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幌伞枫对薇甘菊种子的化感作用 专业：植物学 硕士生：孙云 指导教师：李鸣光教授 摘要 幌伞枫( h e t e r o p a n a xf r a g r a n s ( r o x b ) s e e m ) ，五加科幌伞枫属，常绿乔 木，我国南方各省有分布。前期实验中，研究发现幌伞枫作为群落改造的主要树 种在治理外来入侵种薇甘菊( m i k a n i am i c r a n t h ah b k ) 中表现出了较好的耐受 性和控制作用。本研究在先期发现幌伞枫对薇甘菊具有化感作用的基础上，进一 步探讨化感物质的作用方式、提取分离以及对逆境的响应，环境对化感物质作用 强度的影响。 对幌伞枫鲜叶和凋落叶的化感作用研究中，发现幌伞枫的鲜叶和凋落叶水提 液延缓了薇甘菊种子的萌发，对其幼苗根长产生了显著抑制，对其幼苗苗高产生 了胁迫，影响了根长和苗高的分配表，使后续生长受到损害。在添加活性炭吸附 化感物质后，幌伞枫鲜叶水提液对薇甘菊种子的抑制作用减小。因此，幌伞枫的 鲜叶和凋落叶都含有化感物质，并可以通过淋溶的方式释放出来，抑制薇甘菊种 子生长。 幌伞枫的鲜叶和凋落叶水提液对薇甘菊种子的抑制程度与血桐、阴香、海南 蒲桃、樟树相比，差异显著。幌伞枫的化感作用最强，其次为血桐，而阴香与海 南蒲桃水提液促进了薇甘菊种子的生长。因此，幌伞枫的鲜叶和凋落叶的化感作 用在几种群落改造植物中是最强的。 对幌伞枫叶的化感物质的提取分离中，幌伞枫的乙醇、石油醚、乙酸乙酯提 取物都对薇甘菊产生了抑制，抑制程度为乙酸乙酯 石油醚 乙醇，可见化感物 质在乙酸乙酯提取物中得到了富集，对乙酸乙酯提取物进行硅胶柱层析分离后得 到1 6 个组分，其中组分0 为无色结晶，该结晶对薇甘菊没有抑制作用，不具有 化感活性，其余组分中，组分4 和组分8 化感活性最强，需要进一步分离。 在薇甘菊缠绕幌伞枫幼树实验中，随着缠绕天数的增加，幌伞枫的叶和根的 水提液对薇甘菊、假臭草、藿香蓟三种草本植物种子的化感作用为先减弱再增强， 4 0 天时最弱，6 0 天时增强。可见幌伞枫对薇甘菊缠绕的化感响应为先减弱再增强。 观测发现，在薇甘菊覆盖下，幌伞枫幼树仍能正常生长。所以，幌伞枫幼树能较 好的耐受薇甘菊的覆盖，并通过分泌更多化感物质，使化感作用增强，抑制了薇 甘菊的生长。 光照对化感作用强度的影响实验中发现，幌伞枫乙酸乙酯浸膏溶液 o 0 0 1 9 m l 和o 0 0 5 9 m l 浓度下，随着光照强度的升高，薇甘菊幼苗的相对根长减 小，说明化感作用在增强。高浓度化感下，随着光照强度的升高，综合薇甘菊相 对根长和苗高的变化，可以发现薇甘菊的生长随着光强的升高而减弱。随着光照 的升高，幌伞枫的化感作用强度在增加，对薇甘菊的抑制强度增加。 关键词：化感作用，幌伞枫，薇甘菊，化感物质 a l l e l o p a t h yo fh e t e r o p a n a x f r a g r a n s ( r o x b ) s e e m a b s t r a c t o ns e e do fm i k a n i am i c r a n t h ah b k m a j o r ：b o t a n y n a m e ：s u ny h n s u p e r v i s o r ：p r o f l im i n g - g u a n g h e t e r o p a n a xf r a g r a n s ( r o x b ) s e e m i sa ne v e r g r e e na r b o lw h i c hb e l o n gt o a r a l i a c e a ea n dc a l lb ef o u n di ns o u t hc h i n a 且f r a g r a n s ，a so n eo ft h en a t i v et r e e s u s e di nc o m m u n i t yr e h a b i l i t a t i o n ，s h o w sg o o dr e s i s t a n c et om i k a n i am i c r a n t h a o n t h eb a s eo fh f r a g r a n si n h i b i t i n gm m i c r a n t h ad u et oa l l e l o p a t h y , t h ea u e l o p a t h y m e c h a n i s mo fh f r a g r a n so nmm i c r a n t h ai ss t u d i e di nt h i sr e s e a r c h t h ew a t e re x t r a c to ff r e s ha n dl i t t e rl e a v e si n h i b i t e dt h eg e r m i a n a t i o nr a t eo f s e e d a n dt h er o o tl e n g t ho fs e e d l i n