（生物医学工程专业论文）电聚合固定酶与碳纳米管修饰生物传感器的研究.pdf

浙江大学硕士学位论文 a b s t r a c t t h i sp 印c fs t u d i e sb i o s e n s o r sf o rd e t e c t i n gt l l ec o n c e n 仃a t i o n so f 掣u c o s e 髓du r i c a c i di np h y s i o l o 舀c a ls o l u t i o n ，w l l i c hi sb a s e do na m p e m m e t f i ce l e c t r o c h e m i s t r yu s j n g m o d i 矗e ds c r e e n p f i n t e dc a r b o np a s t ee l e c t r o d e s t l l i sp a p e fp r c s e n t sam e t l l o dt oi m n l o b i l i z e 酉u s eo x i d a s ea n du r i c a s e 血a p o l y p y n d l e 丘h ne l e c 咖p o l y m e r i z e do nt h e s m f 矗o eo fs c r e e n - p r i n t c dc 盯b o np a s t e e l e c t r o d e s p y r r o l ec a nb ee l c c 仃叩o l y m e f i z c dt op o l y p y r r o l ei ne l e 咖p o s “i v em 砒r i x u n d e rp o t e n t i 楣t a t i cc o n d i t i e l e c 咖e g a t i v co x i d 雒ee i l z y m ec a l lb ei m m 曲i l i z e di n t h em a t r i xd l l et ot l | ee l e c t r o s t a t i ce f f c c t b a s e do n an u m b e ro fa s s a y s ，t h e 伽d i t i o no f e l e c t m p o l y m e r i z a t i 衄h a sb c c no p t 蛔i z e d c b m p a f i s o ne x p e r i m e t sb c t 、v e e nt h es e n s o r s w i t h e n z y m e i m m o b 豇i z c db ye l e c t r o p o l y m 枷鞠t i o n柚dt l l o s ew i t h e n z y m e s 佃皿o b i l i z e db ya d s o i p t i h a v eb e e nd o n e t h eb i o s e n s o r sa r cp r c p a db yi m m o b i l j z i n g 出u c o s eo x i d a s eo fu r i c a s eo nt l l e s u i f a c eo fs c r c e n - p r i n t e dc 盯b o np 船t ee l e d f o d 鹪w h i l ep o t 鹤s i u mf e r r i c y a n i d ei s e m p l o y e da st h ee k 咖nm e d i a t o r ，w h i c ha r c c a l l e d “t h et h i f dg e n e r a t i 蚰s e n s o r s ” t h i sp 印e rs h a w st h a tt h ec a r b o nn 蛳o t u b em o d i f ：i c a t i o no nt h ee l e c t m d e si l i l p r o v e st h e s e n s i t i v i t i e s 蛐d 陀s p o n s co f t h es e n s o 墙t og l l l c o s e 鞠dl l r i ca c j d e x p e r i m e m a lr e s u l t st o c o m p a r et h ec h a r a c t e r sb e 押e e nt h ee l e c b o d e sw i t ha n dw i t h o u t 鼬n a n o t u b e m o d 砸c a t i o na r em 啪i n 8 t c d 1 1 1 ea d v 粕t a g e0 fc a r b o nn a t i i b em o d j f i c a t i o ni s 卸a l y z e db a s e do ne l e c n