（水产品加工及贮藏工程专业论文）罗非鱼下脚料蛋白的自溶水解及其锌蛋白盐合成的研究.pdf

罗非鱼下脚料蛋白的自溶水解及其 锌蛋白盐合成的研究 摘要 我国罗非鱼养殖产量居世界首位。国际市场对罗非鱼的需求量逐年增加，推动了我国 罗非鱼加工业的发展，其加工品以冷冻条鱼和罗非鱼片为主。在罗非鱼片加工过程中产生 的大量罗非鱼下脚料未能得到很好的利用。本研究主要探讨利用罗非鱼下脚料内源酶以提 取水解蛋白。然后用此水解蛋白与无机锌离子螯合制备高生物利用率的锌蛋白盐，为罗非 鱼下脚料的高附加值的利用提供新的开发途径和理论依据。 本文首先对罗非鱼下脚料营养成分进行了分析和评价。然后对影响内源酶作用的各种 因素及酶活的激活方式进行了大量试验，得到了自溶的最佳条件和最佳激活方式；接着以 超滤处理后的水解蛋自为复合氨基酸和小肽来源，对锌蛋白盐的的合成工艺条件进行了初 步的探讨。研究了反应p h 、温度、配位比，时间、锌源对螯合反应的影响，确定了最佳螯 合条件。并用红外光谱法鉴定了产品。 研究结果： l 罗非鱼下脚料是一种高蛋白原料，粗蛋白含量为1 2 9 4 ，氨基酸价为6 7 ，必需氨基 酸含量丰富，必需氨基酸和非必需氨基酸比例合理。 2 对罗非鱼下脚料蛋白进行水解。采用单因素和正交试验对影响下脚料蛋白自溶作用的 各种因素进行了研究，得到的工艺条件如下：p h7 5 ，5 0 ( 2 ，料液比是i ：3 ，时间 6 5 h 。在此条件下得到的水解液中a 氨基氮含量为0 1 9 2 6 9 l o o m l ，蛋白回收率为 8 1 9 7 ，挥发性盐基氮为1 2 2 6 m g l o o g ，达到一级鲜度的标准。 3 采用无机离子k + 、n a ，紫外照射，超声波作用对罗非鱼下脚料内源酶进行激活，以 进一步提高酶解效果，最终确定了紫外( 4 2 c m x 3 0 w ) 照射3 0 r a i n 激活效果最好，a 一 氨基氮生成量为0 1 9 4 8 9 l o o m l 。 4 水解液经超滤处理，去除杂质和大分子物质，通过葡聚糖凝胶柱层析法测定其分子量， 确定其分子量大部分处于6 0 0 0 以下。 5 利用超滤液与无机锌离子进行螯合，通过单因素和正交试验，确定了螯合的最佳条件 为：p h 6 0 ，8 0 ( 2 ，1 4 m i n ，配位比为1 5 ：1 ，z n s o , 为锌源，此条件下，锌的螯合率 为6 8 1 2 9 6 。 6 采用红外光谱对锌蛋白盐进行定性分析。氨基的特征吸收峰发生了红移，初步证实了 螯合物的存在。 关键词：罗非鱼下脚料，蛋白自溶，锌蛋白盐 i s t u d yo na u t o l y s i so f p r o t e i no ft i l a p i ab y p r o d u c t a n dc h e l a t eo fz i n cp r o t e i n a t e s a b s t r a c t t h eo u t p u to f7 7 1 a p i ac u l t u r e di no u rc o u n t r yo c c u p i e sf i r s tp l a c ei nt h ew o r l d w i t l lt h e i n c r e a s i n gi n t e r n a t i o n a lm a r k e td e m a n df o r 乃l a p i a ，t h i sp r o m o t e s 乃t a p op r o c e s s i n gi n d u s t r yt o d e v e l o p mp r o d u c ti n c l u d e sf r o z e nw h o l e a n ds l i c e dn 碗p 曲d u r i n gp r o c e s s i n gs l i c e d 1 l a p i a , al a r g en u m b e ro f b y p r o d u c tw a sp r o d u c e d h o w e v e r , m o s to f t h e mw f f f en o tu t i l i z e dp r o p e r l y i n t h i st h e s i s ，p r o t e a s ef r o mb y p r o d u c to f 1 7 1 a p i aw a su s e dt oh y d r o l y z ep r o t e i nf r o mb y p r o d u c to f 乃l a p i a t h e nu s et h i sh y d r o l y s i sa n dz i n ct op r o d u c eh i g hb i o l o g i c a lz i n cc h e l a t e t h i sr e s e a r c h w a se x p e c t e dt oc r e a t ca l le c o n o m i ca n de f f e c t i v en e wa p p r o