go fmm i c r a n t h a ，b u te n h a n c e dt h es h o o tl e n g t h t h e w a t e re x t r a c to fh f r a g r a ni n h i b i t e dt h eg r o w t ho f mm i c r a n t h a a n di t sa l l e l o p a t h y e f f e c ti ss t r o n g e rt h a no t h e rf o u re x t r a c tf r o md i f f e r e n tt r e e s w h e na c t i v a t e dc a r b o nw a sa d d e di n t ot h ee x t r a c ts o l u t i o n , i n h i b i t o r ye f f e c t d i s a p p e r e d t h i sa l s os h o w st h a thf r a g r a n sh a sa l l e l o p a t h i ce f f e c t t h ee t h y la c e t a t ee x t r a c tw e r ei s o l a t e df r o mt h ed r i e dl e a fo fh f r a g r a n s ，晰t h c o n t i n u o u s s e p a r a t e d , c a u s i n gs t r o n g e ra l l e l o p a t h i ci n h i b i t i o n ，w h i c hi n d i c a t e s e p a r a t e d a l l e l o c h e m c i a l sa r ei n 且f r a g r a n sa n dd e f i n i t u d et h e a l l e l o p a t h y m e c h a n i s mo fh f r a g r a n so nm m i c r a n t h ai ns u b s t a n c e ac o l o u r l e s sc r y s t a lw h i c h h a sn oa l l e l o p a t h i ce f f e c to b t a i n e d w h e nmm i c r a n t h ac o v e r e da n dt w i s t e dt h ey o u n gt r e eo fh f r a g r a n s b o t ht h e r o o ta n dl e a fo fh f r a g r a n se x i s t e dt h ep h e n o m e n o nt h a ta l l e l o p a t h i ce f f e c td e c r e a s e d a tf i r s ta n dt h el o w e s tv a l u ea p p e a r e di n4 0d a y s w i t hd u r a t i o no ft w i s t , t h e a l l e l o p a t h i ce f f e c te n h a n c e d t h i sr e s u l ts h o w st h a ti nr e s p o n s et ot h ea d v e r s i t y , h f r a g r a n se n h a n c e di t sa l l e l o p a t h i ce f f e c tt oi n h i b i tt h e 肱m i c r a n t h a w h e n l i g h t i n t i m i d a t ea n da l l e l o p a t h ye x s i s ta tt h es a m et i m e ，h i 曲 c o n c e n t r a t i o no fa l l e l o p a t h i cs u b s t a n c ei n h i b i tt h eg r o w t ho f 肱m i c r a n t h a a tt h e 叶 c o n c e n t r a t i o no f0 0 0 5 9 m l ，0 0 01g m l ，t h ea l l e l o p a t h i ce f f e c te n h a n c e dw h e nt h el i g h t i n t e n s i t ye n h a n c e d k e yw o r d s ：a l l e l o p a t h y , h e t e r o p a n a x f r a g r a n s ，m i k a n i am i c r a n t h a ，a l l e l o c h e m c i a l 论文原创性声明内容： 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内 容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过 的作品成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均 已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结 果由本人承担。 