o c h 锄i c a lp f i n c i p l e e x p e r i m 蛐t a lr c 蛐l t sj n d j c a t e t l l a tt h e i n t e r l e r e n c co fa s c o r b i ca c i di t l l ed e t e l m 证a t i o no fu r i ca c i di sn e 酉e c t a b l e k e yw 甜d s ： g l u c o s eo x i d 时e u 工i c a s e ，e l 叫y m 商z 砒0 n ，p o l l j r p y 耐e ，q 旺b o n n a n o t u b e b i o s e n s o r - 浙江大学硕士学位论文 第一部分绪论 第1 章生物传感器概述 1 1 生物传感器的定义及研究意义 从上世纪6 0 年代c l a f k 和l 釉n 提出生物传感器的设想开始，生物传感器的 发展距今已有4 0 多年的历史了。作为一门在生命科学和信息科学之间发展起来 的交叉学科，生物传感器在发酵工艺、环境监测、食品工程、临床医学、军事及 军事医学等方面得到了深度重视和广泛应用。随着人类进入信息化社会和人们对 于健康关心程度的加深，和医学保健有关的传感器技术备受关注，并且发展迅猛。 在生物技术领域迫切需要建立的各种快速分析和优化控制方法中，生物传感 器是目前最受到人们重视的种。生物传感器定义为“使用固定化的生物分子 ( i m m o b i l i z c db i o m o l e c u l e s ) 结合换能器，用来侦测生物体内或生物体外的环境化 学物质或与之起特异性交互作用后产生响应的一种装置”。生物传感器由两个关 键部份构成，一为来自于生物体分子、组织部份或个体细胞的分子辨认组件，此 组件为生物传感器信号接收或产生部份。另一为属于硬件仪器组件部份，主要为 物理信号转换组件。所示为生物传感器的组成框图。 广 i 被测量i il 1 一 。分子识别部分信息转换部分- 酶电化学测量装置：辅助电源 微生物热敏电阻器 l 抗体 f e 汀，i s f e 汀 上 细胞 光敏二极管 一 信号调 1- 叫节转换 组织光纤 电路 激素压电元件 核酸s a w 元件 图1 1 生物传蓐器的组成框豳 信号输出 匕= 浙江大学硕士学位论文 因此，如何以生化方法分离、纯化甚或设计合成特定的生物活性分子 ( b i o l o g i c a la c t i v em a t c r i a l s ) ，结合精确而且响应快速的物理换能器( t r a 船d u c e r s ) 组 合成生物传感器反应系统，实为研究生物传感器的主要目的。生物传感器是化学 传感器的子系统，此类传感器监测及测量的带分析物质也可以是纯化学物质，尽 管其生物组分是目标分析物，其识别元件在性质上是生物质【1 】。生物传感器能对 许多过去难于测定的生化物质进行定量分析。已经在实践中开始应用的生物传感 器都是固定化酶电极，包括葡萄糖、谷氨酸、乳酸、乙醇等多种。 生物传感器因为具有以下优点而引起各国研究者的兴趣： 1 ) 采用固定化生物活性物质作催化剂，价值昂贵的试剂可以重复多次使用， 或者采用微量酶试剂即可达到测量目的，克服了过去酶法分析试剂费用高和化学 分析繁琐复杂的缺点。 2 ) 该种传感器是由选择性好的生物材料构成的分子识别元件，专一性好， 只对特定的底物起反应，一般不需要进行样品的预处理。 3 ) 操作系统比较简单，容易实现自动分析。 4 ) 由于体积小，可以实现连续在位监测。 5 1 分析速度快、样品用量少。 6 ) 传感器连同测定仪的成本远低于大型的分析仪器，因而便于推广普及， 并用于家庭测量。 快速测量血液中葡萄糖浓度和尿酸浓度的生物传感器正引起越来越多人的 关注。因为这种仪器有体积小，便于携带，快速，较为准确等优点。但是血液中 的其他物质可能会对测定造成干扰，比如：抗坏血酸，多巴胺等，所以测定过程 中要考虑到抗干扰的问题。 1 2 电化学型生物传感器 电化学型生物传感器是用电化学方法对生物信号进行测量的传感器。它具有 生物传感器的一般组成，其中固定化的生物体成分作为敏感元件，要求对被测生 物信号具有选择性。可用作生物传感器选择性试剂的生物材料有酶、有机组织、 线粒体、抗体、核酸和激素等。本课题的测量对象是葡萄糖和尿酸等血液中的化 学成分，所以采用相应的酶作为选择性试剂。 浙江大学硕士学位论文 电化学是研究电子导体( 或半导体材料) ，离子导体( 一般为电解质溶液) 和离子 导体，离子导体的界面结构、界面现象及其变化过程与机理的科学。电化学生物 传感器则是指由生物材料作为敏感元件，电极( 固体电极、离子选择性电极、气 敏电极等1 作为转换元件，以电势或电流为特征检测信号的传感器。由于使用生 物材料作为传感器的敏感元件，所以电化学生物传感器具有高度选择性，是快速、 直接获取复杂体系组成信息的理想分析工具。 根据敏感元件所用生物材料的不同，电化学生物传感器分为酶电极传感器、 微生物电极传感器、电化学免疫传感器、组织电极与细胞器电极传感器、电化学 d n a 传感器等。本硕士课题所研究的是酶电极传感器。 