a c ho f u t i l i z a t i o no f t h e s eb y p r o d u c t n u t r i e n t so f b yp r o d u c to f7 j l a p i aw e r ea n a l y z e di nt h ed i s s e r t a t i o n n ef a 啪i n v o l v e di n a u t o l y s i sa n da c t i v a t i n gm e t h o dw e r es t u d i e do nt h eb a s i so f e x p e r i m e n t s t h e nt h eb e s ta u t o l y s i s c o n d i t i o na n da c t i v a t i n gm e t h o d sw e r ec o n f m n e d p r o t e i nh y d r o l y s a t ea f i 盯u l t r a _ f i l t r a t i o nw a s u s e dt os y n t h e s i z ez i n cp r o t e i n c o m p o u n dc h e l a t e 1 1 把e f f e c t so fp hv a l u e ，r e a c t i o n t e m p e r a t u r e ，r e a c t i o nt i m e ，z i n cs o r c e so nt h ec h e l a t i o nw e r ei n v e s t i g a t e d n l eo p t i m u m c o n d i t i o nw a so b t a i n e d p r o d u c tw a st e s t i f i e db yi r r e s u l t s ： lb y p r o d u c to f7 渤砌i sak i n do fa v a i l a b l ef o o dm a t e r i a lw i t hh i g hp r o t e i n 1 1 1 ee r o d e p r o t e i nc o n t e n to f b y p r o d u c to f 乃l a p i a w a su pt o1 2 9 4 ，t h ea m i n oa c i dv a l u ew a s6 7 ，e s s e n t i a l a l l 血oa c i dw a sr i c ha n dt h er a t i oo fe s s e n t i a la m i n oa c i da n dn o n - e s s e n t i a la m i n oa c i dw a s r a t i o n a l 2e x p e r i m e n t so fs i n g l ef a c t o ra n do r t h o g o n a ld e s i g nw h i c ha f f e c ta u t o l y s i sw e r ed o n e t h e m s m tw a so b t a i n e da sf o l l o w s ：p h7 5 ，5 0 ，t h es o l i d l i q u i dr a t i ol ：3 ， 6 5 h u n d e rt h i s c o n d i t i o n , t h ep r o t e i na u t o l y s a t ew a so b t a i n e d t h e - a m i n on i t r o g e nc o n t e n to ft h ea u t o l y s a t e w a s0 1 9 2 6 9 1 0 0 m l ，t h ee f f i c i e n c yo fp r o t e i nw a s8 1 9 7 ，t v b nv a l u ei s1 2 2 6 r a g 1 0 0 9 t h e a u t o l y s a t er e a c h sf r e s hs t a n d a r d 3i n o r g a n i ci o nk + 、n a + , u l t r a v i o l e tr a y s ，u l t r a s o n i cw e l eu s e dt oa c t i v a t ee n d o g e n o u s e n z y m eo fb y p r o d u c to f 乃l a p i ai n o r d e rt oi m p r o v et h ec o n t e n to fp r o t e i na u t o l y s a t e 1 1 1 e o p t i m u ma c t i v a t i n gm e t h o dw a s t oi r r a d i