学位论文作者签名：翻、云 日期：如f 口年6 月、7 日 学位论文使用授权声明 本人完全了解中山大学有关保留、使用学位论文的规定，即： 学校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送 交论文的电子版和纸质版，有权将学位论文用于非赢利目的 的少量复制并允许论文进入学校图书馆、院系资料室被查 阅，有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索，可以 采用复印、缩印或其他方法保存学位论文。 学位论文作者签名：矧、云导师签名：锻 日期：圳d 年6 月 日日期沙7 扩年多月7 日 中山大学硕士学位论文幌伞枫对薇甘菊种子的化感作用 1 1 植物化感 1 1 1 化感作用概述 第一章前言 生态学是研究生物和生物之间、以及生物和非生物环境之间相互关系及其作 用规律的科学。其中对于化学生态学，也就是生物间的化学联系和机制的研究近 几十年来成为热点。化学生态学中对于植物和植物之间以及植物和微生物之间的 研究形成了化感作用。 化感作用是一门古老又年轻的科学，因为希腊学者早在公元前就记载了这一 现象，说它年轻是因为化感直到近代才真正被人们认识。公元1 世纪，罗马博物 学家p l i n y 在自然历史一书中记载了胡桃树的化感作用现象，胡桃树下的植 物不能生长。这个事件一直是个迷，直到2 0 世纪3 0 年代才发现胡桃树的树叶和 树皮可以释放葡萄糖苷胡桃醌。这种水溶性的物质随着雨雾的淋溶进入到土壤 中，被土壤中的微生物水解成有毒的胡桃醌而杀死了树下的植物。化感作用，或 者说植物的相生相克作用，由奥地利科学家m o l i s h 在1 9 3 7 年首次提出，他将化 感作用定义为植物之间( 包括微生物) 作用的相互生物化学关系，这种生物化学 关系包括有益的和有害的两个方面。1 9 7 4 年，r i c e 出版植物化感作用方面的著 作a l l e l o p a t h y ) ) ，将化感作用定义为：一种植物通过向环境释放化学物质而对 其他植物( 包括微生物) 所产生的直接或间接的伤害作用。r i c e 的著作推动了化 感作用的研究。后来人们又发现，植物释放的化学物质不仅对别的植物产生伤害， 有的时候也会对自己产生损害。而且这些化学物质并不是完全有害的，可能会随 着浓度和条件的不同而产生有益或者有害的作用。1 9 8 4 年，r i c e 在( ( a l l e l o p a t h y ) ) 再版中，将有益的作用和自毒作用添加到化感作用的定义中。因此，植物化感作 1 中山大学硕士学位论文 幌伞枫对薇甘菊种子的化感作用 用( a l l e l o p a t h y ) ，是指植物( 含微生物) 通过向环境中释放化感物质而对其它植 物或微生物产生有益或有害的作用，包括自毒作用( r i c e ，1 9 8 4 ) 化感作用的定义反映了化感作用的三个基本特征： 1 相互作用的主客体是植物或者微生物，不包括植物和动物及其他有机体的相 互作用； 2 相互间作用的化学物质是植物的次生物质，并且必须通过合适的途径进入环 境中，植物体内变化转运的次生物质不包括在内； 3 主要用于影响自身和邻近植物的生长发育的次生物质才属于化感作用范畴， 其他方面如用于植物间化学通讯或污染环境不属于化感作用基本定义范围 ( 孔垂华，1 9 9 8 ) 。 植物化感作用是通过向环境释放化学物质而实现的，这些起作用的化学物质 称为化感物质( a l l e l o c h e m i c a l ) 。植物化感物质主要是植物次生代谢物质，极少 数是一些基本代谢物质，它们必须是植物中能够通过合适途径进入环境的天然产 物，而且一般为分子量较小，结构较简单的小分子有机物。这些物质仅仅在很小 范围内产生效应，如根际、叶冠范围。r i c e ( 1 9 8 4 ) 把化感物质归纳为以下1 5 类： a ) 水溶性有机酸、直链醇、脂肪族醛和酮； b ) 简单不饱和内酯； c ) 长链脂肪酸和多炔； d ) 醌类； e ) 酚、甲酸及其衍生物； 0肉桂酸及其衍生物； 曲氨基酸和多肽； h ) 生物碱和氰醇； i )黄酮类； j ) 香豆素类； k ) 单宁； 1 )内萜； m ) 硫物和芥子油苷； 2 中山大学硕士学位论文幌伞枫对薇甘菊种子的化感作用 n ) 嘌呤和核苷； o ) 其他化合物。 酚类和类萜是高等植物的主要化感物质。i n d e r j i t ( 19 9 8 ) 等发现p l u c h e a l a n c e o l a t a 淋溶物抑制近1 0 种作物的生长发育，淋溶物中含有毒性的化感物质， 其叶和根在土壤中降解产生像普通酚酸和糖苷的多酚化合物。