医疗保健是电化学型生物传感器的主要应用领域。表1 1 中列出了医疗分析 实验室对人体尿和血样品中各种物质进行常规分析所用的电化学方法【1 】。 表1 1 医疗诊断中所需的常用电化学分析法【1 l 1 2 1 酶学原理 酶是一种生物体产生的，起特殊功能的蛋白质，专司催化专一的底物氧化作 用功能。它在一定条件下仅能影响化学反应速度，而不改变化学反应的平衡点， 并且在反应前后本身不发生变化【2 】。 1 2 1 1 酶分析法特征 在表1 2 中列出了酶分析法的特征【2 】。 浙江大学硕士学位论文 表1 。2 酶分析法的特征【2 l 适用范围酶，底物，辅酶，活化剂和抑制剂。 专一性很高，但原则上容许类似物同时存在。 灵敏度 很高，可达1 0 1 克分子以下；如果和荧光法组合在一起，也可 达l 酽克分子左右。 精确度一般，根据微量吸管误差决定；也取决于组合的方法。 迅速程度一般，酶反应本身多在3 0 分钟以下；通常不需要进行预处理。 简便程度较差，必须有酶的操作训练( 温度、p h 等的确定很重要) 。 经济方面一般，由于酶用量甚微，故不会太贵。 1 2 1 2 酶的活性中心 现已有充分的证据说明，在酶蛋白上只有少数一些氨基酸残摹和催化活力直 接有关。这些残基一般并不集中在肽链的某一区域，也不互相毗邻，往往分散在 相距较远的氨基酸序列中，有的分布在不同的肽链上。在有活力的酶蛋白上，这 些特异的氨基酸通过盘曲折迭，组成比较集中的区域，这个区域就是与酶活表达 有关的区域，称为酶的活性中心( a c t i v ec 胁t e f ) 。按k o s h l a n d 的说法是：酶的活性 中心是酶分子的一小部分，是酶分子中与底物结合并催化反应的场所。就功能而 言，酶活性中心的若干个氨基酸侧链基团，叉可分为底物结合部位和催化部位。 底物结合部位是酶与底物特异性结合的有关部位，也叫做专一性决定部位。催化 部位直接参与催化，底物的敏感键在此部位被作用形成相应的产物。底物结合部 位和催化部位并不是绝对的，有的基团同时兼有两者的功能，它们是相互关联的 整体。1 1 底物结合部位不仅是固定底物，而且要使底物处于被催化的最佳位置。 2 ) 催化部位是在催化反应中直接参与电子授受关系的部位【2 】。 浙江大学硕士学位论文 1 2 1 3 酶的催化机制 酶和底物结合的作用力有三种：离子键、氢键、范德华力。离子键是指底物 上一个带电荷的基团与酶上一种带相反电荷基团的作用，这是一种静电力。氢键 是指底物和酶蛋白的两个负电性较大的原子共同享有其间的氢原子而形成的结 合力。范德华力是指两个原子在相距o 3 加4 n m 时存在的一种非专一性的吸引力 【2 】。 酶的催化作用是由一些基元催化反应组成的，但是这些基元催化反应在酶的 作用过程中又有其独特之处。1 ) 酸碱催化：磷酸葡萄糖异构酶催化葡萄糖以及 一些水解酶都有酸碱催化的机制；2 ) 亲核催化和亲电催化：亲核催化是由亲核 剂所引起的催化反应，以丝氨酸为催化基团的蛋白水解酶等，都有亲核催化的机 制。亲电催化是由亲电剂引起的催化反应，丙氨酸消旋酶等都有通过亲电机制的 反应。3 1 金属离子的催化：很多酶都需要金属离子作为它的辅助因子，有些金 属离子是稳定酶的三维结构的，有些是直接参与催化反应的【3 】。 1 2 1 4 酶促反应动力学原理 反应过程可以用下列式子表示： s + e 毒【e s 】且e + p 注：e 一游离酶；【e s 卜酶底物复合物；s 底物；卜产物： k l ，1 【- 1 是【e s 】的解离常数，以k 表示；耙为【e s 】复合物分解的反应速度常数。 在酶和底物浓度相互接近的条件下，e s 的浓度一般不能保持恒定状态( 稳 态) ，但在底物浓度远比酶浓度高时，酶和底物一混合，e s 的浓度就从o 开始增 加并升至最大( 这段时间最长估计是4 秒) ，最终进入生成速度与分解速度达到 平衡的稳态。 d ( - 邑，) d t 鲁向后s 一七一，( 五s ) 一七2 | ：e 譬) 一o( 1 ) v 一正p 出a k ( e s )( 2 ) 设酶的初始浓度为e 0 ，则有如下关系式： 瓦- e + 嬲( 3 ) 浙江大学硕士学位论文 根据以上三式，就可得到著名的m i c h a e l i s m e n t c n 方程： v 一刮拈畿。器 一 这里，吆= 七：凰，玉毛= 仲一。+ 屯) t 。v 。是最大的反应速度。k m 称为米氏 常数，它是使反应速度能达到v 。2 时的底物浓度【4 】。 1 2 1 5p h 对酶反应速度的影响 大部分酶的活性受其环境p h 的影响。在一定的p h 条件下，酶反应具有最 大的速度。高于或低于此值，反应速度下降，通常称此p h 值为酶反应的最适p h 。 1 ) p h 的改变可以破坏酶的空间构象，引起酶活的丧失；2 ) p h 的改变影响酶活性 中心催化基团的解离，从而使得底物转变成产物的过程受到影响；3 ) p h 的改变 影响酶活性中心结合基团的解离状态，使得底物不能与其结合【2 】。 在葡莓糖反应中，p h 值在4 0 。6 o 之间葡莓糖酶有较大的活性，本实验中采 用的是p h 5 0 的柠檬酸缓冲液。 