a t e 、i t hu l t r a v i o l e tr a y s ( 4 2 e m * 3 0 v of o r3 0m i n u t e s t h eo 【- a m i n on i t r o g e nc o n t e n to f t h ea u t o l y s a t ew a s i m p r o v e dt oo 1 9 4 8 9 l o o m l 4n l ea u t o l y s a t ew a sf i l t e r e dt h r o u g hu l t m f i l t r a t i o nt or e m o v ei m p u r i t ya n dm a c r o m o l e c u l e m a t e r i a l t h e nt h ec h a r a c t e r so fm o l e c u l a rw e i g h td i s t r i b u t i o no ft h ef i l t e r e da u t o l y s a t ew e r e a n a l y s e db ys e p h a d e xg - 2 5c o l u m ng e lf i l t r a t i o n a n dt h e m o l e c u l a rw e i g h tw a sc o n f l r m o d u n d e r6 0 0 0 5n eu l t r a f i l t r a f i o nw a su s e dt os y n t h e s i z ez i n cp r o t e i nc h e l a t e 1 1 1 eo p t i m u mc o n d i t i o nw a s o b t a i n e d a s f o l l o w s ：p h 6 0 ，8 0 c ，1 4 m i n u t e s , a a z n 2 + r a t i o1 5 ：1 ，z n s 0 4 t h e n t h e c h e l a t i o n o f 西n cw a s6 8 1 2 。 6t h ep r o d u c t sw a st e s t i f i e db yi r t h ea m i n oc h a r a c t e r i s t i cp e a km o v e dt oi n f r a r e d t i d i r e c t i o n t h i sv e r i f i e dt h ee x i s t e n c eo fz i n cp r o t e i nc h e l a t e k e yw o r d s ：b y p r o d u c to f 竹l a p i a ，p r o t e i na u t o l y s i s ，z i n cp r o t e i n a t e i l l 本论文中的缩写名词及其含义： 氨基酸：a m i n oa c i d ，a a 总氨基酸：t o t a la m i n oa c i d ，t a a 必需氨基酸：e s s e n t i a l a m i n o a c i d ，e a a 非必需氨基酸：n o n - e s s e n t i a la m i n oa c i d ，n e a a 三( 羟甲基) 胺基甲烷：t r i s 一( h y d r o x y m c t h y ) a m i n o m e t h a n e ，t r i s 7 , - - 胺四乙酸：e t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t i e a c i d ，e d t a 超滤：u l t r af i l t r a t i o n ，u f 分子量：m o l e c u l a rw e i g h t ，m w 湛江海洋大学 学位论文独创性及知识产权声明 本人郑重声明：所呈交的论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含 其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得本校或其它教育机构的学 位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在 论文中作了明确的说明并表示了谢意。 本学位论文成果归湛江海洋大学所有。 指导教师签名： c 舛6 b3 研究生签名：j b 羔兰 阳j 年6 月3 日 湛江海洋大学硕士论文 i 1 锌的生物学作用 第一章绪论 锌是已知的人体1 4 种必需微量元素之一，有“生命元素”之称。它参与体内2 0 0 多 种酶的组成，是细胞内最丰富的微量元素。它在人体的生长、发育、智力、组织再生、 生殖、遗传、免疫、内分泌、神经、视觉等方面发挥作用。 ( i ) 参加人体内许多金属酶的组成 锌是机体中2 0 0 多种酶的组成部分，在按功能划分的六大酶类( 氧化还原酶类、转移酶 类、水解酶类、裂解酶类、异构酶类和合成酶类) 中，每一类中均有含锌酶。人体内重要 的含锌酶有碳酸酐酶、胰羧肽酶、d n a 聚合酶等。它们在组织呼吸以及蛋白质、脂肪和核 酸等的代谢中有重要作用。催化c o ：+ h 。0 生成h ：c 0 3 的碳酸酐酶以高浓度存在于红细胞中， 其它组织中亦有存在，它可使人免于c ( h 中毒，没有这种酶就不能以足够的速度消除c 0 2 而维持生命。因此，这种酶对于c o ：输送的重要性有如红细胞对氧的输送。在人体红细胞 中，每摩尔的碳酸酐酶都含有i 克原子的锌，在正常和病理条件下，红细胞中锌的含量与 碳酸酐酶活力之间存有相关。 ( 2 ) 促进机体的生长发育和组织再生 锌是调节基因表达的d n a 聚合酶的必需组成部分。缺锌动物的突出症状是生长、蛋白 质合成、d n a 和r n a 代谢等发生障碍。在人体，缺锌儿童的生长发育受到严重影响，无论 成人或儿童缺锌都能使创伤的组织愈合困难，锌不仅对于蛋白质和核酸的合成而且对于细 胞的生长、分裂和分化的各个过程都是必需的。因此，锌对于正处于生长发育旺盛期的婴 儿、儿童和青少年，对于组织创伤的患者，是更加重要的营养素。 ( 3 ) 锌与智力发展密切相关 人脑中锌的含量远高于机体其它部位。锌可以促进脑蛋白质和核酸的合成，对脑的正 常发育和细胞膜的稳定起重要的作用。近十几年来研究发现，锌缺乏和不足可以影响脑发 育和智能发育，严重影响学习记忆，并能引起脑中某些生化改变，导致智力下降。 ( 4 ) 促进维生素a 的正常代谢和生理功能 锌参与维生素a 还原酶和视黄醇结合蛋白的合成。对维持人体正常暗适应有重要作用。 ( 5 ) 促进性器官和性机能的正常发育 如果人体缺锌可使性成熟推迟，性器官发育不全，月经不正常或停止，如及时给锌治 疗，这些症状都能减轻或消失。 ( 6 ) 保护皮肤健康 动物和人都可因缺锌而影响皮肤健康，出现皮肤粗糙。干燥等现象。在组织学上可 见上皮角化和食道的类角化。此时皮肤创伤治愈变慢，对感染的易感性增加。另外，缺 锌还可以引起细胞介导的皮肤高敏性。 ( 7 ) 参加免疫功能过程 锌在免疫反应中的作用近些年来已引起注意。根据它在d n a 合成中的作用，推测它参 与包括免疫反应细胞在内的细胞复制。锌是维持正常t 细胞和其它体内免疫功能的重要元 素。锌能增强肝脏的合成能力和细胞对病毒的敏感性并参与解毒，从而改善机体的防御能 罗非鱼下脚料蛋白的自溶水解及其锌蛋白盐合成的研究 力。人和动物缺锌时t 细胞功能受损，引起细胞介导免疫改变，使免疫力降低。同时缺锌 还可能使有免疫力的细胞增殖减少，胸腺因子活性降低，d n a 合成减少，细胞表面受体发 生变化。因此，机体缺锌可削弱免疫机制，降低抵抗力，使机体易受细菌感染。 1 2 人类缺锌的表现及其原因 人类锌绝对缺乏比较少见，但相对缺锌的人却不在少数，尤其在婴幼儿、青少年、孕 妇、老人等特殊人群中占有很大比重。全国2 2 省市抽样，有4 0 儿童发锌含量处于低水平 “1 。全国有3 0 孕妇存在锌缺乏”1 。人体缺锌后导致系列的代谢失常及病理改变，各种 含锌和需锌酶活性降低，细胞分裂、生长发育、内分泌功能、味觉、机体的防御和免疫机 制、创伤的愈合等生化过程及生理功能均会受到干扰。 1 2 1 人体缺锌的表现“1 人类锌缺乏是一种或多种锌的生物学功能降低的结果，此种营养缺乏是一种i i 型缺乏， 其首先的反应是生长缓慢而组织锌浓度无明显减少。常见缺锌症状或症状组合如表1 1 所 示： 表1 1 锌缺乏的临床表现 体征临床表现 味觉障碍 偏食、厌食或异食 生长发育不良 胃肠道疾患 皮肤疾患 眼科疾病 免役力减退 性发育或功能障碍 认知行为改变 孕后反应 胎儿宫内发育迟缓 分娩合并症增多 胎儿畸形率增高 矮小、瘦弱、秃发 腹泻 皮肤干燥、炎症、伤口愈合不良、反复性口 腔溃疡 白内障、夜盲 反复感染、感冒次数多 男性不育 认知能力不良、精神萎靡、共济失调、行为 障碍 嗜酸、呕吐加重 生产小婴儿、低体重儿 产程延长、伤口感染、流产、早产 脑部，中枢神经系统畸形 1 2 2 人类缺锌的原因。1 发生锌缺乏症主要见于以下几种情况：以含有大量植酸和纤维素的粮食为主要食品 时，由于植酸和纤维素影响锌的吸收而引起锌缺乏病。在有肠病性肢皮炎的遗传因素时， 有这种少见的常染色体隐性遗传的家族病的人，其小肠粘膜上皮细胞对锌的聚集能力降 2 湛江海洋大学硕士论文 低，从而降低锌的吸收能力而易于发生锌缺乏病。用缺锌或低锌的配方代乳食品喂养婴 儿时。临床上采用完全肠外营养时。手术后的病人。给予螯合剂的病人。慢性肾 病患者。酒精中毒性肝硬化、寄生虫及医源性疾病等。消化功能紊乱，锌丢失过多者。 锌与铜在小肠中吸收的竞争性抑制现象。 1 3 人类补锌的途径及补锌剂的开发 如前所述，人类缺锌原因有很多种。不同的缺锌原因则补锌方法与途径也不同。目前 补锌剂主要有两种：一种是食用富含锌的食物；另一种是服用补锌剂。对于含锌食物来说， 食物锌的吸收利用率与膳食有一定的关系。我国是以粗加工的谷类为主食的国家，谷类中 含有丰富的植酸和膳食纤维，这两种物质会大大降低锌的生物利用率。日常饮食中，膳食 纤维膦的分子量都处于5 一1 5 之间，有的甚至达到1 5 以上。