豆科牧草水浸提 液中存在9 种酚酸，酚酸类物质的化感作用强弱因种类不同而有显著差异，但均 随浓度升高而加强，并且显著地抑制多花黑麦草( l o l i u mm u l t i f l o r u ml ) 幼苗 根生长( 邬彩霞，2 0 0 7 ) 。香茅( c y m b o p o g o nc i t r a t u s ( d c ) s t a p f ) 挥发物对玉米 和稗草幼苗的生物量、根长及苗高均产生显著抑制，g c m s 分析挥发物成分， 其中存在较多的萜类化合物，茎叶挥发物中有2 个单萜，9 个倍半萜，根挥发物 全部为倍半萜( 黎华寿，2 0 0 5 ) 。 化感物质分布于植物根、茎、叶、花、果实或种子中，在自然条件下，植物 化感物质通过4 种途径进入环境： 从茎叶淋溶：由于雨水或雾滴的作用，一些有机酸、氨基酸、萜类和酚类等 水溶性化合物易被从活体植株表面淋溶下来，更多的化感物质从植物残体中淋溶 出来，对周围植物产生影响。如香桃木属、桉属和臭椿属等，从叶面冲洗下来的 酚类化感物质( 对羟基苯甲酸、香草酸、阿魏酸) 对亚麻( l i n u ms p p ) 的生长有明显 的抑制作用( 李善林等，1 9 9 6 ) 。 挥发：一些挥发性化感物质( 主要是萜类) 通过植物的茎叶、花进入生境，从 而产生或促进或抑制的化感作用。如美国加州蒿( a r t e m i s i a c a l i f o r n i c a ) 是芳香 类植物，叶中富含萜类化合物，由于不断挥发，在这些植物周围形成了萜类“云”， 可抑制周围其它杂草的生长( d a v i de ta 1 ，1 9 9 8 ) 。 根系分泌：很多化感物质是从根分泌出来的。c h o u ( 1 9 9 8 ) 等发现，水稻 连作时，根分泌出大量的酚酸类物质，抑制水稻根系的正常生长，造成水稻减产。 植物残体分解：植物及其器官死后，残体经微生物分解而释放出化感物质， 被分解为小分子的醛、酮和醇类化合物，抑制周围植物的生长萌发。蕨( p t e r i d i u m a q u i l i n u m ) 有很强的化感作用，使一些草本植物在其之间很难生存，这种化感物 质主要是阿魏酸和咖啡酸，是由蕨类植物的枯死枝叶腐烂后释放出来的( d a v i de t 口f ，1 9 9 8 ) 。 3 中山大学硕士学位论文幌伞枫对薇甘菊种子的化感作用 1 1 2 化感作用对植物的作用机理 化感物质经过环境媒介到达植物体内，通过对植物生长发育的生理生化过程 的影响而损害或促进植物生长发育，从而表现出化感效应。化感物质可能影响植 物的很多基本代谢过程和生长调节系统，作用机制和浓度有关。化感作用对植物 的作用机理，主要表现在以下几个方面： 1 1 2 1 影响植物的生长调节 化感作用会影响植物细胞生长和分化、植物激素的相互作用、生物酶的合成 和功能三方面。香豆素抑制萝卜根分化细胞的伸长( a l i o t t a ，c t l 9 9 3 ) 。水稻的 化感物质羟基苯甲酸、酚类化合物等通过影响吲哚乙酸和赤霉素的代谢，使得杂 草的根、茎伸长受影响( 徐正浩等，2 0 0 3 ) 。水稻叶片浸提液不同程度地提高了 受体杂草中吲哚乙酸氧化酶的活性，使吲哚乙酸( i a a ) 的水平降低，最终影响了 作物的生长( 何华勤等，2 0 0 1 ) 。三裂叶蟛蜞菊抑制水稻种子萌发，其原理是三 裂叶蟛蜞菊水提液降低水稻种子中包括0 【一淀粉酶在内的各种水解酶的活性、抑 制种子内含物的降解。( 聂呈荣等，2 0 0 4 ) 。苯甲酸、肉桂酸通过改变膜上脂酶活 性、抑制过氧化氢酶和过氧化物酶活性来完成对大豆根细胞膜的破坏 ( b a z i v a m a k e n g ae ta 1 ，1 9 9 5 ) 。 1 1 2 2 影响植物对水分和营养的吸收利用 植物与水分间的关系常常是反映化感物质作用效应的敏感指标之一。 b a r k o s k y ( 1 9 9 3 ) 对水杨酸与水分间效应的研究表明，作物长期处于化感物质临 界浓度的环境中，会导致植物吸收、利用水分的能力下降。b a z i v a m a k e n g a ( 1 9 9 5 ) 认为，化感物质降低了细胞膜中巯基的含量，膜的完整性被破坏，导致根减少对 养分吸收，细胞内物质的向外渗漏。水杨酸在较高水平时( 1 0m m o l l ) 就会改 变质膜结构和渗透性，导致膜功能丧失，对k + 吸收减少，同时增加k + 的外渗。 c r i s t i n e 等( 1 9 9 2 ) 研究了酚酸对玉米吸收氮素营养的影响，结果表明酚酸 4 中山大学硕士学位论文幌伞枫对薇甘菊种子的化感作用 抑制了硝态氮和铵态氮的利用，与此同时降低了c l 。和k + 的吸收。e i n h e l l i g ( 1 9 8 6 ) 研究报道，许多化感物质，苹果酸、氢醌、胡桃醌、肉桂酸、柚皮苷、四羟基黄 酮、金雀异黄素和根皮苷等对植物根部矿质营养的吸收都产生显著影响。苹果酸 和肉桂酸抑制大麦根对p 0 4 3 - 和k + 的吸收，高浓度的水杨酸几乎使燕麦根对k + 的吸收完全停止。 1 1 2 3 影响植物的光合作用 化感作用对植物体光合作用的影响主要表现为叶绿素含量和光合速率的降 低。