（遗传学专业论文）耐热碱性磷酸酶的亚克隆和耐热机制的研究.pdf

复旦人学硕士论文耐热碱件磷膣酶的砸觅降和州热o l e o 的研究 摘要 1 6 8 3 5 对嗜热菌蛋白耐热机制的研究是 - 3 前生物学领域研究的热点之一。本实验 室已从筛选得到的一株高度嗜热菌( t h o f i l l u ss p 3 0 4 1 ) 中克隆到了耐热碱性磷 酸酶( f d t a p ) 基因。坯此基础上，本文进行了以下几方面的5 - 作： 1 为提高f d - t a p 的表达量，用分子生物学手段对f d t a pn 端的氨基酸信号肽 序列进行改造，得到了n 端分别缺失2 4 ，25 ，26 ，2 7 个氨基酸的系列缺失突 变体。其中突变体蛋白t a p n d 25 ，t a p n d 2 6 和t a p e d 2 7 在e c 0 1i 中的表达量获 得了提高。 2 根据t a p 的耐热特性，摸索了t a p n d 27 的诱导表达和分离纯化条件，得到了 纯度在9 0 以上的t a p n d 27 ，它的比活为9 7 3 6 u m g ，米氏常数是1 2 8x 1o m 0 1 m l ，有较高的热稳定性，t 。值为9 l 。 3 经研究发现，金属离子与溶液中的p h 值可以影响t a p n d 27 的活性和热稳定 性。e d t a 透析去除金属离子后，t a p n d 2 7 的活性完全丧失，二级结构也产生了 较大变化，提示它是一种金属酶蛋白，结构上存在着金属离子的结合位点。耐 热性实验证明溶液中的p h 大小与t a p n d 2 7 的热稳定性有密切关系，p h 在6 5 至8 的范围内，酶的热稳定性比较好。当达到p 1 1 6 5 以下时，耐热性迅速降低。 4 研究了无机磷酸盐( p i ) 对t a p n d 2 7 耐热性的影响，发现磷酸根离子能显著 提高该酶的热稳定性，在10 m m 0 1 l 磷酸根离子存在下，t a p n d 2 7 的t 。值从9 1 上升到了9 7 ；酶的动力学实验证实p i 对t a p n d 2 7 的催化活性有可逆竞争 性抑制作用，k ，值为0 9 9 10 1 m o l l ，揭示t a p n d 27 上可能存在p i 的结合位点。 园二色谱分析表明，热变性过程中t a p e d 27 的二级结构变化呈现明显的规律性， 但在p b s 溶液中t a p n d 2 7 热变性的二级结构变化与t r is - h c l 中的明显不同， 说明t a p n d 2 7 的热稳定性和其二级结构紧密相关。 5 通过结晶条件的优化和筛选5 - 作，在i40 m m 0 1 几m g c l ：，l0 0 m m 0 1 lh e p e s b u f f e r ( p h7 5 ，25 度) ，2 8 5 ( w v ) p e g 40 0 的结晶条件下，用悬滴扩散 法得到了大小为0 8 0 5 0 1m n l 的蛋白质单晶，并收集了分辨率为2 5 4 a 的 x - r a y 衍射数据，晶体的空间群为p 2 ，22 ，晶胞参数为a = 57 7 ，b = 6 9 9 ， 、 ， c = 1 1 1 5 a ；v m 为2 16 a 3 d a 。；，4 关键词：耐热碱性磷酸酶，亚克隆，热稳定性，结晶 f u d a nu n i v e r s i t yg r a d u a t et h e s i s s u b c i o n i n ga n dt h e r m o s t a b i l i t ym e c h a n i s ms t u d yo nt h e r m o s t a b l ea l k a l i n ep h o s p h a t a s e a b s t r a c t o u rl a bh a ss c r e e n e da n dc l o n e dt h e g e n ec o d i n g f o rt h e r m o s t a b l ea l k a l i n e p h o s p h a t a s e ( t a p ) f r o mt h e r m o p h i l et h e r m u ss p 3 0 4 1 t h i sp a p e rc o n c e n t r a t e so o t h ef o l l o w i n gw o r kw i t ht h e r m o s t a b l ea l k a l i n ep h o s p h a t a s e ： 2 4 w i t hm o l e c u l a r c l o n i n gm e t h o d ，as e r i e so f m u t a n t s w e r eo b t a i n e dw i t h2 4 ，2 5 ，2 6 a n d2 7a m i n oa c i d sd e l e t e di nf d t a pn t e r m i n a l s i g n a lp e p t i d es e q u