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三种酚类环境激素物质的检测新方法的研究 摘要 环境激素又称为内分泌干扰物，是一种由于人类的生产和生活活 动而释放到周围环境中的，对人体内和动物体内原本营造的正常激素 功能施加影响，从而影响内分泌系统的化学物质。它们能影响人类等 多种生物的生殖功能与发育系统，降低生殖和免疫能力，导致神经系 统失调及多种生理异常。近年来，环境激素问题已经成为继温室效应、 臭氧层破坏之后的第三大环境问题，对其筛选及检测方法的研究，现 已成为环境科学研究的热点领域之一。 本文研究了检测环境激素中双酚a ( b p a ) 和2 , 4 ，6 一三氯苯酚( t c p ) 的荧光免疫分析法及检测对叔丁基苯酚的流动注射化学发光法。这两 种方法用于检测这三种环境激素物质均可达到比较理想的效果。 通过制备b p a 和t c p 的特异性抗体，建立荧光免疫分析法。先 在半抗原b p a 和t c p 分子上引入羧基，然后将这两种半抗原与载体 蛋白牛血清( b s a ) 偶联，合成全抗原。对合成的抗原进行紫外光谱扫 描，确证偶联成功。在优化免疫学发应条件后，建立了测定b p a 的 抗原包被荧光免疫分析法和测定t c p 的直接竞争荧光免疫分析法。 采用抗原包被荧光免疫分析法测定b p a ，线性范围为 1 0 7 - 1 0 4 m g m l ，检出限i c 2 0 为3 x 1 0 4m g m l 。并将该法用于测定桶 装饮用水和河水中的b p a ，回收率在9 6 , 1 0 8 之间。这种方法灵敏 度高、选择性好、线性范围宽，效果理想。 采用f i t c 标记自制抗体，建立直接竞争荧光免疫分析法测定 t c p ，线性范围为1 0 屯5 x 1 0 。4 m g m l ，检出限i c 2 0 为2 4 x 1 0 6 m g m l 。 并将该法用于测定自来水和河水中的t c p ，回收率在9 5 , 一1 0 6 之 间，结果令人满意。 采用流动注射技术研究了在碱性条件下l u m i n 0 1 h 2 0 2 与对叔丁 基苯酚的化学发光行为。对影响化学发光强度的诸因素进行了优化， 建立了测定对叔丁基苯酚的流动注射化学发光新方法。方法的检出限 为4 x 1 0 m g m l ，线性范围为2 x 1 0 击l x l 0 4m g m l ，对浓度为1 0 巧 m g m l 对叔丁基苯酚进行1 1 次平行测定，相对标准偏差为1 4 5 。 该法用于测定水中对叔丁基苯酚的含量灵敏度高，精密度、准确度好， 线性范围宽，检出限低，操作简便、快速，结果令人满意。 关键词：环境激素，双酚a ，2 , 4 ，6 三氯酚，对叔丁基苯酚，荧光免 疫法，流动注射，化学发光 r e s e a r c ho nt h en e wm e t h o d sf o r t h ed e t e r m i n a t i o no f t h r e ep h e n o l i ce n v i r o n m e n t a lh o r m o n e s a b s t r a c t e n v i r o n m e n t a lh o r m o n e s ，a l s oc a l l e de n v i r o n m e n t a le n d o c r i n e d i s r u p t i o nc h e m i c a l s a c t 鹊e s t r o g e n si nh u m a na n da n i m a lb o d i e s m o s to ft h e ma r ed i s c h a r g e di n t ot h ee n v i r o n m e n tw i t ht h ep r o d u c t i o n a n dt h el i f eo ft h eh u m a n i t y i th a sb e e nf o u n dt h a te n v i r o n m e n t a l h o r m o n e se x i s t i n gi nt h ee n v i r o n m e n th a v ea d v e r s ee f f e c t so ne n d o c d n e s y s t e m si nh u m a na n da n i m a l sa n dl e a dt or e p r o d u c t i v e ，d e v e l o p m e n t a l a n db e h a v i o r a ld i s o r d e r i nr e c e n ty e a r s ，e n v i r o n m e n t a lh o r m o n e sh a v e b e c o m et h et h i r de n v i r o n m e n t a lp r o b l e ma f t e rt h eg l o b a lw a r m i n ga n d o z o n o s p h e