s s o c i a t e dx p r o t e i n b - c e l ll y m p h o m 舭e m i a c o m p l i m e n t a r yd e o x y l r i b o n u c l e i ca c i d c e l l u l a rf a s a s s o c i a t e dd e a t h - d o m a i n - l i k e i l - 1 3 - c o n v e r t i n ge 叼y m e ( i c e ) i n h i b i t o r y p r o t e i n c y t o m e g a l o v i r u s i m m e d i a t e - e a r l yp r o m o t e r c e l l u l a ri n h i b i t o ro f a p o p t o s i s c o n c a n a v a l i na d e g r e ec e l s i u s d e a t hd o m a i n t h ed e a t h - i n d u c i n g s i g n a l i n gc o m p l e x d u l b e c c o sm o d i f i e do fe a g l e sm e d i u m 全称( 中文) 激活蛋白1 三磷酸腺苷 激活转录因子2 凋亡信号调控激酶l 诱导细胞死亡的 b c l - 2 b c i - x l 拮抗物 b c l - 2 同源拮抗物 b c l 2 相关的蛋白x b 淋巴细j 聊自血病 互补链脱氧核糖核 酸 细胞f a s 相关死亡 结构域类似的白介 素- lp 转换酶抑制蛋 白 碱性磷酸酶( 牛小 肠) 巨细胞病毒 即早期启动子 细胞凋亡抑制蛋白 伴刀豆球蛋白a 摄氏度 死亡结构域 死亡诱导信号复合 体 细胞培养试剂 缩略语及中英文对照 d r e c l e r k e m s a 咖d f a s l f c m g a l n g a p d h h s p i c e d e a t hr e c e p t o r e n h a n c e dc h e m i l u m i n e s c e n t e x t r a c e l l u l a rs i g n a l - r e g u l a t e dk i n a s e s e l e c t r o p h o r e t i cm o b i l i t ys h i f ta s s a y f a s a s s o c i a t e dd e a t h d o m a i np r o t e i n f a s l i g a n d f l o wc y t o m e t e r d - g a l a c t o s a m i n e g l y c e r a l d e h y d e - 3 - p h o s p h a t ed e h y d r o g e n a s e h e a t - s h o c k p r o t e i n i l 一18c o n v e r t i n g 既l z y m e i m m e d i a t ee a r l yg e n ex i k bk i n a s e n f d bi n h i b i t o r i n t e r l e u k i n i r o nr e s p o n s i v ee l e m e n t i r o nr e g u l a t o r yp r o t e i n e - j u nm - t e r m i n a lk i n a s c l a b i l ei r o np o o l l i p o p o l y s a e c h a r i d e m a p k k k m i t o g e n - a c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s ek i n a s ek i n a s e 脚k k 脚k m i t o g e n - a c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s ek i n a s e m i t o g e n - a c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s e 死亡受体 免疫印迹化学发光 细胞外信号调控激 酶 电泳迁移分析 f a s 相关的死亡 结构域蛋白 f a s 配基 流式细胞仪 d 半乳糖胺 3 一磷酸甘油醛脱氢 酶 热休克蛋白 白细胞介素一l p 转化 酶 即早期基因x i c b 激酶 n f - r c b 抑制物 自细胞介素 铁离子反应元件 铁离子调控蛋白 c - j u n 氨基末端激酶 动态铁离子库 脂多糖 丝裂原激活的蛋白 激酶激酶激酶 丝裂原激活的蛋白 激酶激酶 丝裂原激活的蛋白 瞰 舣 怂 儿 | 茎| 时 胍 m 吣 缩略语及中英文对照 m c s m e