e n c e a m o n gw h i c hm u t a n t s t a p n d 2 5 ，1 a p n d 2 6a n d1 a p n d 2 7g e te n h a n c e d e x p r e s s i o nl e v e li ne c o l i t h em u t a n tp r o t e i nt a p n d 2 7w a si n d u c e da n dp u r i f i e dt h r o u g has e r i e so f p r o c e d u r e s t h ep u r i f i c a t i o ne f f i c i e n c yw a sa b o v e9 0 w i t has p e c i f i ca c t i v i t y 9 7 3 6 u m g k mv a l u ei s 1 2 8 1o m o l m 1 a n di ti sh i g h l yt h e r m o s t a b l ew i t ha t m v a l u e9 1 w ef o n n dt h a ti o na n ds o l v e n t p h i n f l u e n c et a p n d 2 7 a c t i v i t y a n d t h e r m o s t a b i l i t y a f t e rt r e a t m e n tw i t he d t a t h ei o n d e p r i v e dt a p n d 2 7 c o m p l e t e l y1 0 n e si t st h e r m o s t a b i l i t y , w i t hg r e a tc h a n g ei ni t ss e c o n d a r ys t r u c t u r e t h a ts u g g e s t st h a tt a p n l 3 1 2 7i sa ni o ne n z y m e t h e r e m a y b ei o n b i n d i n gs i t e si n t h es t r u c t u r e t a p n d 2 7i st h e r m o s t a b l eu n d e raw i d e r a n g eo f p h f r o m6 5t o8 0 w h i l ei t st h e r m o s t a b i l i t yd e c r e a s e s d r a m a t i c a l l yw h e np h i sb e l o w6 5 w ef o u n dt h a t i n o r g a n i cp h o s p h a t e c a n g r e a t l yi m p r o v e t a p n d 2 7 t h e r m o s t a b i l i t y i nt h ep r e s e n c eo f1 0 m m o l lp i i t st m w a se n h a n c e df r o m9 1 t o9 7 e n z y m a t i ck i n e t i ce x p e r i m e n ts h o w st h a tp ii sar e v e r s i b l ec o m p e t i t i v e i n h i b i t o ro ft a p n d 2 7 w i t hk iv a l u e0 9 9 10 - 4 m o l l n l er e s u l t si n d i c a t eap i b i n d i n gs i t e i nt h e e n z y m e c ds p e c t r u ms c a n n i n gh a sm e a s u r e dt a p n d 2 7 s e c o n d a r ys t r u c t u r ec h a n g e si np h o s p h a t eb u f f e r ( p h 8 o ) d u r i n gh e a td e n a t u r a t i o n ， w h i c hi s q u i t ed i f f e r e n tf r o mt h a to ft a p n d 2 7i nt r i s h c lb u f r e r ( p h 8 o ) ， i n d i c a t i n gt h a tp r o t e i nt h e r m o s t a b i l i t yc l o s e l yr e l a t e st oi t ss e c o n d a r ys t r u c t u r e t h et a p n d 2 7c r y s t a l l i z a t i o nc o n d i t i o n sw e r e