i n d e r j i t 等( 1 9 9 2 ) 发现：酚酸能降低长豇豆叶绿素a 和叶绿素b 的比例， 使其更有效地吸收可见光谱，提高光合作用速率。胡桃醌和s o r g o l e o n e 是叶绿 素中c 0 2 伴体氧释放的强大抑制剂，通过研究s o r g o l e o n e 在马铃薯和s e n e c i o v u l g a r i s 等植物光合作用影响时发现：s o r g o l e o n e 不仅有效的抑制氧的释放，而 且是一个三嗪键合位的竞争抑制剂，它主要是通过抑制光合系统i i 中电子转移反 应，能有效地抑制光合系统i i 中q a 和q b 位之间电子的转移( g o n z a l e z e t a l ， 】9 8 】) 。 1 1 2 4 影响植物的呼吸作用及其蛋白质和核酸代谢 现有的很多研究发现化感物质可以影响植物呼吸作用的许多过程。h e j le ta 1 ( 1 9 9 3 ) 研究发现胡桃醌能诱导植物正常的呼吸作用途径发生改变，而 s o r g o l e o n e 则能够阻断线粒体电子在细胞色素b 和c 配合物之间的流动。许多化 感物质还会影响植物蛋白质的合成以及d n a 、r n a 的代谢。5 0 u m o l l 浓度的阿 魏酸和肉桂酸使莴苣幼苗的蛋白质合成显著减少，l u m o l l 阿魏酸可以影响细胞 悬浮体中氨基酸生成蛋白质的过程( m e r s i e ，1 9 9 3 ) 。毛莨科作物对小麦发芽具有 明显的化感作用，阻碍小麦的淀粉的运转，抑制d n a 、r n a 和蛋白质的合成 ( b a n s a le ta 1 ，1 9 9 7 ) 。 李寿田等( 2 0 0 1 ) 综合国内外研究结果，总结出化感物质的作用机理，植物 化感作用有可能最先对膜产生伤害，再通过细胞膜上的靶位点，将化感物质胁迫 5 中山大学硕士学位论文幌伞枫对薇甘菊种子的化感作用 的信息从细胞外传送到细胞内，从而对激素、离子吸收等产生影响，使之改变。 激素、水分状况离子吸收以及变化又会引起植物细胞分裂、光合作用等的变化， 从而对植物的生长产生抑制或者促进作用，化感物质的作用机理如图所示。 鬟外一威幕缓一羹一 缓藤分鞭和姊长 l 辘钧熏妖岌舞椰捌 图1 1 植物化感作用机理示意图( 引自李寿田) 1 1 3 植物化感作用的研究方法 化感作用的研究涉及生态系统的多个方面，根据研究的重点不同，又有不同 的研究方法。要确证化感现象存在的关键在于化感物质的分离和鉴定，并通过生 物活性测定进一步验证。化感作用有别于植物对养分、水分、光照和空间等有限 资源的竞争，因此，主要采用模拟实验并结合田问试验的方法进行研究( 阎飞等， 2 0 0 0 ) 。 1 1 3 1 模拟实验 室内培养实验可以排除季节、气候等外界因素的影响，通过精确控制的试验 设计，可能会排除土壤的干扰，以及同一生境下多种植物的相互干涉，并可根据 需要来研究某些植物的直接化感作用。一般主要利用水培、砂培和组织培养等方 6 中山大学硕士学位论文 幌伞枫对薇甘菊种子的化感作用 法( 阎飞等，2 0 0 0 ) 。 ( 1 ) 阶梯栽培法 运用循环营养液砂培，将盆钵布置成阶梯状，连续交替种植两种植物，排除 光照和养分竞争的影响，来研究其相互影响( 阎飞等，2 0 0 0 ) 。 ( 2 ) 根渗出液循环栽培法 主要用于疏水性根渗出液的连续收集，唐崇实( 1 9 8 2 ) 用a m b e r l i t e x a d 4 树 脂吸附砂培中植物根所释放的化感物质，既不会吸附营养元素，同时又能保持根 不被扰动。土屋一成等( 1 9 9 0 ) 改进了此种收集方式，制造了化感作用鉴定连续 循环培养装置，将种植有不同种植物的两个培养钵连接成一个互通的体系，排除 植株间对光照和养分的影响，在系统中设置了电脑，可自动调节营养液的p h 值 等，从而可以较好地研究植物之间的化感作用。 ( 3 ) 植物盒法 在琼脂培养基内混植主体植物与受体植物，用透析膜或尼龙网膜将主体植物 的根隔开，在根周围的方格内按一定规律种植受体植物，在较短时间内可鉴定根 系分泌物中的化感作用( f u j i ie ta 1 ，1 9 9 2 ) 。 ( 4 ) 试管苗法 将各种不同的外植体，经组织培养获得和母体植株遗传性完全相同的小植株， 或通过培养植物细胞和组织，获得大量与母体相同的次生代谢产物，再通过试管 苗交叉接种，就能直接观察植物的化感作用( 靳月华等，1 9 8 6 ) 。 1 1 3 2 田间试验 室内实验的科研结果在田间条件下很少显示( i n d e r j i te ta 1 ，2 0 0 3 ；a n d r e w , 1 9 9 8 ) ，这可能是因为田间真实的自然状况较复杂，实验室内很难完全模拟田间 条件( w i l l a m s o n ，1 9 9 0 ) 。所以，实验室的模拟实验可以评估某种植物是否具有 化感作用潜能，而田间实验作为室内实验的有效补充，可以确认其被观察的化感 作用能否表达出来。田间试验主要采用添加栽培法和置换栽培法( 藤井义晴， 1 9 9 0 ) 。添加栽培法是将两种植物混植，固定一种植物的种植密度，而变化另一 7 中山大学硕士学位论文幌伞枫对薇甘菊种子的化感作用 种植物的种植密度的栽培法；置换栽培法是将两种植物混植，固定总的种植密度， 而改变种植比例的栽培方法( 阎飞等，2 0 0 0 ) 。 