r ed e s t r u c t i o n n o wt h e r e s e a r c ho nt h e s c r e e n i n g a n d d e t e r m i n gt h ee n v i r o n m e n t a lh o r m o n e sh a sb e c o m eo n eo ft h eh o t s p o t s o f e n v i r o n m e n t a ls c i e n c e t w on e wm e t h o d sw e r e r e s e a r c h e di nt h i s p a p e r ： i m m u n o f l u o r e s c e n c em e t h o da n df l o wi n j e c t i o nc h e m i l u m i n e s c e n c e m e t h o d ，b i s p h e n o la ( b p a ) 、2 , 4 ，6 - t r i c h l o r o p h e n o l ( t c p ) a n d p - t e r t - b u t y l p h e n o lw e r ed e t e r m i n e dr e s p e c t i v e l y t h ed e t e r m i n a t i o no f t h e s et h r e ee n v i r o n m e n t a lh o r m o n e sc o u l da c h i e v ec o m p a r a t i v e l yp e r f e c t r e s u l t sb yu s i n gt h e s et w om e t h o d s i m m u n o f l u o r e s c e n c em e t h o dw a sd e v e l o p e df o rt h ea n a l y s i so fb p a a n dt c ef i r s t , t h eh a p t e n so fb p aa n dt c pw e r es y n t h e s i z e d t h e nt h e h a p t e n sw e r ec o n j u g a t e d t o p r o t e i nb s at op r e p a r ea n t i g e n s t h e c o n j u g a t e sw e r ei d e n t i f i e db yt h em e t h o do fu l t r a v i o l e t t h er e s u l t d e m o n s t r a t e dt h a tt h ec o n j u g a t e sw e r es y n t h e s i z e ds u c c e s s f u l l y t h e a n t i b o d i e sw e r eo b t a i n e da f t e rt h r e em o n t h sb yi n j e c t i n gt h ei m m u n o g e n i nr a b b i t s u s i n gt h ep u r i f i e da n t i s e r u mo fh i 。g h e s ts p e c i f i c i t y , a na n t i g e n c o a t e di r n m u n o f l u o r e s c e n c em e t h o da n da d i r e c t c o m p e t i t i v e i m m u n o f l u o r e s c e n c em e t h o dw e r e d e v e l o p e d w i lt h ea n t i g e nc o a t e di m m u n o f l u o r e s c e n c em e t h o d 。b p aw a s d e t e r m i n e di nt h ed r i n k i n gw a t e ra n df i v e rw a t e r t h el i n e a rc a l i b r a t i o n r a n g ew a s1 0 - 7 1 0 4 m g m l ，t h ed e t e c t i o nl i m i ti c 2 0w a s3 x 1 0 7 m g m l a n dt h er e c o v e r i e sw e r eb e t w e e n9 c r 1 0 8 t h er e s u l tw a ss a t i s f a c t o r y w i t ht h ed i r e c tc o m p e t i t i v ei m m u n o f l u o r e s c e n c em e t h o d ，t c pw a s d e t e r m i n e di nt h e 切pw a t e ra n dr i v e rw a t e r t h el i n e a rc a l i b r a t i o nr a n g e w a s1 0 屯5 1 0 4 m e g r n l ，t h ed e t e c t i o nl i m i ti c 2 0w a s2 4 x 1 0 。