在尿酸反应中，p h 值在7 乱1 0 o 之间尿酸酶有较大的活性，最好的应该是 7 0 ，故而，本实验中采用的缓冲液即为p h 7 0 的磷酸缓冲液。 1 2 1 6 温度对酶反应速度的影响 温度对酶反应的速度也有很大影响，一方面当温度升高时，与一般的化学反 应一样，反应速度加快；另一方面，随着温度升高而使酶蛋白逐步变性，反应速 度随之下降。因此，酶反应存在一个最适温度。最适温度往往受到作用时间、酶 的浓度、底物、激活剂或抑制剂等因素的影响【2 】。本实验中，温度在2 0 一2 5 效果最好。 1 2 1 7 缓冲液对酶的影响 缓冲液的种类也会影响酶的稳定性，例如t r 盐酸缓冲液在p h 值7 5 以 下缓冲能力较弱，而且有时会抑制某些酶的反应；另外有些酶在磷酸缓冲液中冻 结会引起失活，也应注意( 这是因为硫酸氢根离子和磷酸氢根离子的溶解度对温 浙江大学硕士学位论文 度的依赖性不同，冻结时引起局部p h 下降的缘故) 。 1 2 2 电极过程动力学 1 2 2 1 电化学行为研究 一个体系的电化学行为的研究，包括维持电化学电池的某些变量恒定和观察 其他变量( 通常指电流、电势或浓度) 怎样随受控量的变化而变化【4 】。 1 2 2 2 法拉第过程和非法拉第过程 电极上发生的有两种类型的反应过程。一类是电荷经过金属( 非金属卜溶液 界面进行的传递过程。这种电子的传递引起氧化或还原反应的发生。因为这些反 应由法拉第定律( 即由电流流过所引起的化学反应的量与通过的电量成正比) 所支 配。发生法拉第过程的电极有时叫做电荷传递电极。在某种条件下，个给定的 电极一溶液界面，将会显现出这样的电势范围，在此范围内不发生电荷传递反应， 因为这样的反应无论从热力学还是从动力学上看都是不利的。然而，象吸附和脱 附这样一类过程则可能发生，而且电极溶液界面的结构可以借改变电势或溶液 组成而改变，这些过程称为非法拉第过程。在我所作的研究巾，主要是法拉第过 程【4 】。 1 2 2 3 电极过程 一个总的电极反应d + p 一寻= 壬r 是由一系列步骤组成的，其结果使溶解的 氧化物质o 转化为在溶液中的还原的形式r 。一般说来，电流由一些过程的速度 控制，诸如： 1 ) 物质传递( 例如o 从本体溶液到电极表面) 。 2 ) 电极表面上的电子传递。 3 ) 电子传递的前置或后续的化学反应。在本研究中，该过程是异相过程， 因为在电极上发生了催化分解。 钔其他的表面反应，如吸附，脱附，或者结晶( 电沉积) 。 图1 2 描述了一般的电极反应过程【4 】。 浙江大学硕士学位论文 l 本体湃滚 ；l 薹 ；o “m ，； ：i ! ； i 毡擞 ! 漱 r ! 蔷器r ，兰罢汀! t n p ；黪 攀 ：l 黧 栌孙们j 1 2 - 2 4 电化学检测方法 图1 2 一般的电极反应的途径【4 1 恒电位法是强制工作电极的电势相对于参比电极的电势恒定，而电流则作为 时间或者电势的函数来测量，也叫做计时电流法。在本研究中，采用的是电流作 为时间的函数来测量的。恒电流法与此相反，即控制电流保持电流为恒量，而电 势成为了因变量，电势是作为时问的函数来测定，也叫做计时电势法。 两者的比较； 1 、控制电流试验的仪器比控制电势试验所需耍的恒电势仪简单； 两者的数学处理不同。在恒电流实验中，表面边界条件是基于电极表面 上已知的电流或流量( 即浓度梯度) ，而在恒电势法中，在x - 0 处，浓度 构成了边界条件。 3 、恒电流法的缺点是：双电层充电的影响较大，而且要通过实验之间校正 不容易。在恒电流方法中，多组元体系和分步反应的数据处理更复杂， 而且，所观察到的e t 暂态波形往往远不如电势扫描的i - e 曲线清晰。 循环伏安法，是将电位进行线形扫描，记录电流与电位的关系的方法。当电 极表面的氧化物( o x ) 由于还原过程而减少时，其理所当然要被还原物质皿) 所取 代，其通过扩散作用进入到溶液中。如果从峰的正值这一边逆向电位扫描，可以 观察到逆向效应。当电位扫描反过来朝向氧化还原电位时，还原物质将开始被在 氧化为o x 。而电流现在将在负值( 氧化) 方向增加直至q 达到氧化反应峰值【1 】。 浙江大学硕士学位论文 1 2 2 5 计时安培测量法 两电极恒电位法也叫做两电极计时安培测量法，是用两个指示电极在他们之 间施加一个恒定的小电势，测量电流随时间变化的函数。这两个电极一个是工作 电极，另一个既是参比电极也是对电极。其中电流计受物质传递又受电荷传递动 力学控制。处理象d + n e r 这样的反应，根据电化学原理，可得： 巧o ，。) ：旦+ 一0 弦七，d o ) l “ s g o ，5 ) - 静o p 巾7 舭( 6 ) 式中言( d d 哦) 1 7 2 对于可逆情况，根据下述条件可求a ( s ) ： 者一d o ( 旦宅等峻。= t ，c 口( o ，t ) 一k g ( 叽) 仍 式中七，一七一“7 5 一p + ，及七b 一七。e f l _ 4 ) ，啦一r ，且，。f 月t ( 7 ) 式的变换是： d d 拦掣) 。；七，_ ( 0 ，。) 一屯i _ ( 0 ，。) ( 8 ) 批 。 