s c r e e n e d u s i n gh a n g i n g - d r o p v a p o r d i f l u s i o nm e t h o d c r y s t a l su s e df o rx r a yd i f f r a c t i o nd a t ac o l l e c t i o nw e r e g r o w na g a i n s tr e s e r v o i r sc o n t a i n i n g4 0 m m o l lm g c l 2 ，1 0 0 m m o l lh e p e sb u f f e r fp h 7 5 ，2 9 8 k ) ，2 8 5 ( w ，v ) p o l y e t h y l e n eg l y c 0 1 a n dt h e yg r e w t om a x i m u m d i m e n s i o n so f08 0 5 0 1 m m x r a yd i f i r a c t i o nd a t aa r ec o l l e c t e dt o2 5 4 a i t w a sf o u n dt h a tt h e c r y s t a l sb e l o n g t o s p a c eg r o u p p 2 1 2 2 1 ，w i t h u n i t c e l l d i m e n s i o no f a = 5 7 7 b = 6 9 9 c = 1 1 1 5 a a n da v mo f 2 1 6 a d a - 1 。 k e y w o r d s ：t h e r m o s t a b l ea l k a l i n ep h o s p h a t a s e ，s u b c l o n e ，t h e r m o s t a b i l i t y c r y s t a l l i z a t i o n 复1 3 犬学硕：h 仓文一一耐热碱h 磷酸酶的弧克降和耐热机制的到f 究 综述 一碱性磷酸酶( a l k a l i n ep h o s p h a t a s e ) 碱性磷酸酶( e c 3 1 3 1 ) 是一类与生物体代谢途径相关的水解 酶，它能催化许多磷酸单酯的水解，在碱性条件下有最大活性，反应 产物为无机磷酸；它还可以通过转磷酸作用将磷酸基团转移到磷酸受 体( 二乙醇胺、t r i s 碱等) 的羟基上f “。对碱性磷酸酶催化机制的研 究一般是以大肠杆菌碱性磷酸酶为模型。催化反应发生时，底物分子 和结合于m 2 位点的二价阳离子z n 2 + 共同激活s e r l 0 2 的羟基，s e r 羟 基进而攻击底物的磷酸基团，打断磷酸单酯键并和磷酸单体形成紧密 的磷酰丝氨酸中间体，失去磷酸基团的底物变成醇，在m 1 位z n 2 + 的协助下离开活性位点。然后m 1 位的z n 2 + 激活一个水分子，这个水 分子再去攻击磷酰丝氨酸键，使磷酰共价键断裂，生成非共价结合的 酶磷酸复合物。当有磷酸受体存在时，磷酸被转移到受体上；当磷 酸受体不存在时，磷酸被直接释放到溶液中。在催化过程中，要生成 两含酶磷酸中间物复合体：共价的e p 和非共价的e p 复合体【2 i ，前 者是由s e r l 0 2 磷酸化形成的，在后者中，磷酸基团通过碱性磷酸酶 活性位点上的一个z n 2 + 离子与酶蛋白结合。在酸性条件下，e p 的脱 磷酸化为限速反应步骤；在碱性条件下，限速反应则为磷酸产物从e p 上解离这一步4 1 。e c o l i 碱性磷酸酶的催化反应机制如下图，其它来 源的碱性磷酸酶反应机制与之大体类似。 复旦人学硕l 论文耐热碱性磷酸酶的耶兜降和耐热机制的聊究 r a t e l i m i t i n gs t e p ( a c i dp h )( a l k a l i n ep h ) hr ah 肾器叫如， 隙o p 拱r o 掣印鍪麓p = h2 0 0 、“0 7 百 f i 9 1 e c o l i 碱性磷酸酶的催化反应机制图 碱性磷酸酶广泛存在于各种生物体中，哺乳动物碱性磷酸酶一般 以糖蛋白形式存在，几乎在所有的组织中都有表达。人体内碱性磷酸 酶表达水平的异常常与某些疾病有密切关系，! g l 此检测血清中碱性磷 酸酶的表达水平和组织中同功酶的分布，一直被人们当作多种疾病预 测和诊断的手段。小牛小肠碱性磷酸酶被广泛用作临床诊断试剂，它 的优点是活性高，但稳定性不好并且成本较高。 ( 一) 人碱性磷酸酶研究进展 人碱性磷酸酶分布于所有的组织器官中，某些组织表达有一种以 上的同功酶。现在已经知道至少有三个基因座位编码人碱性磷酸酶， 这三个等位基因分别在胎盘、小肠和肝骨肾获得表达不同组织 复旦大学坝i 论文l 咐热碱盹磷酸酶的亚兜隆和耐热机制的研究 来源的碱性磷酸酶生物学性质，如分子量，等电点，耐热性等不同， 因而有人根据它们耐热性的差异( 6 0 c ，p h 7 5 ) ，将人碱性磷酸酶的 同功酶分成三类：胎盘同功酶、l 一苯丙氨酸敏感的小肠同功酶和肝组 织同功酶【6 1 。