6 m g n ma n d t h er e c o v e r i e sw e r eb e t w e e n9 5 0 r 1 0 6 t h er e s u l tw a ss a t i s f a c t o r y t h ec h e m i l u m i n e s c e n c e b e h a v i o ro fl u m i n o l h 2 0 2a n d p - t e r t - b u t y l p h e n o li na l k a l i n es o l u t i o nw a sr e s e a r c h e db yf l o wi n j e c t i o n a n a l y s i s t h er e l a t e df a c t o r sa f f e c t i n gc h e m i l u m i n e s c e n c ei n t e n s i t yw e r e o p t i m i z e d t h e m e t h o df o rd e t e r m i n a t i o no fp - t e r t - b u t y l p h e n o lw a s e s t a b l i s h e db yf l o w - i n j e c t i o n - c h e m i l u m i n e s c e n c e t h ed e t e c t i o nl i m i t o b t a i n e dw a s4 x l o m e g m l t h el i n e a rr a n g ew a s2 x l o 石l x l 0 4 m r n l t h er e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o no f1 4 5 w a so b t a i n e db y11 p a r a l l e ld e t e r m i n a t i o n so f1 0 弓m e g m lp - t e r t - b u t y l p h e n 0 1 t h i sm e t h o d w a ss a t i s f a c t o r yf o rt h ed e t e r m i n a t i o no f p - t e r t - b u t y l p h e n o li nw a t e r w a n gl a n ( e n v i r o n m e n t a ls c i e n c ea n de n g i n e e r i n g ) s u p e r v i s e db yp r o f e s s o rz h u a n gh u i s h e n g k e yw o r d s ：e n v i r o n m e n t a l h o r m o n e ， b i s p h e n o l a ， 2 , 4 ，6 - t r i c h l o r o p h e n o l ，p t e r t - b u t y l p h e n o l ，i m m u n o f l u o r e s c e n c em e t h o d ， f l o wi n j e c t i o n , c h e m i l u m i n e s c e n c e 东华大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本 人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已明确注明和引用 的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的 内容。论文为本人亲自撰写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律 结果由本人承担。 学位论文作者签名：王三 日期：2 0 。g 年3 月4 日 东华大学学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留 并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。 本人授权东华大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 保密口，在年解密后适用本版权书。 不保密区 学位论文作者签名： 王兰 日期：2 。