一 式中h 一专+ 南( t 0 ) 眦研卿导一籍( 1 1 ) s u 1 1 s t h + s - 、 由得蚴【掣k - 糯( 1 2 ) d x s i 盯+ s l 或进行拉普拉斯逆变换为： f p ) tn e 位，c ：e x p ( 日2 f ) 啦( 胁“2 ) ( 1 3 ) 对于初始r 为g + 的情况，方程式( 1 3 ) 变成 f ( f ) 一，删僻f c 。+ 一k q ) 唧暇2 f ) 啦( 日f “2 ) ( 1 4 ) 在恒电势下，t ，、吒以及h 是常数，并且由于x = 0 时p ，e r ，c o ) t 1 和 浙江大学硕士学位论文 l i m # ，e ，c ( 砷一0 ，所以电流一时间曲线形状如图1 3 所示。要注意，迟缓的动 力学使t = o 时的电流限制在一个与t 成正比的有限值。 图1 3 恒电位标准电流时间曲线 其中，c d 是氧化物的本体浓度，g 是还原物的本体浓度，d 。是氧化物的 扩散系数，珥是还原物的扩散系数，a 是电极面积，s 是拉普拉斯平面变数，x 是离电极的距离，f 是1 摩尔电子的电量，i 是电流，七 是氧化的非均相速度常 数，t ，是还原的非均相速度常数，n 是每一分子氧化或还原的电子数，h 是焓， 舻是标准( 本征) 非均相速度常数【4 】。 计时安培测量法是明显有扩散控制效应的技术，其修正形式特别适用于生物 传感器，替代电位扫描过程f 1 】。图1 4 【5 】中的对电极可以保证参比电极上没有电 图1 4 兰电极恒电位实验装置示意固1 5 l 浙江大学硕士学位论文 第2 章生物传感器技术 2 1 电极基底制备技术 传感器制造中一个主要考虑方面为小型化问题。目前在开发研制体积小的传 感器方面有三种技术：即用丝网印刷的厚膜技术、薄膜技术和微型电极技术。 2 1 1 厚膜丝网印刷 丝网印刷工艺在印制板生产过程中已经得到广泛的应用，不仅仅是单面板、 双面板而且多层印制板的电路图形的转移，阻焊剂、字符标记等都采用了丝网印 刷工艺。 1 ) 网框材料的选择 一般选用l y l 2 、u 砣等硬质会金铝方管型材，尺寸选用宽2 响m ，厚2 0 m m ， 四角用氩弧焊接或铆接加工而成。金属框架精度高，尺寸稳定。 2 1 丝网材料的选择 目前用得最多的是尼龙丝网和涤纶丝网。尼龙丝网耐热性较差，受热后易产 生热塑性变形，使张力不均匀，影响网印质量。粘结绷网或丝网模版制作不宜高 温烘烤。涤纶丝网耐热性较好，尺寸稳定，图形不因温度和湿度的变化产生较大 的变动。为了保证网印图形精度最好选用单丝涤纶丝网。同时应选用丝网目数较 高，丝径较细，网眼较小的丝网，丝网的颜色以黄色或棕黄色为好，以防产生晕 影。 3 1 绷网 绷网是一个不可勿视的环节，要制出高精度的印制图形首先要求绷网符合质 量要求，最好采用气动绷网机，绷网的质量要求如下： 绷网张力合适、均匀 并非张力愈大愈好，张力过大，超出材料弹性极限，丝网就会丧失弹性， 变脆甚至断裂。张力不足丝网松软，缺乏回弹力。应按照额定张力，再根据 作业条件给以考虑，使其整个随皈面上张力均匀。 浙江大学硕士学位论文 经纬网丝保持垂直 绷好的丝网的经纬线应尽可能与网框边保持垂直，绷网时是正拉丝 网，即力与丝向保持一致；二是被网夹夹持着的丝网拉伸时能横向移动。 防止松弛 为了减小绷好的网随时间的推移，网版会变松或越用越松，产生张力下 降，应采取持续拉网和反复拉紧绷网方法，使一部分张力松弛于固网前完成。 4 ) 丝网模版制版工艺 目前用得最多的是直接法制作丝网模版，在此制作工艺中注意上胶涂层的厚 度合适，严格控制干燥、曝光、显影等环节，方能得到高质量的丝网模舨。 在丝网印刷图形加工过程中，首先要求印料性能良好，其次必须严格控制印 刷设备、工装、刮板、网距、刮印压力等工艺因素。 1 ) 印料必须具备以下性能： 化学稳定性好；干燥速度适宜；对敷铜箔板粘附性能好；粘度合适、触变性 好、颜色合适；透印力好；便于干燥。 设备工装 采用印刷精度较高的丝网印刷机可排除许多人为不稳定因素，定位工装可直 接利用机台面纵向可调定位销定位( 定位孔可由数控钻钻制) 。 3 1 其它工艺因素 刮板材质、刮板宽度、硬度、刮印角度、刃口状态及网距、刮印压力等都很 重要，应选用聚酯橡胶制作刮板。刮板宽度适当，过宽易造成图形失真，刮板硬 度多数在肖氏a 6 0 8 0 范围之内，刮印角度为2 0 3 0 。，刃口须经常保持平锐。 网距一般为2 4 n m 且网版平行于台面，刮印压力以印出清晰图形为宜。 考虑丝网中某一小段网丝p ，它受到来自四周的拉力和重力的作用，其合力 使网丝产生一个偏离平衡位置的运动。网丝上的图形也产生相应的位移。当刮刀 运动到该小段网丝的正上方时( 如图2 1 ) ，它的等效受力模型如下：沿刮刀长度 方向的拉力( 图中x 轴) ，偏离z 轴的刮刀压力n ，基板的支撑力n ，在y z 平面 内的丝网拉力t ，、r 、磨擦力f ，粘滞力f 和重力，其合力把涂有浆料的网丝压 印在基板上。在基板上产生的图形点p 与丝网不受刮刀压迫时的图形点p 相比， 在x y 平面上会有一个位移。该位移与刮刀在z 方向的移动距离a 、丝网的张力 浙江大学硕士学位论文 等参数有关，还与刮刀的尺寸有关。 围2 1 丝网印刷示意图 工作电极通常为石墨粉“油墨”印刷在聚酯材料上。