（生物医学工程专业论文）一种递送基因的非病毒载体纳米颗粒的研制.pdf

硕士学位论文 英文摘要 a b s t r a c t o b j e c t i v e ：t op r e p a r ed n a c h i t o s a nn a n o p a r t i c l e ，ak i n do fn o n v i r u s c a r r i e ru s e di ng e n et r a n s m i s s i o na n di n v e s t i g a t ei t s p h y s i c o c h e m i c a l p r o p e r i t i e sa n dt r a n s f e c t i o ne f f e c ti nv i t r ot oe v a l u a t et h ep o s s i b i l i t yo fi t s a p p l i c a t i o ni ng e n ed e l i v e r y m e t h o d s ：c h i t o s a nn a n o p a r t i c l e sa c t i n ga s g e n e v e c t o r sw e r e p r e p a r e db yp o l y m e r i dd i s p e r s i o n m e t h o d p e g f p - c1 c h i t o s a n n a n o p a r t i c l e s w e r e p r e p a r e db y e l e c t r o s t a t i c a d s o r p t i o n ，t h ef o r m e ra c t i n ga sr e p o r t e rg e n e t h ea p p e a r a n c e so ft h e n a n o p a r t i c l e sw e r es u r v e y e db yt h es c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p ea n dt h e a t o m i cf o r c em i c r o s c o p e t h eg r a i nd i s t r i b u t i o na n dz e t ap o t e n t i a l so ft h e n a n o p a r t i c l e s w e r ed e t e r m i n e dw i t ht h el a s e r g r a i na n a l y z e r t h e c y t o t o x i t i e so ft h ec h i t o s a nn a n o p a r t i c l e sa n dl i p o f e c t a m i n et oh e pg 2 a n dl - 0 2c e l ll i n e sw e r ee x a m i n e db yt h em t t a s s a y d n a s eia s s a yw a s u s e dt o s t u d y t h e g e n ep r o t e c t i o n e f f e c to ft h ed n a c h i t o s a n n a n o p a r t i c l e s t h e t r a n s f e c t i o na c t i v i t i e so ft h e c h i t o s a n p l a s m i d n a n o p a r t i c l e sw e r eq u a l i t a t i v e l ya s s e s s e db ya ni nv i t r og e n et r a n s f e c t i o n t e s t t h et r a n s f e c t i o ne f f e c tw a sd e t e r m i n e db yi n v e r s i o nf l u o r e s c e n c e m i c r o s c o p ea n df l o wc y t o m e t r y w et e s td i f f e r e n td o s eo fg e n ew h i c h i s t r a n s f e r r e dt od e t e r m i n et h eb e s tc h a n c eo ft