f c e l l n 匝k m e k k m l k 皿 m l m m n a c n a d n f n g f p ! f 蛆心1 p n k 3 r a c e i r n 础 r o s r 肿c r s a p k s o d t a k m u l t i p l ec l o n i n gs i t e s m u r i n ee m b r y o n i cf i b r o b l a s tc e l l m a p k e r kk i n a s e m e kk i n a s e m i x e dl i n e a g ek i n a s e m i c r o l i t e r m i l l i l i t e r m i l i m o l a r n - a c e t y l - c y s t e i n e n i c o t i n a m i d ea d e n i n ed i n u c l e o t i d e p o l y n u c l e i ck i n a s e 一 一 y - r a p i da m p l i f i c a t i o no f c d n ae n d s 硼汀r i a s s o c i a t e d a d a p t e rm o l e c u l e r e c , e p t o r - i n t 眺gp r o t e i n i 姒i n t e r f e r e n c e r ( 冀l c t i v co x y g e ns p e c i e s r e a l - t i m ep c r s t r e s s a c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s e s u p e r o x i d ed i s m u t a s e t g f - 1 3a c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s e 1 1 3 激酶 多克隆位点 鼠胚胎纤维原细胞 m a p k e r k 激酶 m e k 激酶 混合连接激酶 微升 毫升 毫摩尔 n - 乙酰半胱氨酸 烟酰胺腺嘌呤二核 苷酸 核因子 神经生长因子 多聚a d p 核糖聚合 酶l 多核苷酸激酶 快速扩增e d n a3 端 i 型肿瘤坏死因子受 体 相关的适配器分子 受体相互作用蛋白 r n a 干扰 活性氧自由基 实时p c r 应激活化蛋白激酶 超氧化物歧化酶 t g f - p 激活的蛋白激 酶 缩略语及中英文对照 t g f t n f m t n f s t n f 田啪限 t r a n s f o r m i n gg r o w t hf a c t o r t u m o rn e c r o s i sf a c t o r m 即曲删a s s o c i a t e dt n f s o l u b a l et n f t n f r e c e p t o r 1 飞限r i a s s o c i a t e d d e a t hd o m a i np r o t e i n t u m o rn e c r o s i sf a c t o rr e c e p t o r - a s s o c i a t e d f a c t o r t n f - r e l a t e da p o p t o s i s - m d u c m gl i g a n d u l t r a v i o l e t v o l t s z i n c 缸g e r b e n z y l o x y c a r b o n y l - v a l - a l a - a s p f l u o r o m e t h y l k e t o n e 1 1 4 转化生长因子 肿瘤坏死因子 膜结合t n f 可溶性t n f 肿瘤坏死因子受体 肿瘤坏死因子i 型受 体相关的死亡结构 域蛋白 肿瘤坏死因子受体 相关因子 肿瘤坏死因子相关 的 凋亡诱导配基 紫外线 伏特 锌指结构 w v 砒 触 z 厦门大学学位论文原创性声明 兹呈交的学位论文，是本人在导师指导下独立完成的研究成 果。本人在论文写作中参考的其他个人或集体的研究成果，均在 文中以明确方式标明本人依法享有和承担由此论文而产生的权 利和责任。 声明人( 签名) ： 年月日 厦门大学学位论文著作权使用声明 本人完全了解厦门大学有关保留、使用学位论文的规定。