因此，人体对锌的吸收利用率 只能是3 0 一3 5 左右，部分特殊人群还不到1 5 。根据w h o 专家组对膳食组成与锌的吸 收利用的建议，估计我国城市居民的普通膳食中锌的吸收利用率可能属于中等吸收利用 ( 在3 0 左右) ；农村居民膳食锌的吸收大约2 0 左右。因此，仅仅靠从食物中吸取锌还 是不够人体需要，很有必要开发补锌剂。 人类对于补锌剂的研究到目前为止大致经历了三个阶段：第一阶段为无机锌盐，如硫 酸锌、碳酸锌、氯化锌、醋酸锌，一般以硫酸锌为主。其对于1 3 腔溃疡、痤疮、食欲不振、 肠源性肢体皮炎、不孕症、湿疹、免疫力低下、下肢溃疡等具有一定疗效。虽然它价格低 廉，但由于它们易吸潮、生物利用率低、口感不适，服用后副作用较多，容易引起恶心、 呕吐、甚至胃部出血，因而逐渐被淘汰。第二阶段是以有机弱酸作配体合成的补锌剂，如 乳酸锌、葡萄糖酸锌、甘草酸锌、柠檬酸锌等。甘草酸锌是从天然植物中提取的甘草酸与 锌盐反应而得，成本较高。乳酸锌一般是乳酸钙与硫酸锌复分解或氧化锌与乳酸直接反应 而得。葡萄糖酸锌常以葡萄糖酸钙、浓硫酸和氧化锌为原料合成。有机弱酸锌比无机锌盐 有较好的吸收，但由于其合成复杂，产率低，而且含锌量较低，更不适于糖尿病人的补锌。 第三阶段是以氨基酸作配体与锌盐合成而得到的氨基酸螯合锌，它是以二价锌阳离子与给 电子氨基酸中的氨基氮原子形成配位键，又与给电子的羧基形成五元或六元环，成为螯合 状化合物，这类物质具有以下特点n 1 一： 1 化学稳定性好。它具有良好的化学稳定性，其适中的稳定常数使它在消化道的环境 下既可防止与膳食中的草酸盐、植酸盐结合而影响吸收，又可避免由于稳定常数过大而无 法释放锌离子。 2 安全、无毒。由于人体本身就含有该种类型化合物，而且经过大量的动物实验证明 其毒性极低，符合作为安全、无毒的食品添加剂的要求。 3 生物利用率高。锌与氨基酸、小肽形成的环状结构使分子内电荷趋于中性，在体内 p h 条件下溶解性好，容易被小肠粘膜吸收进入血液，不损害肠胃，而无机盐中带电荷的金 属离子很难通过富含负电荷的肠壁内膜细胞，锌蛋白盐符合人体的消化吸收模式，锌离子 无需再经过去极性就可通过肠壁粘膜细胞而被吸收，从而提高了它的相对生物利用率。动 物实验证明：螯合物比无机元素更多地到达靶器官，一般认为螯合物的生物学效价要高 2 0 0 - 4 0 0 ，故用量可以减少。 罗非鱼下脚料蛋自的自溶水解及其锌蛋白盐合成的研究 4 抗菌能力强。自身具有抗菌能力，其制剂或产品稳定性好，易于保存。 5 抗氧化能力强。具有s o d 酶和p o d 酶样作用，可以清除游离基，故可用于食品中 腊类的加工、保存、炸制加工时的抗氧化剂。 1 4 锌蛋白盐的研究 锌蛋白盐具有高生物利用率、无毒等优点，成为近几年来锌补剂的研究热点。氨基酸 微量元素络合物作为饲料添加剂研究较多，但作为食品营养强化剂研究较少“”3 。目前研究 主要从以下两个方面进行。 1 4 i 锌蛋白盐配体的研究 从蛋白配体种类上分为单一氨基酸和复合氨基酸、小肽两种锌蛋白盐。对单一氨基酸 锌的制备报道最早的是a b d e l ，他给出了摩尔比是1 ：l 的蛋氨酸锌的合成方法，a s h m e a d 报道了甘氨酸锌的制备方法。刘芸。”报道了甘氨酸锌的制备工艺。蒋才武“”提出利用微波 法固相合成甘氨酸锌。高胜利“”等人研究了由单体氨基酸与金属盐或者金属氧化物制备氨 基酸螯合物的研究；张有明、白俊峰等“”人利用天冬氨酸、谷氨酸与氧化锌反应制各了对 应的氨基酸螫合物。 随着对锌蛋白盐研究的深入，配体蛋白的来源转向多样化，由单一氨基酸向复合氨基 酸、小肽类发展。复合氨基酸和小肽类主要是蛋白质的水解产物，又可以将其分为植物性 水解蛋白和动物性水解蛋白。一直以来，人们对植物性蛋白配体的研究比较多。如张亚丽 “7 1 等利用豆粕的盐酸水解液作为氨基酸来源，制备复合氨基酸锌络合物作为一种新型的油 脂抗氧化剂。李健o ”等采用中性蛋白酶水解豆粕制得复合氨基酸，然后分别与硫酸锌在适 当条件下进行络合反应，从而制得复合氨基酸锌并对其最适配合条件及结构进行了研究。 但是植物性蛋白与动物性蛋白相比，氨基酸组成不算很合理，尤其是谷类蛋白比较缺乏赖 氨酸，而动物性蛋白中赖氨酸含量比较高，氨基酸组成合理，必需氨基酸含量丰富。这对 以谷类为主食的亚洲人来说，摄入一定量的动物性蛋白可以起到与植物蛋白互补的作用。 因此，近年来，采用动物性水解蛋白来制备锌蛋白盐成为各国研究者关注的热点，我国在 这方面的研究还只是起步。张晓鸣利用啤酒废酵母自溶制备复合氨基酸和小肽，再与可溶 性锌盐螯合制备锌蛋白盐，具有很好的生物利用率。张红漫“等采用酸水解法分解鸡羽毛 蛋白，制备了高纯度的复合氨基酸铜螫合物，为动物下脚料蛋白的开发利用提供了一个新 的途径。 1 4 3 螯合物的生物利用率的研究 氨基酸锌作为饲料添加剂的研究已被广泛报道，而作为食品添加剂的研究报道却少 之又少，但人类可从动物实验中获得重要的启示。阎丽新报道植酸和钙不影响蛋氨酸锌在 雏鸡体内的沉积。以增重、血中碱性磷酸酶活性、胫骨锌浓度为评价指标，和硫酸锌( 1 0 0 ) 相比，蛋氨酸锌的生物学效价为1 0 4 、1 6 7 3 和，1 3 4 。