1 1 3 3 化感物质的提取分离和鉴定 1 1 3 3 1 化感物质的提取 由于化感物质的释放途径不同及研究物质种类的侧重面不同，化感物质的收 集方法也不同。 ( 1 ) 淋溶物或浸提物 以待测植株部分或其残体及其周围相关的土壤环境作为生物测定材料，采用 水淋溶或浸提，然后收集淋溶液或浸提液，进行过滤、浓缩、配成需要的浓度， 最后进行生物测定f 吴辉等，1 9 9 2 ) 。 ( 2 ) 挥发物 以叶片为原材料，运用蒸馏法、顶空收集法、吸附剂收集法、热脱附收集法 对挥发性成分进行取样。 ( 3 ) 根分泌物 将植物栽种在无菌水、培养液或固体介质中，培养一段时间后，取培养液分 析底物，如常用的疏水性根分泌物连续收集法。 ( 4 ) 植株残体 通过厌氧腐解法。将植物残体加入到含有与土壤营养成分相近的营养液中， 加入土壤，厌氧条件下腐解，定期采集腐解液。 1 3 3 3 2 化感物质的分离和纯化 提取所得到的比较复杂的混合物，必须经过进一步分离和纯化才能进行仪器 检测。 ( 1 ) 萃取法 根据化感物质在两个不相溶或部分互溶的溶剂中的分配( 溶解度) 不同而达 8 中山大学硕士学位论文 幌伞枫对薇甘菊种子的化感作用 到分离纯化的目的。 ( 2 ) 树脂法 根据分离机理的不同，分为交换法和吸附法。交换法是利用阳离子和阴离子 树脂，吸附阴阳离子，无极性或极性较弱的有机分子通过，然后洗脱和提取目标 组分，从而达到纯化的目的；吸附法则是使用吸附树脂( 如岫4 ，x a d 2 或 g d x 1 0 2 树脂以及硅胶等) ，吸附和富集含化感物质在内的一些有机化合物，进 行分离和纯化( y u ，1 9 9 7 ；孙文浩等，1 9 9 2 ) 。 ( 3 ) 层析法 利用混合物中各组分在固定相和流动相中分配平衡常数的差异，在多次反复 平衡过程中，导致各组分在固定相中得到了分离。一般常用纸层析、柱层析、 g c 、h p l c 等方法分离和纯化化感物质( 杨善元等，1 9 9 2 ) 。通过以上方法收集的 溶液，再经过减压蒸馏或冷冻干燥( g r i e r s o ne ta 1 ，1 9 9 2 ) 浓缩待测。 1 3 3 3 3 化感物质的鉴定和检测 根据测定熔点、红外光谱、紫外光谱、质谱和核磁共振谱( 1 h - n m r y ( 1 3 c - n m r ) 等参数，来判断其中存在的功能团、共轭体系、该未知物质的分子量和结构以及 h 原子和c 原子在分子中的结合方式等信息，确定其化学结构，最终根据测定的 结构用己知的标样或合成的标样来鉴定结果( 孙文浩等，1 9 9 2 ) 。 利用现代分析手段g c 、h p l c 和g c 。m s 研究化感物质，其检测水平己达到 p p b 级。g c 分析的物质，其沸点应在5 0 0 。c 以下，分子量要少于4 5 0 ，对热稳定性 差、易于分解、变质以及具有生理活性的物质，都不适合g c 检测，它所分析的 物质占有机物总数的1 5 2 0 ；而h p l c 的使用范围较广，可检测的物质占有机 物总数8 0 8 5 ，但在h p l c 广泛应用的同时，g c 仍然发挥着重要作用( 严衍禄 等，1 9 9 5 ) 。把色谱仪的分离装置作为质谱仪的进样系统，把质谱仪作为色谱仪 的检测系统，即把色谱仪的高分辨率和质谱仪的高鉴别能力结合起来，组成 g c m s 或l c m s 仪器，是目前解决复杂未知物定性问题的最有效工具之一( 阎飞 等，2 0 0 0 ) 。 9 中山大学硕士学位论文幌伞枫对薇甘菊种子的化感作用 1 3 3 4 化感作用的生物测定方法 生物测定( b i o a s s a y ) 也称为毒性实验，指用活的有机体测定某种物质与一 种标准参照系相比较的相对生物活性( 曾任森，1 9 9 9 ) 。在化感物质收集、提取、 纯化和鉴定过程中，每一步都需要通过生物测定对其化感作用潜能进行评估。 1 1 种子萌发 种子萌发的实验是使用最广泛的生物测定方法。萌发计算标准通常是萌发 1 - 2 r a m 以上，测定指标常用萌发率和种子萌发速率等参数。萌发实验受到多种因 素的影响，受体种子的选择既要考虑实验可操作性，又要考虑种子本身的敏感性； 环境条件如温度、湿度、光照、供养、渗透压、p h 值等都会影响萌发，特别是 渗透压和p h 值，实验中调节渗透压和p h 值是必要的；数量不足可能会造成较大 的实验误差，所以需要数量足够多的种子进行重复实验，并作统计分析( 周志红， 1 9 9 9 ) 。 ( 2 ) 根生长 根生长比种子萌发生物测定更灵敏，特别适合于研究化感物对影响细胞生长 的激素的影响，也适合于研究化感物对细胞分裂的影响( 周志红，1 9 9 9 ，b e r t i ne l a 1 ，2 0 0 3 ) 。 ( 3 ) 生长发育 用预先发芽好的种子置于含一定浓度化感作用物的培养基上，根据根和幼苗 的生长增量的多少，可以确定是否受到影响( f u j i i ，1 9 9 2 ) ，还可以同时结合萌发率 和干物重( 生物量) 来衡量幼苗生长受化感作用的影响( 周志红，1 9 9 9 ) 。 ( 4 ) 挥发物的生物测定 采用取回生叶置于密封容器中直接挥发生物测定，或者将受体置于实地群落 中进行实验( 周志红等，1 9 9 9 ) 。