年了月斗日 指导教师签名： 日期：年月日 第一章绪论 1 1 环境激素概述 第一章绪论 早在1 9 7 7 年，日本学者就提出了环境激素”这个词，但没有引起广泛的 注意。直到1 9 9 6 年，美国波士顿环境报记者安达玛诺斯基在所著的被 夺去的未来一书中才把环境激素这一概念明确提出来【”。但是，环境激素的产 生却始于2 0 世纪3 0 年代，当时人们采用人工合成的方法生产雌性激素用作药品， 这种合成雌性激素在诞生的同时就被指出有导致恶性肿瘤的危险。随着工业的发 展，大量环境激素在制药、塑料制品添加剂生产、除草剂的使用和垃圾处理等过 程中不断释放，对生态环境造成了巨大危害。环境激素不易分解，可在食物链中 循环，又可随风飘散。因此，不管其原生地在哪里，都会形成区域性或全球性的 威胁，让人闻之色变的二恶英，就是环境激素中的一种 2 1 。 1 1 1 环境激素物质及其种类 环境激素物质，又被称为“环境内分泌扰乱化学物质”、“环境雌激素物质”、 “类激素物质”。环境激素是一类外源性化合物，能干扰人类或野生动物内分泌系 统诸环节并导致异常效应1 3 。随着工业化程度的提高，新生化学物质层出不穷， 迄今为止，约有1 0 0 0 万种化学物质，被人类使用的达8 万多种，怀疑影响人类 健康的约有2 0 0 多种，证明是环境激素的化合物有7 0 多种，其中农药类4 4 种， 金属类3 种，工业用原料类2 2 种。依据其作用功能分为干扰雌激素的环境化学 物、干扰睾酮的环境化学物、干扰甲状腺素的环境化学物等 4 1 。依据其来源分为 人工合成激素、植物性激素、真菌性激素、环境中的激素样物质【5 】。依据其化学 结构分为多氯联苯类，邻苯二甲酸酯类、氯代烃类、芳香族碳化氢类、烷基酚类、 双酚类，联苯酚类、氯酚类、金属类、硝基苯类、呋喃类等。 1 1 2 环境激素的发展历程 环境激素自2 0 世纪3 0 年代起源以来，至今已有7 0 年左右的历史，由于大 第一章绪论 量环境激素不断被释放，给生物和人类自身带来许多危害。引起了世界许多国家 政府、相关学者和有关国际组织的高度重视，被视为继臭氧层破坏、温室效应之 后的又一个全球性的环境问题【6 】。因而以美国为首的一些欧美发达国家开始着力 研究环境激素，其简单研究发展过程如表1 1 所示。 表1 - 1 环境激素的发展历程忉 t a b l e1 - 1t h eh i s t o r yo f e n v i r o n m e n t a lh o r m o n e 时间发展过程 3 0 年代 6 0 年代 1 9 7 1 年 1 9 7 6 矩 s o 年代 1 9 9 1 年 1 9 9 2 焦 1 9 9 3 矩 1 9 9 6 年 1 9 9 6 1 9 9 7 年 首次人工合成雌性激素( d e s ) ，同时指出d e s 有可能导 致恶性肿瘤 寂静的春天在美国出版后，杀虫剂对自然界的影响引起 了人们的广泛关注 d e s 普遍用于预防流产治疗药物 孕期使用过d e s 的母亲所生子女多出现异常，表现为：女性 的性器官异常；子宫癌、阴道癌多发；男性精巢癌多发、精子 数减少 禁止生产p o b 禁止使用d e s 在美国高尔蓬博士主持的美国温斯布来德国际会议上，化学物质 对野生生物、实验动物以及人类自身带来的危害成为多数与会专家 学者的共识 丹麦的斯卡凯贝克教授报道，过去5 0 年问，男性的精子数减少 了一半 发现聚碳酸酯树脂中溶出的双酚a ，微量时具有与雌性激素同等 作用 美国波士顿环境报记者安达玛诺斯基的著作( o u rs t o l e n f u r o r e 一书总结了世界各国学者对环境物质的研究结果，明确提出 “环境激素”一词 日本环境厅、通产省和厚生省携手成立国家环境激素研究委员会 1 9 9 8 年日本成立了“环境激素学会”嘲 2 0 0 1 年签署了关于持久性有机物污染的斯德哥尔摩公约例 1 1 3 环境激素的危害 环境激素不仅作用于动物，而且也能够影响人体健康。人类合成的许多化学 2 第一章绪论 品都具有致癌、致畸、致突变的毒性，8 0 的人类肿瘤与化学品致癌有关。环境 激素对动物体及人类健康的影响主要表现为 1 0 - 1 1 】： ( 1 ) 影响机体正常的内分泌功能：环境激素进入机体，作用于生物体的生殖 腺，造成生殖器官异常，其后果是生殖力降低，特别是母亲在怀孕和哺乳的过程 中，只需要“超微量”的剂量，对于婴幼儿的危害就将可能是毁灭性的和无可挽回 的，所以欧美各国将防治环境激素物质污染的主要保护人群确定为婴幼儿。它们 还可能通过干扰生殖系统和内分泌系统的激素分泌，造成雄性生物体的雌性化， 如精子数减少、精子质量下降、睾丸发育中断、永久性性功能障碍、性别的自我 认知障碍等。 ( 2 ) 影响机体的免疫机能：免疫系统在环境激素的长期作用之下，会发生免 疫失调和病理反应，表现为生物体胸腺重量减少、t 细胞介导的免疫功能下降。 还可能造成儿童的免疫能力、智力和运动能力的永久性障碍，表现为多动症、痴 呆、免疫功能低下等。 ( 3 ) 对生物体的神经系统产生毒害：直接作用于神经系统，可引起行为、精 神的改变，表现为生物体出现行为、学习及记忆障碍，影响注意力、感觉功能和 精神发育异常，影响大脑皮层、下丘脑、脑垂体等对激素分泌的调节作用。 ( 4 ) 致畸、致癌作用：环境激素作用于细胞的染色体，使染色体的数目或结 构发生变化，从而改变携带遗传信息的某些基因，使一些组织、细胞的生长失控， 产生肿瘤，造成d n a 的不可修复性损伤，如它会导致雌性生物体的子宫、乳腺 癌变畸形等。 ( 5 ) 蓄积和生物放大作用：环境污染物进人机体的速度和数量超过机体消除 的速度或数量，造成环境污染物在体内不断积累的作用，在机体内的浓度会随着 营养级的提高而逐步增大。 1 1 4 环境激素的作用机理【1 2 】 激素在生物体内发挥作用的大致过程是：由内分泌腺分泌激素；通过体 液输送到目的地；与靶细胞上的受体相结合；向靶细胞发出遗传基因指令； 引起靶细胞产生特殊效应调节控制各种物质代谢和生理功能。环境激素则 可作用于上述过程中的某一环节，并产生负面影响。研究表明，环境激素可与雌 第一章绪论 激素的受体相结合，并导致雌激素的异常合成，释放和运输。例如，化学物质一 旦粘附于理应结合雌性激素的受体后，该细胞就误认为接受到了雌激素，从而使 机体趋于雌性化，或出现性早熟，或出现生殖系统功能异常等。 通俗地讲环境激素扰乱人体自身激素的作用过程就是一种冒名顶替的过程。 它一旦和激素插口连接起来，就阻挡了人体自身激素与插口的连接，达到了鸠占 鹊巢以假乱真的地步。 形象地讲，激素与接受体的关系就想钥匙和锁一样。原配的钥匙( 自身激素) 可以开锁，加配的钥匙( 环境激素) 也同样可以开锁。环境激素的破坏作用就好 像盗贼用偷配的钥匙打开了一把锁。环境激素这把后来加配的钥匙，插到了激素 接受对象的钥匙孔内，致使人体自身激素无法进入结合状态。 i i 5 环境激素危害的预防【1 3 - 1 4 1 环境激素广泛的存在于我们的生活中，为了将它的危害降到最小，我们应采 取积极对策，加强自我保护。 ( 1 ) 不用聚氯乙烯、苯乙烯、聚碳酸酯的材料包装食品。方便面容器9 0 的 成分是苯乙烯，遇热水溶出，有致癌性，用微波炉加热聚氯乙烯容器会渗出双酚 a 。 ( 2 ) 避免食用近海鱼。小鱼和微生物摄取了海中的化学物质，由于食物链的 作用，大型鱼类体内浓缩的化学物质非常多。在日本，人们通过食物链摄取的二 恶英总量中，约6 0 来自鱼类。 ( 3 ) 慎用人工激素类物质，这些药物可通过人的尿液进入天然水体，其导致 的环境效应是双酚a 的一万倍。 ( 4 ) 不购买塑料制婴幼儿用品。在聚碳酸酯制奶瓶中倒入开水后检测发现， 水中双酚a 的含量达到3 1 5 5 p g k g 。另外，目前大部分玩具也使用了聚氯乙 烯。为了使聚氯乙烯变软而使用的柔软剂邻苯二甲酸酯化舍物，是具有代表性的 环境激素。 ( 5 ) 服装和被褥尽可能使用天然纤维制品，避免使用具有防雷、防臭效果的 “抗菌了2 品，尤其是那些使用了有机抗菌剂的产品。特别是被褥和内衣，与皮肤 接触的时间越长，化学物质可能通过皮肤进人人体，顺着血液渗透到全身。 4 第一章绪论 ( 6 ) 尽量少用或不用化学材料制作的家庭内部装修材料，不要长时间呆在新 装修过的房间里。家庭养花不宜大量采用杀虫剂、杀菌剂和除草剂。尽量少用家 庭衣服防虫剂和杀虫剂、驱蚊剂等。减少合成洗涤剂的使用量，因为其中有表面 活性剂，大多数表面活性剂的成分都与环境激素有关。 ( 7 ) 严格监控乳品中的激素含量。一些配合饲料中含有激素，直接危害人体。 ( 8 ) 大量食用谷物和黄绿叶菜。因为糙米、芥菜、菠菜、萝卜、小米、黄米 和元白菜等是容易使二恶英从体内排出的食物。同时，注意保持食物多样性，用 平衡食物方法，分散环境激素的危害性。 1 2 酚类环境激素概述 1 2 1 酚类环境激素的分类及用途 含羟基的酚类化合物是具有代表性的一类环境激素。到目前为止，已经列入 环境激素的典型酚类化学物质主要为：烷基酚( a l k y l p h e n o l s , a p s ) 、氯酚 ( c h l o r o p h e n o l s ，c p s ) 、双酚a ( b i s p h c n o la ，b p a ) 、羟基联苯( h y d r o x yb i p h e n y l ) 等。其中烷基酚类包括：4 - 壬基酚、4 一辛基酚、4 - 叔辛基酚、2 一叔丁基酚、2 一 仲丁基酚、4 一仲丁基酚、4 一叔丁基酚、4 一乙基酚等；氯酚类包括：五氯酚、2 , 4 一 二氯酚、2 , 4 ，6 一三氯酚等；羟基联苯类包括：2 一羟基联苯、3 一羟基联苯、4 一羟基 联苯等【”】。 这些酚类环境激素有些是表面活性剂，有些为农药中除草剂类化学物质。烷 基酚大量用于合成非离子表面活性剂烷基苯酚聚氧乙烯醚，烷基苯酚聚氧乙烯醚 广泛应用于洗涤用品和工业加工助剂中，毒理实验证明烷基酚具有雌激素效应 【1 6 1 。双酚a 是生产聚碳酸酯和环氧树脂的重要原料，早在1 9 3 8 年d o d d s 和 l a w a o n 发现双酚a 使切除卵巢的老鼠产生雌激素，1 9 9 3 年双酚a 被归为环境 激素一类【m 。氯酚大量用作防腐剂、农药杀菌剂或杀虫剂，对生物体都具有毒害 作用，而且毒性随着含氯度的增加而明显提高【1 8 】。动物实验表明酚类物质能干 扰雌激素和睾酮，影响生殖发育，是一类较为典型的环境激素。 