s w i n k e l s “等的实验表明与硫 酸锌( 1 0 0 ) 相比，根据口粮的复杂程度，蛋氨酸锌的生物学效价在1 1 7 2 0 6 之间。甘氨酸 湛江海洋大学硕士论文 锌还可以提高仔猪的生产性能，血、胫骨中锌浓度。k i n c a i d 1 指出乳牛对蛋氨酸锌和赖 氨酸锌的利用率比氧化锌高杨月欣。“比较了硫酸锌、葡萄糖酸锌、乳酸锌、和甘氨酸锌 的吸收速率和生物利用率，指出甘氨酸锌入血最快，生物利用率分别为1 0 0 、1 3 2 、7 3 、 1 2 4 。朱志国”报道了l 一赖氨酸锌在兔体内的生物利用率，表明l 一赖氨酸锌、葡萄糖 酸锌、硫酸锌的生物利用率分别为2 0 4 6 2 、1 5 8 8 4 、1 0 0 1 5 罗非鱼下脚料资源及利用现状 1 , 5 1 罗非鱼的利用现状 罗非鱼( t i l a p i a ) 属鲈形目，丽鱼科。具有适应性强、繁殖力高、食性广杂、抗病 力强及肉昧鲜美等特点，为世界重要养殖鱼类。自七十、八十年代分别引进我国以来， 已成为我国淡水重要养殖对象。随着养殖技术日益完善，罗非鱼产量不断提高，罗非鱼有 望在国际贸易中成为继三文鱼和对虾之后的第三大水产品。2 0 0 0 年我国罗非鱼产量为6 3 万t ，占世界总产量的6 0 。“， 2 0 0 1 年我国罗非鱼产量上升到6 9 万t ，罗非鱼养殖潜力 很大。我国罗非鱼养殖主要集中在粤、桂、琼三省，尤其广东发展罗非鱼产业具有得天独 厚的优势，随着国际市场对罗非鱼加工制品需求的快速增长，罗非鱼产业发展迅速，2 0 0 2 年已达到3 0 万t ，超过我国大陆罗非鱼产量的4 0 ，广东罗非鱼接近全球总产量的2 0 。 其中湛江和茂名养殖罗非鱼的产量约1 1 3 万t ，占全省罗非鱼产量的4 1 5 。“。 罗非鱼被视为传统白肉鱼种的替代品种，正日渐受到欧美市场青睐。国际市场对罗非 鱼的巨大需求推动了国内罗非鱼产业化进程。目前，广东罗非鱼出口量占到全国总出口量 的6 0 。广东又以湛江市和茂名市为罗非鱼产业化发展最快的地区。2 0 0 2 年湛江出口的罗 非鱼加工制品为1 5 6 万t ，产值2 9 3 2 万美元。在湛江建成的罗非鱼加工厂，年加工能力 已超过3 万t ”1 。每年罗非鱼粗加工品的出口数量都有大幅增长，罗非鱼出口呈逐年上升 的趋势。 但是罗非鱼加工以初级产品较多，深加工，精加工产品很少。出口产品主要是冻鱼片 和冻全鱼两大类，其中罗非鱼冻鱼片在国际市场很受欢迎，罗非鱼出肉率不到4 0 ，在加工 过程中产生大量的加工废弃物，包括鱼头、鱼喉等废弃物，目前大部分被用来提取鱼油， 渣再作为鱼粉饲料。内脏部分下脚料提取鱼油后大多被弃，有的直接被当作垃圾处理睇1 。 许多潜在的利用价值未能得到开发，产品的经济效益得不到大幅度的提高，同时，大量下 脚料的废弃也造成了环境方面的污染。 1 5 2 罗非鱼营养价值高 罗非鱼水分含量大约为“左右，蛋白含量约1 3 。罗非鱼蛋白富含人体必需氨基酸 和支链氨基酸，必须氨基酸和非必需氨基酸比例合理，属于优质蛋白。目前罗非鱼的食用 主要是鲜食和冻全鱼和罗非鱼片两中严宏忠1 等将罗非鱼肉片晒干后，采用微波处理，制 得蛋白质含量高的微波膨化鱼片。林弈封、朱志伟啪。”3 利用虾头内源酶水解罗非鱼肉，制 备得到高活性的降血压肽。 罗非鱼下脚料蛋白的自溶水解及其锌蛋白盐合成的研究 1 6 本课题的目的意义与研究内容 1 6 1 目的意义 人体缺锌已经成为一个普遍现象，而日常膳食中锌的生物利用率达不到人体的需要， 因此有必要对开发锌补剂。锌蛋白盐由于其高生物利用率成为目前锌补剂研究开发的热 点。动物性蛋白提供的锌蛋白盐配体既提供了高生物利用率的锌，同时可以为以谷类食物 为主食的我国人民提供一些膳食中缺乏的动物性来源必需氨基酸，使得人们的膳食更趋于 平衡。 随着我国罗非鱼加工业的迅猛发展，在加工过程中产生大量的下脚料，大部分被废弃， 造成了资源的浪费，同时也污染了环境。本试验利用这些下脚料优质蛋白进行自溶水解， 以此水解蛋白为配体，制备高生物利用率的锌蛋白盐，有效的开发了罗非鱼下脚料的潜在 价值。 1 6 2 主要研究内容 1 对罗非鱼下脚料进行了分析和评价。特别是对其蛋白的游离氨基酸和结构氨基酸的 分析和评价，目的在于为第二步的酶解提供理论依据。 2 对影响内源酶作用的各种因素及酶活的激活方式进行试验，为下一步的螯合试验提 供氨基酸和小肽。首先通过单因素试验，确定了酶解p h 、温度、料液比，时间的最适条件， 在此基础上再通过正交试验的方法确定这四个条件的最佳值。接着，为了进一步提高蛋白 酶解效率，通过超声波作用、紫外照射、添加k + 、n a + 对内源酶进行激活，以n 一氨基态氮 生成量作为指标确定了最佳激活方式。 3 对酶解液进行超滤处理。由于参与锌蛋白盐螯合的是氨基酸和小肽类，所以对酶解 液进行了超滤处理，以去除大分子的杂质和多肽，并且通过葡聚糖凝胶柱层析法进一步证 实超滤后的分子量处于6 0 0 0 以下。 4 进行超滤液与无机锌的螯合试验。首先通过单因素实验，研究了反应p h 、温度、配 位比，时间、锌源对螯合反应的影响，确定了各个因素的最适条件；然后在此基础上，对 前四个因素进行正交试验，确定了最佳螯合条件：最后通过红外光谱鉴定锌蛋白盐。 