厦 门大学有权保留并向国家主管部门或其指定机构送交论文的纸 质版和电子版，有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允 许论文进入学校图书馆被查阅，有权将学位论文的内容编入有关 数据库进行检索，有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密 的学位论文在解密后适用本规定 本学位论文属于 1 保密( ) ，在年解密后适用本授权书 ， 2 不保密( ( 请在以上相应括号内打“4 ) 作者签名：胡d l 易仕日期：伽1 年- 7 月9 日 导师签名：韩啄浪日期：少叫年彳确孑日 掳要 摘要 肿瘤坏死因子吨( t u m o rn e c r o s i sf a c t o r - o r ，n 师- a 【) 是一种细胞因子，它能 诱导某些细胞系经半胱天冬酶( c a s p a s c ) 依赖的细胞死亡途径死亡( 细胞凋亡) ； 与此同时，它也能够诱导另外一些细胞系通过非半胱天冬酶依赖的途径死亡( 细 胞坏死) 本文应用逆转录病毒随机插入介导基因失活的方法，以鼠纤维原细胞 l 9 2 9 为材料，筛选在t n f 诱导细胞死亡过程中起重要作用的基因我们获得一 株t n f 抗性细胞株，其重链铁蛋白基因被破坏用t n f 处理此细胞株，细胞 内的动态铁离子库( 1 a b i l ei r o np o o l ，l i p ) 上升幅度很小。我们同时发现，在野 生型l 9 2 9 细胞中，t n f 诱导l i p 上升主要是通过细胞内储存的铁离子来补充。 动态铁离子库( l i p ) 在t n f 诱导细胞产生活性氧( r e a c t i v eo x y g e ns p c c i e a ， r o s ) 和活性氧依赖的细胞死亡过程中起重要作用。在重链铁蛋白基因被破坏 的细胞( f d 嘣) 中，重链铁蛋白减少导致细胞内储存的铁离子减少，最终使t n f 诱导的细胞内l i p 上升幅度交小与其它细胞不同，l 9 2 9 细胞内的重链铁蛋白 基因不能被t n f 诱导表达。用t n f 诱导表达系统在l 9 2 9 细胞中异位表达重链 铁蛋白，t n f 处理后，细胞内l i p 上升被抑制，因l i p 上升导致的细胞内r o s 的产生也被抑制，进而抑制细胞死亡因此，l i p 在t n f 诱导细胞死亡过程中 起决定作用。它是基础稳态重链铁蛋白促进t n f 诱导的细胞死亡和可诱导重链 铁蛋白抑制t n f 诱导的细胞死亡的一个共同的衡量标准 关键词：重链铁蛋白；动态离子库；活性氧 a b s t r a c t t u m o rn e c r o s i s f a c t o r - q 口n f 一叻i s a c y t o k i n e , c a p a b l e o f i n d u c i n g c a s p a s e - d e p e n d e n t ( a p o p t o f i c ) c e l ld e a t hi n $ 0 i i 圮c e l l sa n dc a s p a s e - i n d e p e n d e n t ( n e c r o s i s - l i k e ) c e l ld e a t hi no t h e r s h e r e ，u s i n gam u t a g e n e s i ss a 屯f o rg e n e s c r i t i c a li nt n f - i n d u c e dd e a t hi nl 9 2 9c e l l s ，w eh a v ef o u n dt h a th - f e r r i t i nd e f i c i e n c y i sr e s p o n s i b l ef o rn 师- r e s i s t a n c ei nam u t a n tl i n e ，a n d , u p o nt r e a t m e n tw i t hn 艰 t h i sl i n ef a i l st oe l e v a t el e v e l so fl a b i l ei r o np o o l ( l i p ) ，c r i t i c a lf o rt n f - i n d u c e d r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ( r o s ) p r o d u c t i o na n dr o s - d e p e n d e n tc e l ld e a t h s i n c ew e f o u n dt h a tt n f - i n d u c e dl i pi nl 9 2 9c e l l si sp r i m a r i t yf u r n i s h e db yi n t r a c e l l u l a r s t o r a g ei 加l n t h el e s s e ri n d u c t i o no fl i pi nh f e r r i t i nd e f i c i e n tc e l l sr e s u l t sf r o ma r e d u c t i o no fi n w a c e l l u l a ri r o ns t o r a g ec a u s e db yl e s sh - f e r r i t i n d i f f e r e n tf r o m 翱m n c o t h e rc e l ll i n e s , t h eh - f e r r i t i ng e n ei nl 9 2 9c e l l si