参考电极常为银氯化 银油墨。合适的修饰组分可配入碳油墨，如金、汞等，催化剂如酞菁和二茂铁等 用来催化电子传递，( 具体将在2 3 节介绍) ，或者是酶，诸如葡萄糖氧化酶、尿 酸酶等。研制的产品具有小型化、多用途、便于大规模批量生产和廉价等优点【1 】。 2 1 2 薄膜技术 薄膜技术被用于为“灵巧”电化学传感器制造集成电路硅片。在一定的基底 上，用真空蒸发、溅射、化学气相沉积、等离子气相沉积、外延、电镀等工艺技 术，制成金属、合金、半导体、化合物半导体等材料的薄膜，薄膜厚度为零点几 微米至几微米，这种加工技术成为薄膜技术。利用薄膜技术制作的敏感元件，具 有成品率高、参数一致性好、性能优良和成本低廉的优点【6 】。 采用薄膜电极的薄层式电池可快速地完成少量溶液的氧化或还原反应，这样 就可以进行快速电量法分析。固态气体传感器利用的就是薄膜电极，例如在4 0 0 下用二氧化锌薄膜电极可以检测二氧化碳含量。电极表面上吸附气体造成电导发 生改变，然后对电导进行测量。更常用的是二氧化锡气体传感器，掺杂了钯的二 氧化锡传感器只有0 趴m 厚，有很好的气敏性。如果因为某种气体的存在而造 成p 型和n 型两类半导体( 主要为后者) 的电阻由高变低，那么这种气体在这里作 浙江大学硕士学位论文 为电子供给体。 半导体吸附少量氧气，氧气与半导体中的过量电子发生反应，依照下式： d 2 + 知一呻2 d 一吸附 然后表面氧化合物与气体发生反应，如下式： g + d 一吸附 g 0 k 附+ e 一 反应结果可以从氧化锡电导增加效应检测到【1 】a 2 1 3 微型电极 微型电极，也称作超微型电极，尺寸范围为1 1 0 “m 。采用微电极大大拓展 了能够用于电分析技术的样品采集环境和预期实践度量范围。此类电极具有的 表面积比人的头发丝的横截面面积还要小许多倍，其适用操作电流范围小到皮安 培与纳安培之间，并且具有稳态的响应和短的响应时间。电极被制成圆盘状、带 状、筒状、环状以及阵列式。简单的圆盘电极可通过将铂丝或碳纤维嵌入到玻璃 或环氧树脂之中，而后将圆盘横截面浸入到溶液制成。现在流行的生物芯片就是 阵列式的微电极。 由于其尺寸很小，双电层电容低，所以其感应电流很大( 相对于其本底电容 电流而言1 。再者由于电流数值小，其m 电位陡然间小，就可实现在高电阻介质， 如低极性的有机溶液中简便使用【1 】。 2 2 酶固定化技术 为了延长酶电极的寿命，需要将酶固定在电极上。这也是提高酶的稳定性的 好方法。最早的固定化酶是1 9 5 3 年制备的。通常的固定化方法大体可概括为四 种类型：吸附法，( 又包括物理吸附和离子交换吸附法) ；共价偶联法；交联法和 包埋法。 浙江大学硕士学位论文 表2 1 四种固定酶方法的优缺点比较 作为固定酶的载体，聚合物已经得到了更多更广泛的关注。聚合物的多分子 层具有三维空间结构的特征，可提供许多能利用的势场，其活性基的浓度高、电 化学响应信号大，而且具有较大的化学、机械和电化学的稳定性，无论从研究和 应用方面均有发展前景吲。 一般的，聚合物薄膜的制备对基底电极的表面状态要求不苛刻。修饰的聚台 物有的是电子导电的或是非导电的，往往靠某种化学吸附作用或对所接触溶液呈 现低溶解度而接着在电极表面上用。 从聚合物出发制备的修饰电极可以通过蘸涂、滴涂和旋涂法实现，这是一类 最简单的制备聚合物薄膜电极的方法，也可以通过氧化、还原电化学沉积法实现， 此法是基于聚合物的溶解度随氧化( 或离子化) 状态而变化实现的【7 】。 从单体出发制备的修饰电极可以通过电化学聚合实现。通过电聚合的方法在 电极表面形成一层带有电性的导电聚合物膜，同时带有相反电性的酶分子可以通 过静电吸附和范德华力的作用镶嵌在该网格中，实现了酶的固定化。这也是包埋 法的一种。 2 3 响应增强技术 增强电极响应可采用各种不同的方式。电子媒介体被用于溶液中难以直接电 解物质的电子转移；采用新的电极物质如有机导电盐可改进电解速率；直接电子 转移可能是增强酶传感器响应的最好手段，但迄今为止，远未达到其潜在的能力， 浙江大学硕士学位论文 酶循环等技术也已被用于提高灵敏度与降低检测限。 2 3 1 电子媒介体 采用氧化还原酶的安培传感器通常采用氧作为电子媒介体，在底物转化为产 物后使酶再循环，但这种方法具有如下局限性： 1 1 响应信号与氧分压或溶氧关系较大，而且，当溶氧的浓度不是足够大时， 难以对高含量底物进行测定； 2 1 当由酶促反应产生的过氧化氢以足够高浓度存在时，可使很多酶去活化； 3 1 需采用较正的电位，抗坏血酸和尿酸等电活性物质也会被氧化，产生干 扰信号。 采用电子媒介体可部分解决上述问题，使得响应的线性范围拓宽，过电位降 低【8 】。同时，嗓音、背景电流、及干扰信号均减小，且由于消除了过氧化氢，使 得生物传感器的工作寿命延长。这种采用相对低分予量氧化还原体代替氧的生物 传感器称为第二代生物传感器，其基本原理如图2 2 所示 7 。 m 刚 图2 2 有电子传递剂参与的电化学反应的原理 m i c d ：电子传递剂的还原态，m 矗：电子传递剂氯化态； 董钿：酶的还原态；e d x 酶的氧化态。 优良的电子媒介体应具备如下性质： 1 1 可与酶的氧化还原辅基快速反应。 2 ) 能吸附或滞留在电极表面。 