m a t s u m o t o k 等将人胎盘碱性磷酸酶( a l p ) 与狗、猫、 兔、牛来源的碱性磷酸酶生物学性质进行了比较，得出如下结论： 1 碱性磷酸酶发挥活性的最适p h 相同，仅有a l p 受l 一苯丙氨酸 的抑制作用。 2 a l p 热稳定性较高，6 5 保温1 5 m i n 后仍能保持活性。但当用 e d t a 处理后，耐热性消失，表明a l p 需二价金属离子稳定其结 构。 3 人、鼠碱性磷酸酶活性受c a t i o n s u r f a c t a n t s4 e - * 4 ，其他来源的碱 性磷酸酶不受其抑制。仅有人来源的a l p 受d o c n a ( 一种 a n i o n s u r f a c t a n t ) 抑制。 4 对b - g l y c e r o p h o s p h a s e 的亲和性仅能在人源碱性磷酸酶中观察到 1 7 】 目前a 4 l 3 对来源于人的碱性磷酸酶的研究多集中在它与疾病的 关系上。研究人碱性磷酸酶同功酶在组织中的分布和表达，具有临床 意义。对健康人群的抽样调查统计发现：血清中小肠来源碱性磷酸酶 的活性占总活性的9 ，肝组织和骨来源碱性磷酸酶的活性分别占 2 5 和6 7 1 8 1 。某种来源的同功酶在血清中活性的异常升高往往与其 相应器官的病变有关。在数名肝脏病患者中，有8 0 患者的血清中肝 复u 人学坝j 。论文i 埘热日戎磷艘酶的克降和i 刚热机制的州究 来源的碱性磷酸酶活性有异常升高现象。碱性磷酸酶表达异常一般在 肝炎发病早期就可以检测得到，与其它检测手段相比，具有及时、灵 敏、方便的优点 6 1 。i n d 等在, - - h a 清癌抗原1 2 5 ( c a l 2 5 ) 、胎盘碱性 磷酸酶( p l 碱性磷酸酶) 、癌辅助血清抗原( c a s a ) 和自由b 一人绒 膜促性腺激素( h c g ) 与妇女上皮卵巢癌的相关性进行研究后发现， 在h c g 和c a s a 无法增加新的预测信息的情况下，可以根据p l a p 碱性磷酸酶和c a l 2 5 的浓度水平来预测病情的发展一1 。测定人尿液中 非特异性的碱性磷酸酶活性，发现其表达水平和惊厥( e c l a m p s i a ) 有 明显的相关性1 1 0 1 。还有报道指出，骨特异的碱性磷酸酶的表达水平能 反映成骨活性，可作为骨形成的一种标志f j 1 j 。 ( 二) 大肠杆菌碱性磷酸酶( b 碱性磷酸酶) 研究进展 大肠杆菌碱性磷酸酶由基因p h o a 编码，它属于和磷酸转移途径 有关的p h o 调控子的一员，在低磷条件下诱导表达1 2 1 1 3 】。蛋白质产物 在体内的表达受阻遏和去阻遏两种方式的调控1 4 。大肠杆菌碱性磷酸 酶需经过前体蛋白信号肽的剪切和加工过程才能形成成熟的碱性磷 酸酶。前体蛋白由4 5 1 个氨基酸残基组成，n 端含有2 2 个氨基酸的 信号肽序列。大肠杆菌碱性磷酸酶是一个同源二聚体，每个亚基含 4 2 9 个氨基酸，分子量为9 4 k d 。蛋白具有较高的稳定性，对大肠杆 菌碱性磷酸酶的盐酸胍变性、复性和再变性实验表明，变性和复性过 程中大肠杆菌碱性磷酸酶存在着两种活性状态：不稳定的活性状态和 活性状态”i 。 大肠杆菌碱性磷酸酶的氨基酸序列于1 9 8 1 用化学方法进行了测 复口人学坝 论文耐热碱n 嘶艘酶的、限兜降辄时热机制的 究 定，其基因也于1 9 8 6 年进行了克隆h 6 1 【1 7 l 。1 9 9 1 年，k i m 等得到了 分辨率为2 0a 的大肠杆菌碱性磷酸酶晶体结构，晶体结构分析表明： 它的蛋白结构中包含6 个金属离子，2 9 6 个水分子和2 个磷酸分子， 每个亚基与2 个z n 2 + 、1 个m 9 2 + 和1 个磷酸根离子结合。整个分子大 小为1 0 0 a 5 0 a 5 0 x ，有两个活性位点，活性位点之间相距3 0 a ， 活性部位包括s e r l 0 2 、1 个磷酸根离子和3 个金属离子以及它们的配 体。s e r l 0 2 处在一个小的口袋中，靠近m 9 2 + 和z n 2 + ，当丝氨酸被磷 酸化而形成紧密的磷酸丝氨酸复合物e p 时，这个口袋被磷酸根离子 所充满【1 8 l 。 每个亚基呈典型的o 【d 拓朴结构，由一个1 0 层的中央b 折叠和 周围15 个长度不等的o 【螺旋组成。哺乳类碱性磷酸酶与大肠杆菌碱 性磷酸酶的氨基酸序列比较同源性为2 5 3 5 ，但三级结构的模拟 显示其核心结构在进化过程中非常保守，这个核心结构包括1 0 层的 中央d 折叠、金属离子的配体及与活性中心相关的残基1 1 9 】。 大肠杆菌碱性磷酸酶中存在两个分子内二硫键c y s 一1 6 8 一c y s 一1 7 8 和c y s 一2 8 6 一c y s 一3 3 6 。前体蛋白穿过细胞膜时信号肽序列被切除，在 进入细胞周质中时形成分子内二硫键。有两种周质因子参与了二硫键 的形成过程，周质因子d s b a 直接催化了二硫键的形成，另一种周质 因子d s b b 则通过重新氧化还原态的d s b a 而对碱性磷酸酶分子内二 硫键的形成起作用。