h e 仃a n s f e c t i o n w | et e s tt h e c h a n g eo ft h et r a n s f e c t i o na c t i v i t ya f t e rt h ep a r t i c l e sw e r em o d i f i e dw i t h m s s p e gr e s u l t s ：c h i t o s a nn a n o p a r t i c l e sw i t hp o s i t i v ec h a r g e sc a n i i p r o t e c tt h ed n a f r o md e g r a d a t i o nb yd n a s ei t h ed n a c h i t o s a n n a n o p a r t i c l e sw i t h o u tm s s p e gm o d i f i c a t i o nc a nt r a n s f e c tc o s 7c e l l s ， a n dt h eg e n ec a ne x p r e s si nt h e s ec e l l s ，b u ti t st r a n s f e c t i o ne f f e c ti sv e r y l o w , w h i c hi s 11 6 t h eb e t t e rd o s eo fd n aw h i c hc a nb et r a n s f e r r e di s 1 6 i t g a f t e r t h e p a r t i c l e s w e r em o d i f i e dw i t hm s s p e gt h e i r t r a n s f e c t i o na c t i v i t yw a ss t i l lr e m a i n e d t h et r a n s f e c t i o ne f f e c ti s2 2 6 ， a n dt h eb e t t e rd o s eo fd n aw h i c hc a nb et r a n s f e r r e di s2 4 l a g i ti s i m p o r t a n tt of i n dt h a t i nc o s 7c e l l l i n e st h et r a n s f e c t i o na c t i v i t yo f p e g l a t e n a n o p a r t i c l e s i s i m p r o v e d c o n c l u s i o n ：t h e c h i t o s a n n a n o p a r t i c l e sc a nd e l i v e r yt h eg e n ei n t oc e l l sa n d t h eg e n ec a n e x p r e s s ，s o t h ec h i t o s a nn a n o p a r t i c l e sa r ew o r t hs t u d y i n ga sg e n em e d i c i n ec a r r i e r s k e yw o r d s ：c h i t o s a n ，g e n e ，n a n o p a r t i c l e ，m s s - p e gt r a n s f e c t i o n i i i 原创性声明 本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的 地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包 含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共 同工作的同志对本研究所作的贡献均已在在论文中作了明确的说明。 作者签名：丝州日期：2 0 0 7 年1 2 月2 4 日 关于学位论文使用授权说明 本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校 有权保留学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位 论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论 文；学校可根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文。 