但这两种方法可能会因为挥发物的量在短时间内 太少而现象不明显，所以要有选择性的选用不同生物测定方法( 周志红，1 9 9 9 ) 。 1 1 3 植物化感作用的生态影响 1 1 3 1 群落结构 1 0 中山大学硕士学位论文 幌伞枫对薇甘菊种子的化感作用 在自然界中植物的化感作用广泛存在，它与植物对光、水分、养分和空间的 竞争一起构成了植物间的相互作用，影响着植物群落的分布和组成( d a v i de ta 1 ， 1 9 9 8 ) 。化感物质能抑制根系、嫩枝的生长，阻碍林木种苗叶片的伸展。研究发 现杉木自身枝叶水浸液对杉木种子萌发及幼苗生长有一定的抑制作用，而伴生树 种木荷、丝栗栲、毛竹等对杉木种子萌发及幼苗生长则存在一定程度的促进作用 ( 左继林等，2 0 0 4 ) 。 此外，化感物质的存在抑制了周围其他植物的生长，许多植物易于形成单一 植物群落，即使在临近的相类似的生境中有其他一样适应该种生活环境的种类也 难以进入与之共同生长，在一个广泛的地理区域范围内，植物群落主要是由相近 的种类组成。在我国热带亚热带广泛分布的芒萁( d i c r a n o p t e r k 9d i c h o t o m a ) ，常 形成中生性的草本植物群落及镶嵌分布的小群落，叶居新等( 1 9 8 7 ) 实验表明， 芒萁对其周围自然分布的苜蓿及禾木科草类等具有化感抑制作用。 1 1 3 2 群落演替 一般认为植物演替是由于植物生境中的物理因素、光、温度、水、营养以及 植物间的竞争造成的，很少考虑化学因素。r i c e ( 1 9 8 4 ) 通过在美国俄克拉荷马 草原植被研究表明，化感作用在植物演替中起着不可替代的作用。一年生禾草向 多年生禾草演替阶段，因为一年生禾草分泌的化感物质使土壤中硝化细菌与固氮 菌的生长受到，土壤中氮素积累减慢，造成需氮量高的多年生禾草难以生存。如 果向牧场中人工增加氮肥，可以加速这一演替过程，使得废弃地能迅速恢复成优 良的牧场。 1 1 3 3 生物入侵 近几年，从化感作用的角度探索外来植物的入侵机制成为一个热点( h i e r r o e ta l ，2 0 0 3 ；b a i se la 1 ，2 0 0 3 ；c a l l a w a ye ta 1 ，2 0 0 0 ) 。c a l l a w a y 和r i d e n o u r ( 2 0 0 4 ) 提出了“新武器假说”( n o v e lw e a p o nh y p o t h e s i s ) ，即某些外来入侵植物 能产生一些化学物质，它们可以发挥较强的化感作用或者成为植物和土壤微生物 中山大学硕士学位论文 幌伞枫对薇甘菊种子的化感作用 之间相互作用的调节者，由于不同区域的植物群落共同进化的轨迹不同，被入侵 群落的植物对这些化学物质缺乏适应性，因此，这些物质就成了外来种入侵的利 器( v i v a n e oe ta 1 ，2 0 0 4 ) 。 目前许多外来杂草都被证明有化感作用。豚草m b r o s i aa r t e m i s i i f o l i a ) 在自 然条件下通过挥发、茎叶雨水淋溶和根分泌释放出化学物质对邻近和伴生植物产 生显著的化感作用( 王大力等，1 9 9 6 ) 。胜红蓟( a g e r a t u mc o n y z o i d e s ) 侵入农林系 统后可以释放各种化感物质抑制其它植物种子的萌发和生长发育( 孔垂华等， 1 9 9 7 ) ，是一种非常典型的化感杂草( k o n ge ta 1 ，1 9 9 9 ) 。在我国广东省珠江三 角地区，被称为“植物杀手”的微甘菊能释放化感物质影响邻近植物的生长( 邵华 等，2 0 0 3 ) 。 原产亚欧大陆的植物c e n t a u r e ad i f f u s a 传入北美洲后成为入侵杂草，排挤许 多当地植物种，在北美蔓延成灾。栽培实验结果表明( c a l l a w a ye ta 1 ，2 0 0 0 ) ， cd i f f u s a 在北美能通过根部分泌化感物质抑制入侵地伴生植物的生长，从而达 到排挤当地植物种的目的。研究同时也证实，cd i f f u s a 在原产地亚欧大陆不能 蔓延成灾是因为原产地与其伴生的植物根分泌的化感物质抑制了cd i f f u s a 根系 对磷的吸收，导致其生长受到抑制。 1 1 4 植物化感作用的应用及意义 1 1 4 1 植物化感作用在农林业生态系统中的应用 化感作用在农业生产中应用极为广泛，无论是作物的单一种植，还是作物轮 作，间作，覆盖，翻埋，重茬种植，都需要考虑化感作用的影响( a n a y a ，1 9 9 9 ) 。 生产实践中有些作物种植在一起可以提高产量，而有些作物间作时则出现减产， 充分的认识各种栽培植物之间的化感是抑制或是促进，有助于合理安育种排农业 布局( 吕福堂等，2 0 0 5 ) 。如玉米花粉可以显著的降低西瓜( c i t r u l l u sl a n a t u s ) 的产量。将香蕉瓜和玉米或大豆( g l y c i n em a x ) 混作，香蕉瓜释放的化感物质既 可以能够控制杂草，又可以提高玉米和大豆的产量( a n a y a ，1 9 8 7 ) 。