两个分子内二硫键对于大肠杆菌碱性磷酸酶结构 的稳定性起着重要作用。 大肠杆菌碱性磷酸酶的亚基上有三个金属离子结合位点，m 1 ， 复旦人学颤| 论文耐热碱性磷峻酶的呼克降和耐热机制的 i j 究 m 2 和m 3 。z n 2 + 结合于m 1 金属离子位点，通过h i s 3 3 1 和h i s 4 1 2 咪 唑上的氮原子与a s p 3 2 7 的两个羧基氧和一个磷酸氧相结合，金属一 配体之间的距离为2 0 7 a 。这个位点的z n 2 + 对于酶的催化反应是极为 重要的。m 2 金属离子结合位点被第二个z n 2 + 占据，z n 2 + 和h i s 3 7 0 的 一个氧，a s p 5 1 和a s p 3 6 9 各一个羧基相结合，金属一配体之间的平均 距离为2 0 a 。m 3 位点结合m 9 2 + 离子，m 9 2 + 与a s p 5 1 ， g l u 3 2 2 上的 氧原子，t h r i5 5 的羟基及三个水分子相结合。 a s p 5 1 同时和m 2 ， m 3 位点结合，起着它们之间的桥梁作用。a s p l 5 3 不直接和m 9 2 + 作 用，而是通过和两个水分子的作用( w a t 4 5 4 和w a t 4 5 5 ) 影响m 9 2 + 的结合，它对于m 9 2 + 的结合是不可或缺的。g l u 3 2 2 对于m 9 2 + 的结合 也是相当重要的俐川。值得一提的是，m 9 2 + 对于不同来源的碱性磷 酸酶的作用不同 2 2 1 ，对于来自牛脑牛。肾和人肝骨肾的碱性磷酸酶， m 9 2 + 是一种强激活剂；而对于来自人胎盘1 2 3 1 和牛犊肠俐的碱性磷酸 酶而言，m 9 2 + 没有激活作用或激活作用很弱。 大肠杆菌碱性磷酸酶的亚基上还存在着磷酸根离子的结合位点， 磷酸根离子和z n l ，z n 2 ，a r 9 1 6 6 的胍基以及被a s p l 5 3 或t y r l 6 9 结 合的水分子( w a t 4 5 9 ) 结合，它还通过氢键和s e r l 0 2 的酰胺和一个水分 子相连( w a t 4 5 4o 二、嗜热蛋白的耐热机制 有一类微生物能在地球上6 0 。c 乃至8 0 c 以上温度下生长并发挥 最大活性，前者称为嗜热菌( t h e r m o p h i l e ) ，后者称为高度嗜热菌 复日人学坝j 论文一l | l | 寸热碱性磷酸酶的克降和耐热机制的研究 ( h y p e r t h e r m o p h i l e ) 2 5 1o 来源于嗜热菌体内的耐热酶( t h e r m o z y m e s ) ， 性质独特，它们除了有较高的热稳定性外，还具有对酸、碱、去污剂、 有机溶剂等的广泛耐受性【2 6 1 ，当前对耐热蛋白耐热机制的研究已经引 起了人们越来越广泛的兴趣。 所谓耐热性，是指蛋白质在高温下维持正常生物活性7 l 2 _ 维结构 的能力，它与蛋白质的折叠和热变性密不可分。在超过了耐热范围时， 蛋白质会发生不可逆的变性和失活现象。一般认为发生热失活的原因 有：谷氨酰胺和天冬酰胺脱氨2 7 1 ，蛋白质凝聚，半胱氨酸氧化，水解。 b r i a ns h a r t l e y 等人认为：蛋白质的变性过程是一个不可逆的动力学 过程，在变性压力下，肽键首先在某一最脆弱的位点断裂一称作 “w e a k p o i n t ”一进而启动蛋白质不可逆变性的开关【2 8 1 ，这个过程的限速 步骤为蛋白质“w e a k p o i n t ”位点附近局部的结构改变。在变性过程中， 蛋白质的构象由紧密、有序的折叠状态向松散、无规则的去折叠状态 转变，到最后完全失去生物学活性，这个过程一般伴随自由能的改变。 用t f l e ) 式表示为：ag n d = g d = g n 29 1 ，其中，g n 表示蛋白质折叠状 态的自由能，g d 表示蛋白质去折叠状态的自由能，g n d 是蛋白质热 变性过程中的自由能变化，又称稳定自由能，可用于定量地衡量蛋白 质的耐热性。球蛋白的稳定自由能一般在5 - 1 7 k c a | m o l 的范围内，仅 相当于几个氢键的能量。提高蛋白质的耐热性可以通过提高折叠状态 的稳定性、降低非折叠状态的稳定性或者二者并用来达到3 0 1 。蛋白质 三维骨架结构是相当保守的3 ，少量微小的氨基酸替换不会影响它的 高级结构。 复且人学坝 论文耐热碱忖磷睃酶的盯克降和耐热机制的研究 目前对蛋白质耐热性的测定主要有两种手段：一是通过酶活性的 测定反映耐热性，通常以t m ( m e l t i n gt e m p e r a t u r e ) 或者活性半衰期 t l 2 作为衡量耐热性的指标，酶活性的检测灵敏、快速、方便，是测 定耐热性的常用方法：第二种手段是通过蛋白质的热变性过程中的构 象或能量变化来获得有关蛋白质耐热性的信息，常用的技术有：热容 法、紫外差光谱、荧光光谱、园二色性光谱、核磁共振、d s c 等。 ( 一) 蛋白质耐热机制研究进展 , - 4 1 j 曾试图通过对嗜热蛋白与其常温同源蛋白的比较分析来揭 示蛋白质的耐热规律，却惊奇地发现：这些耐热蛋白在生物学性质， 如催化机理、活性，分子量，等电点等方面与其同源蛋白并没有显著 差异，它们的一级结构和高级结构也非常相似。