第一章绪论 1 2 2 酚类环境激素的检测方法 由于酚类环境激素在环境污染中具有“低剂量，长时问”的特性，因此，直 接检测往往比较困难。目前用于检测残留酚类物质的方法有：紫外分光光度法 1 9 - 2 0 、荧光分光光度法l 2 1 - 2 2 、示波极谱法 2 3 - 2 4 1 、生物传感器法【2 5 1 、气相色谱法 ( g c ) 瞄叨、高效液相色谱法( h p l c ) 2 8 - 2 9 1 、色谱质谱联机法1 3 0 - 3 2 1 、免疫分析法 3 3 - 3 5 等。 使用气相色谱法，可以一次进样，使多组份酚类物质得到完全分离、定性和 定量，可使分析快速，结果可靠；液相色谱法是以液体作流动相，省去了气相色 谱法的衍生化手续且不需专用液相色谱柱，是近代色谱技术中最受重视的分析技 术之一，具有高速化和高效化的特点；而用g c m s 法测定获得了较高的灵敏 度和选择性。虽然使用色谱法测定有机污染物不仅灵敏度高、精确度好，而且能 分别测定结构相似的多种化合物及异构体，但这类分析方法体系中将待测物从样 品中分离提取并去除共存杂质干扰的前处理过程十分复杂，需经提取、净化、浓 缩和衍生等复杂的样品前处理，对实验室和仪器化程度要求高，并且操作费时， 分析成本昂贵，不利于推广使用，难以适应大量样本和现场检测的要求。而免疫 分析法不受周围环境和样本内干扰物质的影响，具有灵敏度高，选择性好、稳定 性强及简单方便经济的优点，在国内外的实际应用取得的成就不可低估，可进行 百余项微量物质的检测，产生了良好的社会效益和经济效益。 1 2 3 免疫分析技术及进展 免疫分析法是以被检测物质作为抗原，然后用免疫动物的方法制备相应的抗 体，利用抗原抗体的特异性结合反应来对被检测物质进行定量，现已成为一种广 泛接受的分析方法。按所用示踪物性质，免疫分析法可分为放射免疫分析( r i a ) 、 荧光免疫分析( f i a ) 、酶联免疫分析( e l i s a ) 和化学发光免疫分析( c l i a ) 等。 1 2 3 1 放射免疫分析 3 6 - 3 川 放射免疫分析法在上世纪5 0 年代应用较多，其标记技术是将同位素分析的高 灵敏度与抗原抗体反应的特异性相结合，以放射性同位素作为示踪物的标记免疫 测定方法，由于此项技术具有灵敏度高，可检测出n g 至p g ，甚至f 套的超微量物质； 6 第一章绪论 特异性强，可分辨结构类似的抗原；重复性强；样品及试剂用量少；测定方法易 规范化和自动化等多个优点。因此，在医学及其他生物学科的研究领域和临床实 验诊断中广泛应用于各种微量蛋白质、激素、小分子药物及肿瘤标志物等的分析 与定量测定。但由于放射性物质对操作人员的危害及对环境的污染，自上世纪7 0 年代末逐步被非同位素标记所取代。 1 2 3 2 酶联免疫分析 酶联免疫分析法是在放射免疫分析的理论基础上于上世纪7 0 年代初发展起 来的一种非放射性标记免疫分析技术。e l i s a 法是根据抗原抗体反应具有高度 的特异性，以酶作为标记物，与已知抗体结合，但不影响其免疫学特性，然后将 酶标记的抗体作为标准试剂来鉴定未知的抗原。由于其标记物相当稳定，有效期 长，应用范围广泛，深受生物医学检测工作者青睐，是目前运用最多的免疫分析 技术。国内外对酚类物质的检测有不少此法的报道口3 捌。 1 2 3 3 荧光免疫分析 4 ( b 4 2 免疫荧光分析始创于4 0 年代初，1 9 4 2 年c o o n s 等多次报道用异氰酸荧光素 标记抗体，检查小鼠组织切片中的可溶性肺炎球菌多糖抗原，当时由于此种荧光 素标记物的性能较差，未能推广使用。直至5 0 年代末期，r i g g s 等合成性能较 为优良的异硫氰酸荧光素。m a s h a u 等人对荧光抗体的标记方法又进行改进，从 而使免疫荧光技术逐渐推广应用。免疫荧光技术是将抗原抗体反应的特异性和敏 感性与显微示踪的精确性相结合。以荧光素作为标记物，与已知的抗体( 或抗原) 结合、但不影响其免疫学特性。然后将荧光素标记的抗体作为标准试剂，用于检 测和鉴定未知的抗原。在荧光显微镜下，可以直接观察呈现特异荧光的抗原抗体 复合物及其存在部位。在实际工作中，由于用荧光素标记抗体检查抗原的方法较 为常用，所以一般通称为荧光抗体技术。 1 2 3 4 化学发光免疫分析 化学发光免疫分析是借助于化学发光反应的高灵敏性和免疫反应的高特异 性而建立一种测定方法。近几年的研究表明，化学发光免疫技术大有取代经典免 疫测定技术的趋向，是发展迅速的一种新型免疫分析技术。以标志物标记抗体， 在瞬间可完成快速强发光，非靶物质不产生化学发光，可明显缩短检测时间以达 到快速检测的目的。化学发光免疫技术是化学发光与免疫测定结合起来的一种高 7 第一章绪论 效检测手段。化学发光是在特定化学反应中产生的光辐射。化学发光免疫技术可 根据抗原抗体标记物的不同而分为发光物免疫测定、发光酶免疫测定和发光辅助 因子免疫测定三大类型。化学发光免疫检测技术具有高灵敏度，仪器简单，受广 大医学、环境、化学、生物等领域的科学工作者欢迎，国外不少实验室将其应用 于药物、病毒、细菌等临床医学的检测上 4 3 4 5 】。 