在现代农 业生产当中，作物的自毒作用和种间的化感作用可能会成为限制农林产品高产优 1 2 中山大学硕士学位论文幌伞枫对薇甘菊种子的化感作用 质的主要因子。如在大棚蔬菜生产中，番茄( l y c o p e r s i c o ne s c u l e n t u m ) 的挥发物 在大棚中聚集，会使黄瓜( c u c u m i ss a t i v u s ) 产量迅速降低。同样在水培种植方 式中，大量根分泌的化感物质水培液中积累，造成化感浓度变高，对自身产生毒 害作用，而在野外的化感物质可以被土壤吸收或降解。因此，在以大棚和水培方 式进行生产时，混作作物种间的化感作用或单作作物的自毒作用都会显著增强 ( 吕福堂等，2 0 0 5 ) 。 混交林与单纯林相比在林分稳定性、抗御病虫害以及发挥森林多种效益方面 表现出明显优势( 沈国舫等，1 9 9 7 ) 。化感作用在营造混交林中发挥重要作用( 翟 明普等，1 9 9 3 ) 。陈跃红等的研究表明，马尾松与刺栲混交可以促进刺栲的吸收 能力。 1 1 4 2 进行杂草生物防治和病虫害控制 利用化感作用进行杂草防除是一项潜力巨大和前景广阔的新途径和有效措 施j 最常使用的方法是覆盖作物残茬，常用品种有小麦、高粱等，有两种方法， ( 1 ) 在轮作中利用先期种植植物的化感作用抑制杂草，( 2 ) 用具化感作用的植 物材料作种覆物进行杂草控制，但是也要小心化感作物对下茬的自毒作用，充分 掌握作物化感作用的规律，克服化感负效应，达到控制杂草的目的；也可以通过 选育种植对杂草化感作用强的作物品种；此外，通过问混种对杂草有抑制作用或 控制病虫害的作物或不以本身收获为目的的伴生植物，也是利用化感作用进行杂 草生物防治和病虫害控制的一种有效措施。常见抑制杂草的作物有向日葵、高粱、 黑麦和燕麦等。豆科植物中增加野生天芥菜不仅可使杂草减少3 0 - - 7 0 ，同时 还减少病虫害。g o7 i t i e z r o d r l7 9 u e z ( 2 0 0 3 ) 的研究表明，金盏菊( t a g e 胞se r e c t a ) 与西红柿( l y c o p e r s i c o ne s c u l e n t u m ) 间种时，金盏菊通过化感作用抑制病菌孢子的 萌发，与此同时在西红柿周边形成物理障碍以及相对湿度较大的微环境，营造不 利病菌的生存和扩散的环境显著抑制了常见的西红柿枯萎病，x u a n ( 2 0 0 5 ) 总结了他们十年的研究，研究中选取了三十多种具有较强化感作用的植物，用这 些植物材料作覆盖残茬，以1 2t h m 1 施于实验稻田，结果使稻田杂草生物量减 少了7 0 ，水稻产量增加了2 0 ，可见利用植物化感作用进行杂草生物防治和 1 3 中山大学硕士学位论文幌伞枫对薇甘菊种子的化感作用 病虫害控制具有良好的发展前景。 但同时我们要知道，利用作物的化感作用，无论是覆盖还是建立轮作和多作 农业生态系统来控制杂草，都不能利用化感作用1 0 0 控制杂草，还需要辅助其 他的控制杂草的方法，包括化学除草方法。因此，利用化感作用控制杂草能降低 化学除草剂的使用，减低对农业生态系统的投入，并能有效控制杂草的方法之一。 1 1 4 3 指导作物育种 在许多植物中，存在着具有化感作用的品种，因此充分研究和鉴定化感种质 资源，选育能够抵抗有害生物和杂草的作物品种，最大限度地减少农田生态系统 中化学农药的使用，是育种研究的重要方向。一般而言，开发作物化感品种主要 表现在两个方面：培育非自毒性的化感品种，这主要是针对那些自毒作用较强的 作物，开发出非自毒的作物品种，使连作障碍减少；培育能够自身控制杂草的化 感品种，以减少对化学除草剂的依赖。 作物化感品种的开发研究具有重要的应用价值，不仅高粱( s o r g h u m b i c o l o r ) 、大麦( h o r d e u mv u l g a r e ) 、燕麦( a v e n as a t i v a ) 、向日葵( h e l i a n t h u sa n n u u s ) 和黑麦( s e c a l ec e r e a l e ) 等作物具有控制杂草的化感作用，一些主要粮食作物如 小麦、水稻等也有很多品种具有控制杂草的化感作用。最近，具有化感特性的杂 交稻研究表明( k i me ta l ，2 0 0 0 ) ，以具有化感特性的水稻品种( k o u b e t s um o c h i ) 为化感基因供体，具有恢复基因的i r 2 4 品种为轮回亲本，通过回交将化感特性 转入i r 2 4 中，在b 2 f 6 得到优良的具有化感特性的i r 2 4 恢复系。以具有化感特 性的恢复系和不育系进行杂交制种，得到具有强烈化感和竞争双重能力的杂交 稻，杂交稻的化感作用相比原来种明显增强，表明化感作用具有明显的杂交优势。 具有化感特性的小麦高产优质品种的选育在澳大利亚也取得了实质性的进展 ( w u 甜a l ，1 9 9 9 ) 。 因此，对植物化感作用遗传机理进行研究，找出控制植物化感作用的某个或 某些基因，经过某些基因技术处理，例如对其基因序列进行修饰等，再转入该植 物或其他植物，对其化感作用表达进行调控。将植物化感作用与基因工程技术相 结合，将是一个很有发展