例如：对来源于嗜热 厌氧菌t h e r m o s u l f u r i g e n e s 的木糖异构酶t t x i 和它的同源蛋白t n x i ( t h e r m o t a g an e a p o l i t a n a ) 进行一级氨基酸序列的同源性分析发现， t n x i 和t t x i 的氨基酸序列具有7 4 的同源性，他们的晶体结构几 乎完全相同，但t n x i 的耐热性却远远高于t t x l ，而且找不到任何 结构上的明显差异来解释这种耐热性的不同。这提示似乎并不存在什 么蛋白质耐热性的特殊机制，不同耐热蛋白采取的耐热机制千差万 别，a 4 1 l 也至今无法找出对所有耐热蛋白适用的普适规律。唯一可以 肯定的是：耐热蛋白的耐热特性是由它自身的遗传信息所决定的。耐 热性的产生是许多微小的差异和变化累加的结果。这些微小的因素包 括蛋白质表面的刚性和柔性、折叠状态、内源稳定作用( 如盐桥、氢 键、疏水键、范德华力等) 以及外源稳定因子等，它们具有加和性， 一8 一 复旦大学硕士论文耐热碱性磷酸酶的哑克隆和耐热机制的研究 最终赋予了蛋白质整体结构的稳定1 3 2 i 。 下面具体讨论一下影响蛋白质热耐热性的因素： 1 蛋白质的刚性：有人用晶体学参数，即蛋白质晶体表面积与体积 的比例来表征蛋白质折叠的紧密程度和刚性，统计学分析表明，耐 热蛋白的晶体学参数一般要比其同源嗜温蛋白低很多 3 3 1 ，也就是 说，蛋白质的耐热性越高，折叠的紧密性和结构的刚性也越大；从 另一方面看，酶蛋白催化活性的发挥却需要酶的折叠结构具有较高 的柔韧性，因此在进化过程中耐热性的获得是酶活性与刚性互相妥 协的结果。 2 蛋白质的氨基酸序列：人们曾在嗜热细菌细胞膜中发现与耐热性 有关的一类特殊脂类，但在耐热蛋白中，却没有发现类似的特殊氨 基酸的存在，嗜热蛋白与嗜温蛋白一样，也是由2 0 个基本氨基酸 组成的。只是在一类嗜热( s u l f o l o b u s ) ，存在与耐热性有关的翻 译后1 y s 的甲基化修饰3 4 1 。同源比较分析发现嗜热蛋白中g l x a s x 和a r g l y s 的比例相对于嗜温蛋白较高，而c y s 含量较低。对一些 蛋白家族的氨基酸序列统计分析发现o l y - a l a ，s e r - * a l a ，s e r a r g ，l y s - * a r g ，以及a s p - - g l u 这些氨基酸替换有助于提高蛋白质 耐热性【3 5 】。这可能是由于在长期进化过程中，编码耐热蛋白的核苷 酸序列中g c 含量比较高，导致翻译过程对某些氨基酸有较强的 倾向性的缘故。1 9 8 9 年，m e n e n d e z a r i a s 和a r g o 分析了6 个蛋白 质家族中7 0 个耐热与不耐热蛋白质的序列，提出只有位于表面的 a 一螺旋区或结构域界面使蛋白质柔韧性下降和增加疏水性的氨基 复旦人学硕i 论文耐热碱性磷酸酶的亚克降和耐热机制的研究 酸替代与蛋白质耐热性增加有关。并提出了位于该区1 0 种常见的 氨基酸替代( t o p1 0 规则，表1 ) 1 3 6 o 研究一级结构与耐热性关系 的常用手段是氨基酸突变分析法，报道指出，有时一个或几个氨基 酸残基就可能决定了蛋白质的整体热稳定性。比如上面提到的木糖 异构酶t n x i ，当把5 8 位和2 位的p r o 分别替换为g l n 和a l a 时， 它的耐热性大幅度下降，这表明这两个位点的p r o 残基对维持 t n x i 的热稳定性有重要作用1 3 7 1 。 袁1 不耐热和耐热蛋白之间10 种最常见的氨基酸置换 注：0 ，1 ，2 表示氨基酸周围的刚性指数 一1 o _ 一 复口人学坜j 论文埘热碱瞵艘酶的垤克降和耐热机制的州究 3 分子间作用力 1 ) 疏水作用： 有研究表明：化学基团从蛋白质亲水表面向蛋白质疏水内部转移 所需的稳定性能量大约是2 5 3 0 c a lm o l 。1a ，这证实了疏水作用对稳 定蛋白质结构的重要性【3 8 j 。 e r i k s s o n 以t 4 溶菌酶为实验材料，进行了一系列由亮氨酸( l e u ) 到丙氨酸( a l a ) 的在蛋白质分子疏水内腔的氨基酸置换实验，并测 定了它们的晶体结构。发现有一部分突变体蛋白的结构变得疏松( 约 1 a ) ，使更多的溶剂水分得以移入蛋白质内腔，这种内腔空间的大小 与蛋白质耐热性的降低成近似的线性关系【4 1 1 ，证明疏水作用与 蛋白质的热稳定性密切相关。 2 ) 盐桥 分子内盐桥的形成往往影响蛋白质的热稳定性，有时甚至起着决 定性的作用。g e n e t i q u e 等对来自b a c i l l u sl i c h e n i f o r m i s 的0 【淀粉酶 ( b l a ) 进行一系列的单个氨基酸置换，得到了若干个耐热性有明显 上升或下降的突变体。结合b l a 的晶体结构，分析发现这些突变体 的突变位点主要集中在d o m a i nb ，这个突变区域存在一个c a n a c a 盐桥结构，结合金属离子，任何减弱或加强这个盐桥结构内部离子间 相互作用力的因素，都会导致b l a 耐热性的大幅度改变。