3 1 呈现可逆的电极反应动力学。 4 ) 具有较低的氧化还原电位，并与p h 无关。 5 1 氧化和还原形式能稳定存在。 6 ) 对氧惰性或非反应活性。 毯k 江大学硕士学位论文 应是无毒性的。 可应用的媒介体有很多种，最早用来代替氧的电子媒介体为铁氰化物和醌 【8 】。 2 - 3 2 有机导电盐电极 有机导电盐成分可用作多种酶的媒介体，其有机导电盐本身也可作为电极材 料。一般来说，有机导电盐是通过从给体( d ) 向受体( a ) 部分电子转移形成的稳态 电子转移配合物，具有典型的平面分子结构，在分子平面的上部和下部均具有离 域的p 电子密度。典型的例子是给体四硫富瓦烯和受体四氰醌二甲烷【7 】。 ，不同有机导电盐具有如下共同特征： 1 1 需有分开的堆积结构，即所有的给体分子为一种类型的堆积，而所有受 体分子为另一种类型的堆积； 2 ) 给体( 或受体) 通过电子的失去( 或获得) 需形成新的芳香性六隅体，以保证 堆积问电荷载体的流动性； 3 ) 堆积间发生部分电子转移【7 】。 2 3 3 酶循环与酶法溶出 酶循环：酶电极中，偶合的酶反应可能是串联型的，也可能是竞争型的。后 者采用了两种酶对同一底物的竞争，而在前者中，第一种酶的产物为第二种酶的 底物，从而催化了电化学控制的转化。如果选择一种酶的序列，使得第二种酶的 产物又是第一种酶的底物，则可发生底物循环，导致酶传感器的响应放大，因此， 这类酶耦合称为酶循环或酶法放大。这种酶循环使得少量被铡物可比其童接转换 产生较多的电化学活性产物，从而增大了分析信号并降低了检测限。 酶法溶出：通过富集与被测物反应转化的产物可显著提高响应的灵敏度。这 种钡4 定方案的另一重要意义在于，由于测定信号是通过在得到基线后加入辅助反 应剂而再生的，因此消除了样品加入产生的干扰电化学信号，即改变了背景电流。 采用上述酶循环和酶法溶出体系的局限为，由于测定需在每一种酶最好的工 作条件下进行。因此，所用的酶越多，越难找到最好的工作条件。同时，传感器 的寿命则取决于最不稳定的酶的寿命【7 】。 豌江大学硕士学位论文 2 3 4 纳米材料修饰 1 9 9 1 年发现的碳纳米管由于其特有的结构，具有优良的电学特性和机械特 性，成为一种很好的电子传递剂。碳纳米管有很大的比表面积，具有相当好的生 物催化特性。实验结果表明碳纳米管修饰生物酶传感器能大幅度提高生物酶电极 的敏感性和敏感范围。在这个过程中，一方面和酶分子的活性中心结合，可以加 速酶分子到电子中间体的电子传递过程；另一方面和电极表面碰在一起，这根纳 米导线也能扩展电极空间，提高和电子中间体的接触空间。不论接触到哪个，都 有利于电子传递时问缩短，从而提高晌应电流。 蚕江大学硕士学位论文 第二部分实验、结果及分析 第3 章电聚合技术在生物传感器酶固定化中的应用 3 1 研究背景 3 1 1 导电聚合物生物传感器概述 生物传感器的制造中很重要的一步就是酶的固定化。使用导电聚合物固定酶 制得敏感元件从而得到的生物传感器可以称之为导电聚合物生物传感器。自从 1 9 8 6 年f 0 u l d s 【9 】首次将葡萄糖氧化酶固定在聚吡咯上制成了聚吡咯葡萄糖传感 器后，许多研究工作陆续开展起来，先后用各种导电聚合物作为载体材料制作了 多类酶传感器、免疫传感器、微生物传感器等。 3 1 1 1 导电聚合物 导电聚合物含有rn 电子骨架，这使它们拥有了一些不同寻常的特性，比如 电导性，较低的能量光学转换，低的质子电位和高的电子亲和力。导电聚合物中 的这种延伸的( 共轭系统有单双键两种，并且是交替存在的【1 0 】。目前，导电 聚合物已经被广泛的应用于电催化、膜分离和挑色印刷技术中。特别要指出的是 导电聚合物的发现给化学传感器和生物传感器的设计提出了新的技术。许多研究 指出氧化还原酶可以掺杂在聚毗咯【1 1 1 9 】、聚苯胺【2 0 - 2 4 1 和聚噻吩【2 5 ，2 6 】网格 中，并固定在铂、玻碳和金电极上。图3 1 是三种电聚合物的化学结构式。 音 。 七。一腿去 。七p p p y p nr t h 图3 1 三种导电聚合物化学结构式 1 1 聚毗咯 目前研究最多的是聚毗咯( p p y ) 。在硫酸溶液中毗咯单体可以很容易的通过 h 浙江大学硕士学位论文 电化学方法聚合在铂电极上。但是不溶于有些有机溶液是使聚吡咯广泛应用的一 个障碍。吡咯单体 y ) 是一种c 、n 五元杂环分子，在电场或氧化剂( 如：双氧水、 氯化铁和高氯酸锂等) 的作用下可以被氧化，进而发生聚合反应生成高分子聚合 物。聚吡咯的合成机制是：首先单体失去一个电子而被氧化为正性原予团，接下 来就是正性原子团的二聚、三聚直至生成聚合度为n 的链状分子。在这一系 列反应中，二聚反应是控制步骤。由于正性原子团间的静电斥力的存在，必须借 助支撑电解液中的掺杂阴离子在其之间起到“桥梁”作用，使得齐聚反应以较快 的速度发生，并且在聚合过程中阴离子按固定的比例以电荷补偿的方式同聚合物 主链相连接，最终得到聚吡咯【2 7 】。聚吡咯具有较高的电子电导率、良好的电导 环境稳定性以及优异的机械性能【2 8 】。 2 1 聚苯胺 聚苯胺( p a n ) 早在1 8 6 2 年被h k t h e b y 发现。