sn o tt n f - i n d u c i b l e ；h o w e v e r , w h e nh f e r r i t i ni s 【p 他s s e di nl 9 2 9c e l l su n d e rat n f - i n d u c i b l es y s t e m , t h e t n f - i n d u c e dl i pa n ds u b s e q u e n tr o s p r o d u c t i o na n dc e l ld e a t hw e l ea l lp r e v e n t e d t h u s ，l i pi sac o m m o nd e n o m i n a t o ro ff e r r i t i nb o t hi ne n h a n c e m e n to fc e l ld e a t hb y b a s a ls t e a d y - s t a t eh f e r r i t i na n di np r o t e c t i o na g a i n s tc e l ld e a t hb yi n d u c e dh f e r r i t i n , t h e r e b ya c t i n g 弱ak e yd e t e r m i n a n to f t n f i n d u c e dc e l ld e a t h k e yw o r d s ：h - f e r r i t i n ；t n f ；l i p ；r o s 2 第一章前言 l 肿瘤坏死因子一a 1 1 简介 肿瘤坏死因子吨( r u m o rn e c r o s i sf a c t o r - n 盯吨) 是一种主要由激活的巨 噬细胞和t 细胞分泌的细胞因子【1 1 ，具有多种生物学功能，在炎症反应、免疫反 应、细胞增殖、分化及死亡等多种生理或病理过程中起着重要的调节作用陆3 l ， 这些功能都是通过t n f - g t 参与不同的信号通路来实现的。尽管t n f a 信号转导通 路非常复杂，但其信号的传递均依赖于细胞膜表面受体t n f r i ( t n fr e c e p t o r1 ) 或t n f r 2 与t n f 0 【结合之后，t n f r i 三聚化，随后募集一系列蛋白，形成信 号复合体。t n f r i 结合的第一个蛋白是具有死亡结构域( d e a t hd o m a i n ，d d ) 的t r a d d ( t n f r 1 a s s o c i a t e dd e a t hd o m a i np r o t e i n ) ，随后t r a d d 起到构架蛋 白的作用，募集更多具有d d 结构域的蛋白，例如：r i p ( r e c e p t o r - i n t e r a c t i n g p r o t e i n ) l 、f a d d ( f a s - a s s o d a t e d d e a t hd o m a i np r o t e i n ) 和t r a f 2 ( t n f - r e c e p t o r - a s s o c i a t e df a c t o r2 ) 4 - 7 等。n 吓吨通过这些蛋白传递信号，介导 执行多种生物学功能。( 图1 1 ) 明 t n f 在脊椎动物的先天性炎症反应中起着关键作用。当检测到细胞外病原 入侵时，组织中的巨噬细胞和t 细胞就产生膜结合的t n f ( m e m b r a n e - a s s o c i a t e d t n f ，m t n f ) 或者是经蛋白酶酶解后的可溶性t n f ( s o l u b l e t n f ，册) t n f 诱发化学因子和细胞因子的局部表达，促进白细胞在感染部位的黏附和激活， 然后t n f 通过加强抗原递呈和t 细胞的活化使先天性免疫变成获得性免疫。 t n f 是大约2 0 种相关细胞因子的代表，这些细胞因子通过特异性的t n f 受 体超家族的成员来调节免疫【9 1 t n f 的同源物广泛存在于昆虫、两栖类、鱼类、 鸟类和哺乳动物中在哺乳动物中，t n f 信号通过两种不同的细胞膜表面受体 传递：t n f r l ，是s t n f 的主要受体；t n f r 2 是m t n f 的主要受体【1 0 1 t n f r l 和 t n f r 2 都属于肿瘤坏死因子神经生长因子( n e u r o t r o p h i cg r o w t hf a c t o r , n g f ) 受 体超家族的成员，在胞外区具有多个富含半胱氨酸的结构域【2 ，9 1 1 】以三聚体形 式存在的n 忭吨与t n f r i 或t n f r 2 结合，导致受体三聚化随后，三聚化的受 体募集许多信号分子与之结合，激活下游信号转导通路【协这些通路包括 i k k 、j n k 、p 3 8 和p 4 2 4 4 等，它们通过激活转录因子激活蛋白1 ( a c t i v a t o r p r o t e i n - i ， 3 前言 a p - 1 ) 和n t k b ( n u c l e a rf a c t o r - r , b ) 等来调节基因表达。 