在这个区 域外的另一个盐桥a s p l 2 1 一a r 9 1 2 7 也对b l a 的耐热性有一定贡献【4 2 i 。 h a r t l e y 等对耐热葡萄糖异构酶的研究也得到了类似结论【4 引。 复旦大学硕十论文耐热碱性磷酸酶的业兜降和耐热机制的研究 3 ) 范德华力，氢键、静电作用力和二硫键及亚基相互作用力： 这些作用力与蛋白质折叠所需作用力相同，它们能够减小蛋白折 叠的自由能，使蛋白质的结构变得更加紧密，有刚性，从而起到提高 整体热稳定性的目的，目前对这方面的报道也很多。 4 金属离子 有许多耐热酶是金属结合蛋白，金属离子与蛋白质热稳定性关系 方面的研究时有报道。去除金属离子后，耐热葡萄糖转移酶的四聚体 酶蛋白完全丧失了热稳定性，表明金属离子与耐热葡萄糖转移酶的结 合，对于维持酶蛋白的热稳定性是必不可少的【4 3 】。二价金属离子使人 胎盘碱性磷酸酶a l p 荻得了耐热性，用e d t a 螯合金属离子后，a l p 的耐热性消失【7 1 。g e o r g i e v a 等的研究表明，蝰蛇毒素蛋白上存在c a 2 + 的结合位点，c a 2 + 对其结合位点的充分结合可以将蛋白的t m 值提高 1 1 。而c 0 2 + 离子则能显著提高t h e r r n o t o g an e 碱性磷酸酶o l i t a n a 碱性磷酸酶的热稳定性【4 引。有些嗜热蛋白的热稳定性不受金属子影 响，如来源于极度嗜热菌的铁过氧化物歧化酶( h y p e r t h e r m o p h i l i c a r c h a e o n a c i d i a n u s ) 的t m 值为1 2 8 。c ，是目前已知的热稳定性最高的 酶，它的耐热性与铁离子的结合毫无关系1 4 6 1 。 5 配体结合： 配体与受体蛋白结合，可以降低蛋白质的稳定自由能，增加结构 的有序性，提高它的热稳定性。有研究表明，生物素对其受体链霉抗 生物素蛋白( s t v ) 的充分结合，使s t v 的t m 值由7 5 提高到了 11 2 ，对这种现象的解释是：生物素与s t v 的结合，能加强s t v 一1 2 复旦大学颂士论文耐热碱性磷酸酶的亚克隆和耐热机制的 ! j 究 二聚体亚基问的作用力，使蛋白结构变得更加紧密有序，增强了变性 过程中亚基之间的协同作用，从而大大提高了s t v 的热稳定性1 4 7 】。 还有众所周知的分子伴侣蛋白，它们在蛋白质的折叠和热稳定性中起 着重要作用。 6 外界环境： 蛋白质所处的外界溶液环境也会影响它的热稳定性。如溶血卵磷 脂可以提高碱性磷酸酶对高温及化学变性剂的耐受能力【4 8 】。高渗透压 环境下培养k b 细胞，使k b 细胞中耐热的碱性磷酸酶同功酶的比例 升高。 ( 二) 蛋白质耐热性的改造工程 近几年来，人们对嗜热菌的研究迅速进步，已有越来越多的高温 嗜热菌株和耐热酶被分离、纯化。适应高温极端环境操作的需要，耐 热酶可以取代常温酶或试剂，是工业生产中的一种新型催化剂。耐高 温的多聚物降解酶，如淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶等已被广泛应用于 食品、化工、制药、造纸以及垃圾处理工业中5 们。对于嗜热酶耐热机 制的研究，也越来越成为当前生物领域的热点。它为生物进化、代谢 调控及结构一功能相互关系的研究提供了新的视角；以耐热机制理论 为指导，用基因工程方法对蛋白质的耐热性加以改造，能突破现有生 物研究和3 - 业生产中极端条件下操作存在的局限性，为生命科学和_ t - 业生产的发展带来新的契机。 目前对蛋白质耐热性的改造_ t - 程方兴未艾。改造方法之一是对蛋 白质的内部基团进行修饰，如m e t 和c y s 的脱氨或氧化1 4 引，或者引 一1 3 复旦人学坝卜睑义耐热碱肚磷瞳酶的、限克降和耐热机制的研究 入配体及稳定因子，使蛋白质分子的稳定性加强。另外一种更为常见 的手段是利用基因工程方法置换氨基酸残基，筛选耐热性获得改变的 突变体，氨基酸置换通常采用随机或定点诱变方法。目前有一篇文献 报道了指导蛋白质耐热性改造的策略，前文曾提及蛋白质变性过程的 限速步骤发生在某一个脆弱区域的断裂，这个区域称为“w e a kp o i n t ”， 它是决定蛋白质耐热性高低的分水岭。通过对蛋白质的同源比较，结 合一级、高级结构以及变性机制等方面的信息，可以确定w e a k p o i n t 区域，然后对这个区域加以改造，就能为我们高效、有针对性地对蛋 白质进行耐热性的改造提供极大便利【4 3 1 。 本实验室从筛选到的一株高度嗜热菌( t h e r m u ss p 3 0 4 1 ) 中克隆 到了耐热碱性磷酸酶( f d t a p ) 基因，它在大肠杆菌中的表达产物 是由5 2 k d 亚基组成的同源八聚体，最适反应温度为6 5 ，分解底 物磷酸对硝基苯( 简称p n p p ) 生成黄色产物，在波长4 0 5 n m 处有最 大吸收值。