作者签名：趁彩u 导师签名： 日期：2 0 0 7 年1 2 月2 4 日 硕士学位论文 研究背景 研究背景 1 9 9 0 年，f r e n c h 等把腺嘌呤脱氨酶基因成功导人到一名4 岁小女孩的t 淋巴细 胞中治疗了腺瞟呤脱氨酶基因缺失病，开创了人类利用人体基因治疗疾病的先 例。与此同时，我国于1 9 9 2 年由复旦大学薛京伦为首的课题组首次把人凝血因子 基因成功用于治疗血友病。十多年来全世界已完成5 0 0 多例基因治疗的临床试 验。基因治疗的理论和临床研究已迅速展开，给一些传统疗法难以治愈的疾病带 来了新的希望。 基因治疗是通过改变病人的遗传物质来抵抗或预防疾病，其目的就是给带 有缺损基因的细胞提供健康基因，研究者通过将外源基因导入目的细胞并有效表 达，从而达到治病目的【l 引。裸露的外源基因d n a 难以进入细胞且容易被机体或细 胞降解，因而难以表达，所以需要有载体携带基因进入细胞并使其不易被降解， 使基因高效表达。 基因载体是作为基因导入细胞的工具，它可以把目的基因送入靶细胞内，从 而发挥目的基因的特定功能。目前基因转染常用的载体有病毒型载体和非病毒型 载体。病毒型载体在当前批准进入临床试验的基因治疗中占7 5 ，转染效率通 常在9 0 以上，但病毒蛋白有诱发机体产生免疫反应、体内潜在的病毒复制、 生产成本高、不能反复应用、无靶向性等口。5 1 ，临床应用还很困难。为了克服这 些缺点，非病毒载体正成为当今基因释放研究的热点，非病毒性载体的优点是不 具感染性，但需要其它辅助性材料，例如：微脂粒、高分子聚合物、或特殊蛋白 质等，增强治疗基因传递的效果。 m e r d a n 等1 近来的研究表明，阳离子聚合物纳米基因载体是最有前途的非病 毒基因导入载体系统之一。在所构建的非病毒载体中，d n a 与聚阳离子形成的聚 电解质复合物体系( p e c ) 被研究得最为广泛。研究表明，如何提高载体对基因的 转运能力是提高基因转染率的关键问题之一。大多数聚合物非病毒载体运送d n a 分子通过细胞膜的能力尚较差，因而导致非病毒载体的转染效率降低。近来研究 者们提出运用纳米生物技术来解决这一问题。 壳聚糖是通过甲壳素脱乙酰化制备的天然高分子直链多糖，化学名称为 ( 1 - 4 ) - 2 - 氨基一2 一脱氧一b - d - 葡聚糖，作为一种阳离子聚电解质，由于其良好的 生物相容性、原料易得及价格便宜而倍受从事生物微胶囊研究的科学工作者的关 注。由于壳聚糖具有良好的组织相容性和低细胞毒性等优越性以及独特的跨细胞 膜能力n 刮，这就使以它为载体的基因药物的转染效率大大提高，因此它能够作 为一种高效载体用于基因治疗领域。 硕士学位论文 研究背景 聚乙二醇( p e g ) 是l - - 醇的高聚物，是一种安全的、无活性、无毒的聚合物。 随着平均分子量的不同，性质也有差异n 叫。因其具有良好的亲水性、低细胞毒性 和促进细胞融合的特性而常被用作亲水末端的修饰。经p e g 修饰过的蛋白质可以 延长在胞浆中的半衰期，增强其稳定性和降低在体内的免疫原性n 。实验己证实 经p e g 修饰过的肿瘤坏死因子的抗肿瘤活性有所增强n 剀，c h o i m l 等也曾报道聚左 旋赖氨酸( p l l ) 经p e g 修饰后亲水性增强，使其成为更有效的基因载体。 本实验中，我们首先运用聚合物分散法制备出壳聚糖空载纳米粒，通过静电 吸附将报告基因( p e g f p - c 1 ) 质粒d n a 吸附在其表面，形成d n a 一壳聚糖纳米粒； 其次用不同浓度的m s s - p e g 对纳米颗粒进行表面修饰；再利用扫描电镜和原子力 显微镜观察修饰前后纳米颗粒形态的变化，用激光粒度分析仪测定其粒度分布、 表面电位( z e t a 电位) ，m t t 试验研究壳聚糖纳米基因载体对h e p g 2 和c o s 7 的细 胞毒作用，d n a s el 保护实验研究d n a 一壳聚糖纳米颗粒对所携带基因的保护作 用，用体外基因转染实验定性评价纳米粒的转染活性，用倒置荧光显微镜观察和 流式细胞仪测定转染结果。通过考察递送不同剂量的基因，寻找本递送系统较好 的转染条件。最后，对以上实验结果进行分析，评价表面修饰对壳聚糖基因递送 系统理化性质和转染活性的影响。 2 硕士学位论文第一章d n a 一壳聚糖纳米粒的制备 第一章d n a 一壳聚糖纳米粒的制备 近年来，科学家在研究基因上的研究进展，已能使临床工作者能够通过改 变病人的遗传物质来抵抗或预防疾病，这就是通常所讲的基因治疗，基因治疗 的主要过程是目的基因的获取和高效的基因转染。