聚苯胺大分子链是由苯二胺和 琨二亚胺组成的，掺杂后的导电性能更好【2 9 】。它可以通过电化学合成法和化学 合成法制备，具有合成简便、耐高温、抗氧化性能和环境稳定性能好，并兼有可 逆氧化还原反应的特性【3 0 】。 3 ) 聚噻吩 聚噻吩及其衍生物也可用化学或电化学等方法制得，并用这两种方法使其掺 杂导电【3 1 】。烷基取代聚嚷吩被认为是主链堆积呈层状排列而烷基侧链互相交错 类似于“梳子”的结构。掺杂和温度会影响侧链的运动并对主链的构象造成很大 影响。掺杂过程导致噻吩环中的硫和碳原子发生极化，而加热又使高分子链回复 到类似于单体的结构状态【3 2 】。 3 1 1 2 导电聚合物生物传感器现状 u 粕g 和( = l i o u 利用恒电流法在铂电极上电聚合生成聚吡咯膜，同时将p h 7 0 的缓冲液中葡萄糖氧化酶( g o d x ) 固定在电极表面，制得了一种测定葡萄糖的生 物传感器。他们研究了不同电聚合条件下制得的传感器的性能。光学显微镜下 p p y ，g o d x 的色彩形态显示g o d x 被聚吡咯膜完全覆盖。当聚合电解液中的吡咯 单体浓度高于0 0 7 5 m 时，生成的聚吡咯是层有效阻止葡萄糖扩散的屏障。考 虑到灵敏度和选择性，最佳的恒电流聚合条件是0 0 5 m 吡咯，0 5 m 咖l g o d x ， 浙江大学硕士学位论文 3 8 2 钒2 的电流密度和5 0 r n q c m 2 的聚合电量。该传感器的线性范围是 o 1 2 m m ，灵敏度为1 1 础咖n a 【1 1 】。 m 等人设计了一种微型生物传感器，可以测定全血中的葡萄糖浓度。该传 感器是一个有着酶金属电极阵列的集成单片机电路，可以得到4 7 0 n 刖c i n 2 m m 的 灵敏度和0 5 0 m m 的线性范围【1 2 】。 w 抽g 和m u s 锄c h 研制了一种一步法制备的酶电极，他们在玻碳电极上生成 聚吡咯的同时掺杂了碳纳米管( ( n d 。循环伏安法( o o 9 v ，o 1 v ，s ) 的聚合曲线显 示负电性的q 盯在聚合膜的形成过程中被固定在电极表面，同时保持了自身的 电中性和电催化特性。该传感器可达到0 m m 的线性范围【1 3 】。 o u 等人通过电化学方法在金电极表面生长了一层导电q 盯阵列，然后在含 有吡咯单体和g o d x 的电解液中进行电聚合，同样可以得到一层聚毗咯，并且其 中镶嵌了g o d x 。通过这种方法制备的传感器对2 5 2 0 m m 的葡萄糖有线性响应 1 4 】。 o l i v i a 等人用掺杂硼的金刚石微电极制造了一种灵敏稳定的在体葡萄糖生物 传感器。该电极用铂纳米粒子修饰，通过恒电位法m 7 v 1 在含2 0 l n m 毗咯单体的 氯化钾溶液中中聚合1 5 分钟，同时固定葡萄糖氧化酶。该传感器的线性范围是 1 7 0 m m ，可以稳定的保存3 个月，并且抗坏血酸对其无干扰【1 5 l 。 r a j e s h 等人在恒电位( 0 8 vv s s c e ) 聚合吡咯的过程中将酪氨酸酶和电子传 递剂亚铁氰化钾同时固定在铟锡氧化物玻璃电极上，制成了苯酚传感器。在 + 0 1 2 v v s a a g c l 的工作电位下可以检测苯酚，并且有4 5 1 0 7 劬m 的线性范围 和o 3 3 a f 1 的灵敏度【1 6 】。 d a l 等人在铂电极上电聚合吡咯，同时捕获固定了胆固醇氧化酶和电子传 递剂二茂铁单羧基酸或酱鲁士蓝。该传感器最低可以检测到1 2 4 m 的胆固醇， 灵敏度可达8 8 5 1 n 舭n m 【1 7 ，1 8 】。 蝴a r i 等人在铁电极上分别使用恒电流法和恒电位法聚合苯胺，同时葡萄 糖氧化酶固定在5 0 m 厚的聚苯胺膜中。研究显示在钝化的铁电极上的聚苯胺膜 更加稳定。在0 1 3 v 工作电位下测量葡萄糖，可以得到2 5 1 0 - 5 3 1 0 - 3 m 的线 性范围，检测下限为8 1 0 r 6 m 【2 0 1 。 p 锄d c v 等人研制了一种电位法测量肌氨酸酐的传感器，该传感器包含一个双 浙江大学硕士学位论文 酶反应堆( 肌胺酸和肌酸酶) 和尿素生物传感器。尿素生物传感器是通过电聚合苯 胺固定尿素酶在一种新型的p h 传感器上制成的，使用的方法是循环伏安法，在 - o 7 2 o vv s a 必g a 之间进行循环扫描。该新型传感器的检测下限为瓤m ，相 应的检测肌氨酸酐的下限为1 0 毗m 【2 1 】。 3 1 2 导电聚合物生物传感器原理 通过电聚合方法，在电极表面生成导电聚合物膜，它一般是一层带有电性的 网格，在一定的p h 值和电位下，如果酶带有相反的电荷，在电聚合过程中，酶 就可以通过静电作用和范德华力的作用镶嵌在聚合物网格中，实现酶的固定化。 在生物传感器的测量过程中，被捕获在聚合物网格中的酶仍具有酶的活性，可以 专一的识别底物，形成酶底物结合体，并发生化学反应，与电极发生电子传递， 产生电流，该电极过程见图3 2 。 图3 2 导电聚台物生物传感器电极过程 3 1 3 导电聚合物固定酶的方法 1 1 恒电位聚合法： 恒电位聚合法采用三电极系统，工作电极、参比电极和对电极或称辅助电极