t n f r l 在大多数细胞内是组成型的，而t n f r 2 的表达被高度调控。t n f r l 在胞质面有一个死亡结构域，能够与t r a d d 相结合，t n f r 2 没有死亡结构域， 但是有一个能与t r a p s 结合的结构域。其中，只有与拥有死亡结构域的t n f r l 结合，t n t 0 【才能诱发细胞死亡。多种实验方法证明t n f 的大部分功能都是通过 t n f r l 介导的【1o 1 5 1 。t n f 的同源三聚物与膜上的前同源三聚体受体结合，诱导 受体构象发生变化，使其胞内结构域与相关的信号接头分子相结合。t n f 与 t n f r l 的结合会导致细胞内两种主要的转录因子的激活：a p 1 和n t k b ，它们 均会促进大量与慢性或急性炎症反应相关的基因转录，其中一些基因编码的蛋 白能够抑制n 师吨诱导细胞死亡，如细胞凋亡抑制蛋白1 ( c e l l u l a ri n h i b i t o ro f a p o p t o s i s 1 ，c l a p 1 ) 、c i a p - 2 及与凋亡蛋白酶相作用的抗凋亡蛋白即早期基因 x - 1 l ( i m m e d i a t ee a r l yg e n ex - 1 l ，i g x - i l ) 等【1 娜。当t r a d d 与t n f r i 结合 后，它就与二级接头分子l 皿l 、t r a f 2 或础5 相结合，然后通过一种未知的 机制激活由i 纽、b 、丫组成的( k 复合体【1 5 】。( k 通过磷酸化和降解i 证来激活 n f 1 出【2 0 】。同样，t r a f 2 通过m a p k 激酶m k k 7 ( m a p kk i n a s e7 ) 激活j n k ， 被激活的扑k 通过促进磷酸化c j u n 提高a p i 的活性。与t n f r i 不同，t n f r 2 直 接与t r a f 2 结合，从而激活i k k 和j n k 。t r a f 2 能够通过招募辅助蛋白，如 c i a p l 、c l a p 2 和t r a f i ，来调节两种t n f 受体的信号通路。c i a p i 通过泛素化而 降解t r a f 2 ，而t r a f i 能够通过一种未知的机制来抑制t n f r 2 信号通路【l o 】。 4 前言 图1 1t n f r1 信号转导通路的上游信号分子，引自b a u dv e t c ，2 0 0 1 f i g1 1p r o x i m a lc o m p o n e n t so ft n f r 1s i g n a l - t r a n s d u c t i o n p a t h w a y s t n f r l 复合体上的r i p l 和t r a f 2 主要负责激活n f r b 和a p 1e 2 1 2 7 1 。在胞质 中n f k b 以二聚化形式与抑制物i r 、b s ( n 下一k bi n h i b i t o r s ) 结合为三聚体。在此三 聚体中n f k b 上的核定位信号被覆盖，因此细胞质中n f r b 以非活性形式存在。 在一些胞外信号分子，如t n f 0 【的刺激下，i r b 被其激酶i k k ( t h ei r d 3k i n a s e ) 复合体磷酸化，随后泛素化，进而被蛋白酶降解，失去结合n f r b 能力，使得 后者活化而进入细胞核，作为转录因子促进许多基因的转录【2 0 ，2 8 1 ( 图1 2 ) 【2 】。 i k k 由两个i t j 3 激酶i k k u 、i 邓以及一个调节亚基i k k y n e m o ( n f k be s s e n t i a l m o d u l a t o r ) 2 9 】构成。 在t n f o 【处理下，被激活的n f r d 3 通过促进转录c f l i p ( c e l l u l a r f a s a s s o c i a t e dd e a t h d o m a i n l i k ei l lp c o n v e r t i n g e n z y m e ( i c e ) i n h i b i t o r y p r o t e i n ) 、c l a p s 等抗凋亡基因而阻断凋亡通路，后者是作为特异性的c a s p a s e 抑制物而起作用3 0 1 。 前言 图1 2t n f 0 【诱导激活n f - r 。b 的信号通路，引自p a l l a d i n om ae t c ， 2 0 0 3 f i g 1 2t n f - c zi n d u c e dn f l ( ba c t i v a t i o ns i g n a l l i n gp a t h w a y 有丝分裂原激活的蛋白激酶( m i t o g e n a c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s e ，m a p k ) 信号 通路是一条在酵母、果蝇和人中都高度保守的信号途径，在细胞迁移、增殖、 分化、凋亡和对抗外界不利因素等生命活动中均有着重要作用。