1 2 3 5 流动注射免疫法 随着免疫分析自动化的发展，国外不少研究人员将流动注射分析引入免疫分 析中，以此建立的流动注射免疫分析法具有快速、精确、灵敏度高、易自动化的 优势嗍。 1 3 本课题的研究对象 1 3 1 双酚a 1 3 1 i 性质及用途 双酚a 学名2 , 2 二( 4 - 羟基苯基) 丙烷，英文名为b i s p h e n o l a ( b p a ) ，分子式 c 1 5 h 1 6 0 2 ，常温下呈白色粉状、片状、粒状结晶体，熔点1 5 5 1 5 6 。c ，沸点2 5 0 2 5 2 c ，是一种重要的有机中间体，是合成聚碳酸酯、环氧树脂及聚砜等的重要 原料，还可用作聚氯乙烯热稳定剂、阻燃剂、橡胶防老剂、农药、油漆油墨抗氧 剂、增塑剂和紫外线吸收剂等化工产品的原料，双酚a 的化学结构式如下： c h a 1 3 1 2 双酚a 的毒性 直至2 0 世纪7 0 年代，人们未对双酚a 毒性有一正确认识。随着时代的推 进，至2 0 世纪8 0 年代，人们逐步明确了双酚a 的毒性，双酚a 具有雌激素活 性，在人体内能起到干扰体内正常激素分泌的作用，从而影响生殖功能，导致恶 性肿瘤的产生。即使是低剂量染毒，也能造成严重的损伤。另外，双酚a 可以 与镉、紫外线发生协同作用，加重它们对机体的伤害 4 7 4 8 。近年来，双酚a 的 需求从1 9 9 5 年的7 3 亿公斤到1 9 9 9 年的8 2 亿公斤一直呈稳定增长趋势，到2 0 0 2 8 心口心 第一章绪论 年需求超过1 0 亿公斤。它可由塑料中转移至环境，目前已成为一种全球性污染 物，对环境和人类造成了一定的危害【4 9 1 。 1 3 1 3 环境中的双酚a 双酚a 是一种人工合成的化学物质，原本在自然界中并不存在。但近几年 在世界各地各种水体中都有发现。日本经济新闻报道【5 0 1 ，据日本环境厅1 9 9 6 年度的调查，日本各地的河川和港湾淤泥中都检测到了双酚a ，而在1 9 7 6 年度 的这项调查中没有发现这种物质。在韩国工业中心蔚山海湾及其附近也检出了双 酚a 。其淤泥中每千克干物质里双酚a 含量为5 4 n g 5 1 1 。欧洲的北海、易北河支 流中也发现了双酚a 。在易北河的水样中双酚a 可高达7 7 6 n g l ，而在淤泥中每 千克干物质里双酚a 含量为6 6 3 4 3 m g 5 2 1 。我国目前还没有开展大规模的调查， 但梁增辉、王福玉等人【5 3 】在天津南郊采集的沟渠水样中也检出了双酚a ，初步 测定双酚a 高达1 5 2 r t g l 。城市的空气中同样也发现了双酚a f t , 4 。 1 3 1 4 食品及包装材料中的双酚a 食品中双酚a 主要来源于聚碳酸酯容器和容器内壁环氧树脂涂料的溶出。双 酚a 是生产聚碳酸酯和环氧树脂的重要原料，在婴儿奶瓶、微波炉饭盒、及其它 许多食品饮料的包装材料中都用到聚碳酸酯和环氧树脂。有实验表明，开水注入 新奶瓶后，会有0 1 5 5 5 嵋，l 的双酚a 产生。从调查的市售听装饮料中检出了o 2 1 2 1 峙几的双酚a ，且实验结果表明：未经过高压加热灭菌的饮料和新罐中双酚a 基本未检出，丽经过高压灭菌的饮料和旧罐，其溶出量较高。把商业的罐装墨西 哥胡椒粉在2 5 和3 5 c 分别存储4 0 ，7 0 ，1 6 0 天，其中这些罐头的2 3 进行热处理，剩 余的不进行热处理，结果表明热处理的影响很小。在2 5 c 存储4 0 天观察到了存储 时f 霹对双酚a 迁移的影响，在3 5 c 存储时间观察到双酚a 的迁移增加，最高的迁 移水平是3 5 c 存储1 6 0 天，迁移量达1 5 3 3 m g k g 。甚至双酚a 也造成了用塑料容 器盛装的葡萄酒和矿泉水的污染嘲。欧盟限定了食品或模拟食品中双酚a 迁移量 为3 m 酷g p q 。 1 3 1 5 生物材料中的双酚a 聚碳酸酯、环氧树脂和甲基丙酸烯作为生物材料，因其独特的物理化学性质 而广泛用作人类眼睛中之水晶体，外科中外伤的接合剂，牙齿填充物和包封剂等。 双酚a 可从治疗后的牙齿渗透到唾液中5 7 捌l 。在商用不同包装的胎牛血清，羊血 9 第一章绪论 浆和牛的血清白蛋白制品中双酚a 的检测( h p l c e d 和h p l c m s ) 也有研究。在 许多实验室，这些商用血清被用来制成疫苗和为了各种目的处理培养细胞或组 织，因此急需更深入的研究双酚a 通过血清可能产生的不利影响。 1 3 1 6 双酚a 的检测分析方法 环境中双酚a 的含量很低( 多为痕量级) ，这对检测技术提出了很高的要求。 测定双酚a 目前主要应用各种色谱法i s 9 、色谱质谱联机法1 6 0 - 6 ”、双波长分光光 度法1 6 2 1 、生物识别一化学分析法 6 3 1 、e l i s a 法 6 46 5 】和荧光法 酣, - 6 7 1 等。 1 3 2 2 , 4 ，6 三氯苯酚 1 3 。2 1 理化性质 2 , 4 ，6 一三氯苯酚英文名称为2 , 4 ，6 - t f i c h l o r o p h e n o l ( t c p ) ，分子式c 6 h 3 c h o ， 分子量1 9 7 4 4 ，熔点：6 9 5 ，沸点：2 4 6 1 2 ，相对密度( 水= 1 ) 1 4 9 0 1 ，无色片状 结晶或黄色固体，有强烈酚的气味，化学结构式如下： o h c 1 3 2 2 用途及危窖 2 ，4 ，6 - - - - 氯苯酚( t c p ) 主要用作染料中间体、杀菌剂，防腐剂，也用作聚 酯纤维的溶剂，用于有机合成，在造纸厂、印染行业使用较多。