本文在上述基础上，进行了f d t a p 的改造和分离纯化； 研究了影响t a p 耐热性的一些因素，并对它进行了晶体培养和初步 的x r a y 衍射分析。 一1 4 复旦大学颁r i 论文j 尉热碱性磷酸酶的砸克降和耐热机制的川究 材料和方法 1 材料 1 1 菌株和质粒 高表达质粒p t a p 5 0 3 ( p j l a 5 0 3 上克隆有f d t a p 基因全序列的 质粒) ，表达质粒载体p 儿a 5 0 3 ；大肠杆菌宿主菌t g l ；大肠杆菌宿主菌 m p h 4 4 ( f a r a d l3 9 d ( a r a l e u ) 7 6 9 7 d l a c 一7 4 彤舢船i ( r p s l d ( p h o a - p h o c ) p h o r t s x ：t n 5 ) 由本实验室保存 1 2 试剂和培养基 d n a 限制性内切酶n d e i ，b a m h i ：购自美国n e w e n g l a n db i o l a b s 公 司 t 4 d n a 连接酶，d n t p 购自美国p r o m e g a 公司 d n a 聚合酶t a q 由本实验室分离纯化和保存 d n a 测序试剂盒购自g e n e 公司 p c r 引物：在上海生x - 生物x - 程有限公司合成 4 - n i t r o p h e n y lp h o s p h a t e 购自德国b o e h r i n g e r m a n n h e i m 公司 p h e n y ls e p h a r o s ec l 一4 b 柱介质购自a m e r s h a m p h a r m a c i ab i o t e c h 公 司 s d s ，b i s a c r y l a m i d e h ，a c r y l a m i d e ，c a c o d y l a t e ，i m i d a z o l e ，h e p e s ， m p d ，p e g ，2 - p r o p e n o l ，二乙醇胺均购自s i g m a 公司 其他试剂均为国产分析纯 l b 培养基：l 蛋白胨，o 5 酵母粉，1 n a c i ，p h 7 0 2 y t 培养基：1 6 蛋白胨，l 酵母粉，o 5 n a c l ，p h 7 0 溶液1 ：含有5 0 m m o l 葡萄糖，2 0 m m o l lt r i s h c l ( p h 8 o ) ， 10 m m o l l e d t a ( p h 8 0 ) ，8 磅c m 2 湿热灭菌3 0 m i n ，4 保存 溶液2 ：含有o 2 m o l ln a o h ，i s d s ，新鲜配制 复旦人学坝 论文耐热碱忖磷酸酶的听克降和耐热机制的 ! j 1 _ 宄 溶液3 ：含有3 m o l l 乙酸钾( p h 5 2 ) c r y s t a ls c r e e nl i t ek i t ：根据h a m p t o n 公司的配方配制，所用的各种化 学试剂均购自s i g m a 公司 2 方法 2 1 f d 。t a p 基因信号肽位置的确定 采用p c g e n e 软件包f a b a i r o c h u n i v e r s i t y g e n e v a s w i t z e r l a n d 1 9 9 3 ) 进行计算机分析。 2 2p c r 护螬 10 0 “1 a 应体系中含有：2 0 m m o l l t r i s h c l ( p h 8 4 ) ，2 m m o l l m g c | 2 ，5 0 m m o l lk c i ，2 0 “g 明胶，1 0ugb s a ，p t a p 5 0 3 质粒模板 5 0 n g ，d a t p0 2 m m o l l ，d g t p0 2 m m o l l ，d t t p0 2 m m o l l ，d c t p 0 2 m m o l l ，引物各2 5 p m o l ，t a qd n a 聚合酶2 u 。反应条件：9 4 。c - t f i 变，1 9 4 m i n ，然后i ，r 9 4 。c4 5 s ，5 5 4 5 s ，7 2 。c1 2 0 s 反应2 0 个循环，最 后于7 2 延 ( q ，3 0 0 s 。 2 3 质粒抽提 采用碱法抽提质粒d n a ，具体操作参见分子克隆 2 4d n a 酶切、连接反应和d n a 月段的回收： 参见分子克隆 2 5 质粒转化： 2 5 1 感受态细胞的制备 从l b 平板上挑取受体菌，接入l m l 的l b 培养基，3 7 。c 震荡培 养过夜；以2 的接种量转接过夜菌于3 0 m l l b 培养基中，3 7 。c 培养 至o d 6 0 0 约为0 2 ，5 ，0 0 0 r p m 离心5 m i n 收集菌体，将菌体震匀后，加 入1 0 m l 冰浴预冷的0 1 m o l l 的c a c l 2 ，轻轻摇匀，0 c 冰浴中放置 3 0 m i n ；5 ，0 0 0 r p m 离心5 m i n ，弃上清，再加o 5 m l 冰预冷的0 1 m