6 湛江海洋大学硕士论文 第二章罗非鱼下脚料营养成分的分析与评价 如前所述，罗非鱼片加工过程中产生的大量下脚料仅有少量用于饲料工业，绝大部分 被作为垃圾丢弃，这不仅造成了资源的极大浪费，而且还带来了环境的污染。可见，充分 利用这一水产生物资源，对于提高罗非鱼加工的附加值及保护环境具有很重要的意义。目 前，对罗非鱼下脚料的利用的研究还是一个空白，未见有关其营养成分分析的详细报道。 因此，本章对罗非鱼下脚料的营养成分进行了分析，尤其蛋白质的构成情况，为下一章罗 非鱼下脚料的蛋白自溶水解提供了一个理论依据。 2 1 材料与方法 2 1 1 原料 罗非鱼( t i l a p i a ) 下脚料( 包括鱼头、鱼骨剌、鱼内脏) ：湛江国溢水产品有限公司 提供( 2 0 0 3 年1 1 月份捕捞) 。将下脚料绞成肉糜，5 0 0 9 分装作为待测样品，于一1 8 o 冻藏 备用。 2 1 2 方法 2 1 2 1 一般营养成分的测定 水分“1 ：常压干燥法 灰分。”：5 5 0 灰化法 粗脂肪”“：索氏抽提法 粗蛋白”1 ：微量凯氏定氮法 非蛋白氮：样品加入一定体积1 0 - - - 氯乙酸充分研磨，再用5 三氯乙酸定容，过滤 后按微量凯氏定氮法测定氮含量。 2 1 2 2 罗非鱼下脚料氨基酸组成 ( 1 ) 游离氨基酸的测定：样品不经盐酸水解，直接加水定容之后，取上清液，采用日立8 3 5 5 0 型高速氨基酸分析仪进行测定。 ( 2 ) 结构氨基酸的测定：样品经6 m o l lh c l 水解，定容，采用日立8 3 5 5 0 型高速氨基酸 分析仪进行1 7 种氨基酸含量测定。另取样品经5m o l l - 1n a o h 水解，同机测定色氨酸 含量。 ( 3 ) 检测条件为： 离子交换柱规格：2 6 x1 5 0 m m 柱温：5 3 0 泵 泵压力：8 8 m p a 交换树腊型号： 流速： 洗脱液： 7 n o 2 6 1 9 ( 5 2 0 5 1 ) 0 2 2 5 m l m i n 口h 1 、2 、3 、4 罗非鱼下脚料蛋白的自溶水解及其锌蛋白盐合成的研究 分析时间：7 2 m i n进样体积：5 0 ul ( 4 ) 氨基酸价的计算方法。3 1 将所测得的必需氨基酸换算成每克蛋白质中氨基酸毫克数，以1 9 7 3 年f a o w h o 推荐的常规用量为标准，按下式计算氨基酸价： 氨基酸价21 妄兽芸慧笔墓睾磊嘉蓑纂主姜妄罢耋熹t 。 2 2 结果与讨论 2 2 1 罗非鱼下脚料组成比例 表2 - 1 罗非鱼下脚料组成比例 翌! ! 璺：! 苎三! ! ! 竺堡竺! 生! ! ! ! 堕竺皇! 竺竺! 塑丝! 监! 丝! 鱼肉鱼头内脏鱼鳔鱼鳞 8 0 91 1 01 2 0 由表2 1 所示，罗非鱼去除鱼肉后，所得下脚料占全鱼的4 4 3 0 左右，综合利用这个 资源是今后一个重要的研究方向，也是提高生态效益和社会效益的必然要求。 2 2 2 罗非鱼下脚料一般营养成分组成分析 表2 - 2 罗非鱼下脚料的主要营养成分( ) 墅旦：! 兰! ! ! 竺! ! ! ! ! ! ! ! 堂! ! ! ! ! ! ! ! ! 垒! ! 生型! ! ! ! ! 翌丝垫! 兰! 水分粗蛋白 粗脂肪灰分非蛋白氮 6 4 3 8 1 2 9 41 0 6 5 由表2 2 可知，罗非鱼下脚料粗蛋白含量为1 2 9 4 ，比下脚料鲜鳗鱼骨( 1 1 9 0 ) 高 “， 同时也比鳖虾虾头( 1 2 1 3 ) 高”。可见，罗非鱼下脚料是一种来源丰富的高蛋白 原料。罗非鱼下脚料中灰分含量较高，为7 1 5 ，这是由于罗非鱼下脚料中含有丰富的c a 、 m g 等矿物元素。另外，脂肪含量也很高，达到1 0 6 5 ，超过南美白对虾( 2 8 2 ) 的脂 肪含量，由此可见，罗非鱼下脚料是一种高蛋白、高脂肪、富含矿物质的有开发价值的食 品原料。 湛江海洋大学硕士论文 2 2 3 罗非鱼下脚料中的氨基酸组成 表2 - 3 罗非鱼下脚料的游离氨基酸及结构氨基酸组成 魅酸 代号篙粼篙篙煞尹 门冬氨酸a s p 2 5 0 8 6 4 苏氨酸聊t3 7 8 3 7 8 丝氨酸 s e r 1 9 4 3 1 9 谷氨酸g l u3 6 0 1 1 8 0 脯氨酸pro 2 5 6 4 6 6 甘氨酸 g l y 3 4 1 8 3 4 丙氨酸 a l a 5 7 5 7 0 2 胱氨酸c y s6 3 8 缬氨酸v a l 3 1 64 7 2 甲硫氨酸m e t2 2 3 2 3 4 异亮氨酸 i l e 2 6 6 4 1 8 亮氨酸leu4 7 6 7 7 3 酪氨酸t y r 4 6 1 3 0 0 苯丙氨酸p h e5 7 1 4 0 1 赖氨酸l y s4 4 6 8 7 8 组氨酸his2 1 8 2 0 5 精氨酸 a r g 3 2 0 6 8 5 色氨酸trp8 4 8 7 牛磺酸t a u1 4 3 1 7 0 氨基酸总量t a a5 8 0 9 0 9 0 02 04 06 08 01 0 0 1 2 01 4 01 6 0 氨基酸价 图2 1 罗非鱼下脚料结构蛋白的氨基酸价( 1 9 7 3 年f a 0 w h o 推荐蛋白质模式) r i 9 2 一l ：a m i n o a c i d ss c o r eo f t h e e d i b l e p r o t e i n o f b y p r o d u c t o f i i l a p i a ( b a s e do i lf a o w h os u g g e s t e dl e v e lo f1 9 7 3 ) 罗非鱼下脚料的氨基酸组成如表2 3 所示。