它的污染途径很 多，可以通过工业废水污染河流湖泊、通过农药污染水果蔬菜、或者通过其他一 些日常用品与人类接触。吸入、摄入或经皮肤吸收三氯酚后对身体有害，对眼睛、 皮肤、粘膜和上呼吸道有刺激作用。还影响鱼类和微生物的生长，并可在体内残 留和富集。所以对于2 ，4 ，6 一三氯苯酚的检测就显季导尤为重要，而且十分迫切。 1 3 2 3 现有检测方法 检测三氯酚的方法目前主要有：高效液相色谱法 6 s - 6 9 1 ，气相色谱法【7 0 l 和 e l i s a 法f 3 3 】等。 第一章绪论 1 3 3 对叔丁基苯酚 1 3 3 1 理化性质 对叔丁基苯酚英文名为p - t e r t - b u t y l p h c n o l ，白色或浅黄色，片状结晶。易溶于 乙醇和乙醚，溶于苯，微溶于石油醚，不溶于水。熔点9 6 1 0 0 c ，沸点2 3 6 2 3 8 ( 分解) ，相对密度0 9 0 8 ，分子式为c 1 0 h 1 4 0 ，分子量为1 5 0 2 2 ，化学结构式如下： c ( c h 3 ) 3 1 3 3 2 用途及危害 对叔丁基苯酚是一种重要的化工原料，也是一种毒性较大的有机物。用于合 成油溶性酚甲醛树脂、合成橡胶的增塑剂、油漆的添加剂、紫外线吸收剂、表面 活性剂、农药等。医药上用于生产驱虫剂。作为烷基酚的一种，对叔丁基苯酚具 有雌激素活性，对生殖功能影响较大，有致畸效应【7 n 。对叔丁基苯酚可经口、 皮肤及呼吸道进入人体，高浓度可引起急性中毒，低浓度可蓄积于体内，引起慢 性危害。由于对叔丁基苯酚的大量生产和在生活中的广泛应用，已经成为一种重 要的环境污染物。 1 3 3 3 现有检测方法 目前常见的测定方法是高效液相色谱法【7 2 1 ，但流动注射化学发光法仍未见 报道。 1 4 本课题研究的主要内容及其研究目的 1 4 1b p a 及t c p 荧光免疫检测新方法的研究 依据免疫学的基本理论，制备环境激素中两种酚类物质b p ：a 和t c p 全 抗原，用这两种全抗原分别免疫动物制备出对小分子待测物有特异性的抗体，通 过一系列方法对所得抗体进行纯化，并采用荧光物质对纯化抗体进行标记。利用 抗原抗体的特异性反应，通过荧光免疫的方法对原物质即b p a 和t c p 进行测定， 洲入v 第一章绪论 具有特异、灵敏、准确等特点。从而初步建立荧光免疫法检测酚类环境激素物质 的新技术。 1 4 2 对叔丁基苯酚流动注射化学发光检测新方法的研究 基于在碱性介质中，鲁米诺一过氧化氢一对叔丁基苯酚体系的化学发光，建立 了流动注射化学发光测定水中对叔丁基苯酚的新方法。本法简单、灵敏、方便、 快速，测定结果令人满意。 1 5 技术路线 本课题中采用荧光免疫分析方法检测两种酚类环境激素b p a 和t c p ， 其技术路线见图1 - 1 。 图1 - 1 荧光免疫法检测b p a 和t c p 技术路线 f i g 1 - 1 t e c h n i c a lr o u t e o f t h e d e t e r m i n a t i o n o f b p a a n d t c p b y i m m u n o f l u o r e s c e n c e m e t h o d 采用流动注射化学发光法测定对叔丁基苯酚技术路线见图l 一2 ： 叫过氧化氢溶液浓度的选择卜_ 叫干扰实验h 标准曲线及样品检测 j l_-_-_-_。i_-。_。_。一 图1 2 流动注射法检测对叔丁基苯酚技术路线 晦1 - 2t e c h n i c a lr o u t eo f t h ed e t e r m i n a t i o no f p - t e r t - b u t y l p h e n o lb yf l o wi n j e c t i o nm e t h o d 1 2 第二章双酚a 全抗原的合成与表征 2 1 引言 第二章双酚a 全抗原的合成与表征 2 1 1 与抗原有关的几个概念 抗原是一种物质，它能刺激人体或动物体的免疫系统，发生一系列免疫 反应，产生抗体或致敏淋巴细胞等免疫物质；并能与相应抗体或致敏淋巴细胞在 体内、体外发生特异性结合反应。因此，抗原性物质具有两重性能：刺激机体产 生免疫反应的免疫原性；同相应免疫物质发生特异性结合的免疫反应性。 完全抗原 具有免疫原性和反应原性的抗原，如大多数蛋白质、细菌、病毒、细菌外毒 素和动物血清等，能刺激机体产生免疫应答。 半抗原 只具备反应原性而缺乏免疫原性或免疫原性很弱者，称为半抗原。只有与大 分子胶体物质( 如蛋白质) 或不溶性颗粒( 如聚苯乙烯胶乳颗粒) 结合后才获得免疫 原性，这是依靠这些蛋白质或不溶性颗粒作为“载体”而将半抗原粘附于其表面 使其成为大分子有化学活性基团的异物，以获得全抗原的性能。 ( 1 ) 半抗原无免疫原性：j 堡堕! ! 夸不产生抗体 半抗原 一，、免疫机体，、 ( 2 ) 半抗原获得免疫原性： 十() j l