它包括i n k ( c - j u nn t e r m i n a lk i n a s e ) s a p k ( s t r e s s a c t i v a t e d p r o t e i n k i n a s e ) 、e r k ( e x t r a c e l l u l a rs i g n a l - r e g u l a t e dk i n a s e ) 和p 3 8 等几个成员。 在t n f c c 诱导后，结合到n 师r l 复合体上的t r a f 2 正是通过m a p k 信号通 路参与激活j n k 3 l 】。正如其它t r a f 蛋白，t r a f 2 的c 末端为高度保守的t r a f 结构域，而同源性较低的n 末端包含一个r i n gf i n g e r 和几个锌指结构( z i n c f i n g e r ，z n f ) 等信号结构域。通过n 末端的几个结构域，t r a f 2 激活i k k 和j n k ， 前者为激活n f r d 3 所必须，后者部分参与了t n f 一0 【介导的a p 1 激活。 6 前言 j n k 在t n f 仅诱导细胞死亡过程中的作用至今仍有争议，不同的实验得出了 各不相同的结果：促进细胞死亡，抑制细胞死亡，或是与t n f - o 诱导的死亡无 擎f 2 l ，忿3 2 - 3 4 1 、- 1 2t n f - o l 诱导细胞死亡 细胞凋亡是指为维持细胞内环境稳定，由基因控制的、自主的、有序的死 亡它是一个主动的过程，在此过程中包括一系列基因的激活、表达以及调控 等过程；它并不是病理条件下自体损伤的一种现象，而是为了更好地适应生存 环境而采取的一种死亡过程人们借用古希腊语a p o p t o s i s ，以秋天凋落的树叶 来比喻细胞的死亡状况1 9 7 2 年k e r r 最先提出这一概念，他发现结扎大鼠肝的 左、中叶门静脉后，其周围细胞发生缺血性坏死，但肝动脉供应区的实质细胞 仍存活，只是范围逐渐缩小，其间一些细胞不断转变成细胞质小块，不伴随有 炎症现象。 凋亡细胞的主要特征是：( 1 ) 染色质聚集、分块，位于核膜上，胞质凝缩， 最后核断裂，细胞通过出芽的方式形成许多凋亡小体；( 2 ) 凋亡小体内有结构 完整的细胞器，还有凝缩的染色体，可被邻近细胞吞噬消化，因为始终有膜包 裹，没有内容物释放，故不会引起炎症反应；( 3 ) 凋亡细胞中仍需要合成一些 蛋白质；( 4 ) 核酸内切酶活化，导致染色质d n a 在核小体连接部位断裂，形成 约1 8 0b p 整数倍的核酸片段，凝胶电泳图谱呈梯状；( 5 ) 凋亡通常是生理性变 化。 细胞凋亡在胚胎发育、变态发育、细胞自我平衡、组织萎缩和肿瘤退行等 过程中起着重要作用在免疫系统中，细胞凋亡在t 细胞选择和消除自我免疫t 细胞及b 细胞过程中起重要作用；它在机体免疫反应结束时清除外周效应t 细胞 和调节免疫记忆细胞及细胞毒性t 细胞和自然杀伤细胞过程中起关键作用【3 5 】 【3 6 l 。现在已知的诱导细胞凋亡的信号通路主要有两条( 图1 3 ) 【3 7 l ：死亡受体通 路和线粒体通路【3 ，3 6 , 3 l 3 蝴。死亡受体通路中的信号由配体和死亡受体结合产 生。已知的死亡受体都属于t n f 受体超家族，而死亡受体的配体属于t n f n g f 家族 细胞坏死( n e c r o s i s ) 是一类由化学因素( 如强酸、强碱、有毒物质) 、物 7 前言 理因素( 如热、辐射) 或生物因素( 如病原体) 等环境因素伤害引起的细胞死 亡现象，属于被动性死亡，通常是病理性变化，容易在机体局部引起严重的炎 症反应。坏死细胞的形态改变主要是由蛋白酶降解和蛋白变性两种病理过程引 起的。 细胞坏死初期，胞质内线粒体和内质网肿胀、崩解，结构脂游离、空泡化， 蛋白质颗粒增多，核发生固缩或断裂。随着胞质内蛋白变性、凝固或碎裂，以 及嗜碱性核蛋白的降解，细胞质呈现强嗜酸性，原有的微细结构消失，细胞中 a t p ( a d e n o s i n e5 - t r i p h o s p h a t e ) 和蛋白质合成受阻或终止。在含水量高的细胞 中，可因胞质内水泡不断增大，并发生溶解，导致细胞结构完全消失，最后细 胞膜和细胞器破裂，d n a 降解，细胞内容物流出，引起周围组织炎症反应。 t n f 通过与t n f r i 或者t n f i 也结合来行使其生物功能，t n f 与受体结合后 能够激活多条信号转导通路。t n f r i 和t n f i 毪都属于一型跨膜受体，在胞质区 t n f r i 含有一个死亡结构域，但是t n f i 也不含死亡结构域。因此，t n f k i 既能 传递细胞存活信号也能传递细胞死亡信号，但是t n f i 也主要是传递细胞存活信 号。最近有研究表明，t n f i 毪能够增强t n f r i 介导的细胞死亡信号。