由表可以看出，结构氨基酸中谷氨酸的含 9 帅m l墨眦啪m r s y y t c 疑醐菩栏固 罗非鱼下脚料蛋白的自溶水解及其锌蛋白盐合成的研究 量最高，达到1 1 8 0 m g 1 0 0 9 样品，门冬氨酸、甘氨酸、赖氨酸含量也较高，分别为8 6 4 m g 1 0 0 9 ，8 3 4r n g 1 0 0 9 样品，8 7 8r l l g 1 0 0 9 样品，前两种是呈味氨基酸。赖氨酸是人体第 一必需氨基酸，也是植物源食品中较缺乏的成分，故其营养意义大。罗非鱼下脚料游离氨基 酸中含量最高的是牛磺酸为1 4 3 m g 1 0 0 9 样品，比养殖对虾( 1 1 0m g 1 0 0 9 样品) 高。牛 磺酸是一种天然生理活性物质，具有降血压血脂、降胆固醇、保护视力、促进大脑发育、 增强肌体免疫功能、调节神经传导等多种生理功能，对心脏、肝脏、内分泌等机能有一定 的保护作用啪。1 。 图2 1 为罗非鱼下脚料的氨基酸价图，其氨基酸价为6 7 ，其中亮氨酸、异亮氨酸、酪 氨酸和苯丙氨酸、赖氨酸的氨基酸价为1 0 0 ，第一限制氨基酸是含硫氨基酸，原因可能是 h c l 处理样品时破坏了部分含硫氨基酸。 理想的蛋白应满足这些标准：必需氨基酸和非必需氨基酸之间平衡，支链氨基酸含量 丰富。因此，食物蛋白质营养价值的高低不仅体现在必需氨基酸的种类是否齐全上，而且 体现在必需氨基酸之间的比例是否适宜及必需氨基酸( e a a ) 与总氨基酸( t a a ) 的比例 上。f a o w h o 推荐的理想蛋白质模式认为，质量较好的蛋白质其氨基酸组成e a a t a a 在4 0 左右，e a a n e a a 在0 6 0 以上“。罗非鱼下脚料蛋白的必需氨基酸配置齐全， e a a t a a 为4 3 4 4 ，e a a n e a a 为0 7 7 ，符合这一模式；且必需氨基酸中的l 亮氨酸、 l 异亮氨酸、l 缬氨酸属于支链氨基酸，含量丰富，占总氨基酸的1 8 2 9 ，因此，罗非鱼 下脚料蛋白属于优质蛋白。另外，罗非鱼下脚料蛋白中，以游离形式存在的氨基酸比较少， 大部分是以大分子的蛋白质形式存在的，因此，有必要对该优质蛋白加以水解为制备锌蛋 白盐提供配体氨基酸和小肽。 2 3 小结 通过对罗非鱼下脚营养成分的分析，可以看出，罗非鱼下脚料是一种很好的蛋白来源， 粗蛋白含量为1 2 9 4 ，下脚料占全鱼的4 4 3 0 ，其来源丰富，从其氨基酸含量及组成分 析可知，它的必需氨基酸含量丰富，氨基酸价达到6 7 ，必需氨基酸与非必需氨基酸比例合 理，支链氨基酸含量丰富，具有生物活性的牛磺酸含量也高达1 4 3 m g 1 0 0 9 样品。由此可 知，罗非鱼下脚料是一种营养价值非常高的蛋白原料。另外，以游离形式存在的氨基酸比 较少，大部分是以大分子的蛋白形式存在，因此需要对下脚料中的蛋白进行水解。 1 0 湛江海洋大学硕士论文 第三章罗非鱼内源酶液的制备及其 水解的影响因素 第二章的实验结果表明，富含蛋白质的罗非鱼下脚料中，以游离氨基酸形式存在的蛋白 质很少，蛋白分子比较大，不利于锌蛋白盐的螫合试验。因此，必需对罗非鱼加工废弃物蛋 白进行水解。 蛋白水解分为外加酶法、酸法、碱法、自溶四种方法。化学法是利用酸碱水解蛋白， 虽水解产物溶解性好，价格低廉，但由于反应条件剧烈，水解程度和产物性质不易控制， 产物的营养性质和功能可能损失。外源酶水解具有条件温和，不破坏蛋白质的营养物质， 不产生有毒副产物等优点，但是酶的费用比较高，增加了加工成本。而自溶法利用的是存 在于生物体本身内脏和消化道的消化酶进行蛋白水解的，属于一种反应温和、费用较低的 水解方式。 本试验从食品安全和经济的角度考虑，采用条件温和且费用较低的自溶法水解罗非鱼 下脚料蛋白。试验考查了影响自溶水解效果的因素：水解p h 、温度、料液比、水解时间， 确定了最佳水解条件。在此基础上，采用紫外照射、超声波作用、添加无机离子激活内源 酶以提高水解效果，确定最佳激活方式。 3 1 材料与方法 3 1 1 原料 罗非鱼( 1 7 1 a p i a ) 下脚料( 包括鱼头、鱼骨刺、鱼内脏) ：湛江国溢水产品有限公司 提供( 2 0 0 3 年1 1 月份捕捞) 。 罗非鱼下脚料预处理：去除鱼鳃，清洗鱼体，取出内脏，将内脏匀浆得到内源酶液， 用1 0 0 m l 的塑料瓶分装，于一1 8 c 冻藏备用；将余下的下脚料绞成肉糜，5 0 0 9 分装，于一1 8 冻藏备用。 3 1 2 设备与试剂 仪器 h j 4 多头磁力加热搅拌器；夹层杯 5 0 1 a 型超级数显恒温水浴锅 u v - 2 1 0 2 p c 型紫外可见分光光度计( w f m ) p h s 2 5 型酸度计 j d