t n f - x 与 t n f r i 结合诱导细胞凋亡还是坏死，这取决于具体的作用细胞对象及处理条件 i 拍4 7 】 t n f o 【与t n f r i 结合后可以通过多种途径诱导死亡，但人们了解最多的是 通过t r a d d 、f a d d 、c a s p a 8 介导的细胞凋亡( a p o p t o s i s ) 途径眦4 9 】，而对 于t n f 诱导的细胞坏死人们所知甚少。有实验证明，f a d d 和c a s p a 8 缺陷的纤 维原细胞( f i b r o b l a s t s ) 降低了对t n f r l 、f a s 和死亡受体3 ( d e a t hr e c e p t o r3 ，d r 3 ) 诱导细胞凋亡的敏感性【5 0 5 。 因为f a d d 能够募集c a s p 嬲c - 8 并与之结合，所以它在t n f r l 诱导凋亡的过程 中起了相当重要的作用【5 1 ，翊。然而有实验显示在t n f a 诱导下，f a d d 缺陷细胞 ( f a d d - n u l lc e l l s ) 仍有3 0 表现为凋亡，这说明虽然f a d d 在t n f 仅通过t n f r l 诱导凋亡的过程中起着重要作用，但是t n f r l 可以通过其它分子传递信号【孤 ”】。到现在为止还没有研究清楚究竟是哪些蛋白代替f a d d 来传递t n f r l 介导的 死亡信号。 前言 图1 3 主要的凋亡信号途径，引自i g n e yf he t c ，2 0 0 2 f i g1 3t h e m a i na p o p t o t i cs i g n a l l i n gp a t h w a y s 1 2 1n f - r 。b 能抑制t n f 作为死亡配体的作用 t n f 的主要作用是引起炎症反应，当n f 1 c b 信号通路被阻断时，它也能诱 导细胞凋亡。t n f 诱导细胞凋亡的确切生物学作用还不清楚。t n f 可以通过“专 业”的死亡配体如f a s l ( f a sl i g a n d ) 和a p 0 2 f r r a i l 来帮助细胞毒性白细胞杀 死被感染的细胞而起作用。风湿性关节炎和肠炎的发病机理与t n f 诱导的细胞 凋亡有关。 内在的凋亡途径是由细胞内的d n a 损伤诱发，然后通过b c l 一2 ( b c e l l l y m p h o m a l e u k e m i a 2 ) 基因家族的成员激活c a s p a s e 来完成5 4 ，5 5 1 。在这条通路上， d n a 损伤诱导含b h 3 ( b c l 2h o m o l o g y3 ) 结构域的蛋白转录，这些调节因子激 活下游的促凋亡因子b a x ( b c l 一2 a s s o c i a t e dxp r o t e i n ) 和b a k ( b c l 2h o m o l o g o u s a n t a g o n i s t k i l l e r ) ，从而抑$ i j b c l 2 家族成员b c l 2 和b c l 。x l 的抗凋亡作用，引起细 胞凋亡。被激活的b a x 和b a k 诱导线粒体释放促进c a s p a s e 活化的因子到细胞质 中。其中一个重要因子是细胞色素c ，它与a p a 卜起激活c a s p a s e 9 ，通过c a s p a s e 一9 激活c a s p a s e 3 、6 和7 ，从而引起细胞凋亡。另外两个线粒体因子是s m a c d i a b l o 和o m i h t r a z ，它们能阻止i a p s 抑制c a s p 嬲e 活化。 外在的凋亡途径是通过细胞外的死亡配体引起的。例如t n f 家族的f a s l 和 a p 0 2 l f r r a i l ，它们分别通过与f a s 和d r 4 d r 5 结合来诱导细胞凋亡【5 6 l ，f a s 和 d r 4 d r 5 直接与接头分子f a d d 相结合，在死亡诱导信号复合体( d e a t h - i n d u c i n g s i g n a l i n gc o m p l e x ，d i s c ) 内，f a d d 招募并激活c a s p 粼一8 和l o ，c a s p a s e 一8 和1 0 通过激活c a s p 弱e 3 、6 和7 ，从而诱导细胞凋亡。细胞可以在好几个水平对外在 的凋亡途径进行调控。d e c o y 受体能够与死亡受体竞争结合配体。c a s p 鹬e 相关的 分子c - f l i p ( c e l l u l a rf l i c e - i n h i b i t o r yp r o t e i n ) 能与c a s p a s e - 8 和1 0 竞争性的结合 d i s c 5 7 1 ，l a p s 能抑锘l j c a s p a s e 3 、6 和7 的激活 s g l 。在i 型细胞中，d i s c 复合体能 够产生足够的c a s p a s e 活性诱导凋亡在i i 型细胞中，起始c a s p 嬲e 活性很弱，需 要通过内在型途径来放大信号，进而诱导凋亡。c 嬲p 觞c _ 8 切割含b h 3 结构域的 蛋白质b i d ，其产物刺激b a ) 【和b a k 去增强c 硒p a 的激活嗍 t n f 的