基因治疗的一个目的就是给 带有缺损基因的细胞提供健康基因，其成败的关键是基因治疗的载体系统，理 想的基因载体应具备：( 1 ) 靶向特异性，并且可被免疫系统识别；( 2 ) 高度稳定， 容易制备，可浓缩和纯化；( 3 ) 无毒性，对病人及环境安全无害：( 4 ) 有利于基 因高效转移和长期表达。 目前，在基因载体的设计上，大致可分为两大类：病毒类载体和非病毒类 载体。研究表明，如何提高载体对基因的转运能力是提高基因转染率的关键问题 之一n 螂1 ，由于安全性问题及大量获得重组病毒载体相对困难等原因，科学家 正在寻找更安全，高效又易识别的非病毒类载体。本实验中，我们旨在制备一 种壳聚糖空载纳米粒，并将报告基因( p e g f p - c 1 ) 质粒d n a 吸附在其表面，形成 d n a 一壳聚糖纳米粒，并对其进行表面修饰，以延长药物在胞浆中的半衰期，增 强其稳定性和降低在体内的免疫原性。 1 1 材料与方法 1 1 1 试剂与仪器 壳聚糖( c h i t o s a n ，上海伯奥生物科技有限公司，批号：0 5 0 1 0 6 ，脱乙酰 度 9 0 0 ，粘度 l o o c p s ) ；聚乙烯醇( p v a ，中国医药上海化学试剂公司， s c r c 3 0 1 5 3 0 8 0 ) ，m s s p e g ，m w5 0 0 0 ( s h e a r w a t e rp o l y m e r s ，h u n t s v i l l e ，a l ) ， 含绿色荧光蛋白表达质粒的大肠杆菌x l l - - b l u e ，b 型质粒大量提取试剂盒( 北 京博大泰克生物基因技术有限责任公司提供) ，聚乙烯亚胺( p e i ，s i g m a 公司 提供) ，l i p o f e c t a m i n e2 0 0 0 转染试剂盒( i n v i t r o g e nt m ) 。 低温高速离心机( 1 6 r ，德国) ，凝胶成像系统( g e n o s e n s l s 0 0 ，上海勤翔科 学仪器有限公司) ，电泳仪( d y y 一，北京) ，电热恒温水浴箱( s h z 8 8 1 ，江苏 太仓实验设备厂) ，台式恒温振荡器( t h z 一8 z a ，上海跃进医疗器械厂) ，超净工 作台( s w c j i f d ，苏州安泰空气技术有限公司) ，激光粒度分析仪( 英国马尔 3 硕士学位论文第一章d n a 一壳聚糖纳米粒的制备 文公司) ，d j l 电动搅拌机( 江苏环保仪器厂) 。 1 i 2 方法n 7 伽 1 1 2 1 壳聚糖纳米粒的制备 用聚合物分散法制备壳聚糖纳米粒。配制1 4 4m g m 的壳聚糖醋酸溶液， 其中醋酸与壳聚糖的质量比为1 5 ：1 。首先配制2 1 6m g m l 的醋酸溶液，再 称取1 4 4m g 的壳聚糖粉末溶于1 0m 1 上述醋酸溶液中，即得i 4 4m g m l 的壳 聚糖醋酸溶液；然后将11m ld c m 溶液缓慢加入到1 0m l 壳聚糖醋酸溶液中， 用匀浆机在1 3 5 0 0r p m 的条件下处理3 0 秒；再向其中边磁力搅拌边缓慢滴入 1 0m 1 ，1 0m g m l 的p v a 水溶液；滴入后在常温下持续磁力搅拌i 小时；最后 再用匀浆机在1 3 5 0 0r p m 处理1 分钟。 1 1 2 2p e g f p c 1 质粒d n a 的提取 用细菌接种环取少量已转化p e g f p c l 质粒成功的大肠杆菌x l i - - b l u e 菌 液，将其接种于固体l b 培养基上，在3 7 c 恒温细菌培养箱中培养1 2h 后取出， 挑选单菌落，接种于1 0m ll b 培养液中，放置于摇床上，3 7 ，1 3 5r p m 振荡 培养过夜。从中取出2m 1 菌液，接种于5 0 0m ll b 培养液中，放置于摇床上， 3 7 ，1 3 5r p m 振荡培养过夜后备用。 按照“a 型质粒大量提取试剂盒 的操作步骤提取上述5 0 0m l 菌液中的质 粒d n a 。取质粒d n a 悬液2pl ，用双蒸水稀释7 5 倍，混匀后加入石英比色杯中， 分光光度计校正零点，分别在2 6 0 n m 和2 8 0 n m 测量吸光度，并根据结果判断质 粒的浓度与纯度。 1 1 2 3d n a 一壳聚糖纳米粒的制备 通过静电吸附作用制备d n a 一壳聚糖纳米粒。配制5 m g m l 的p e i p b s 储存 液，并用i m o l l 的h c l 溶液将其p h 调至7 0 ，经0 2 2pm 滤膜过滤后保存至4 度冰箱备用。配制0 i m g m l 的m s s - p e g 水溶液，经0 2 2 | im 滤膜灭菌过滤后使 用。吸取3 0u1 质粒d n a ( 含1 6 9 9d n a ) 加入到3u1 的上述p e i p b s 溶液中， 使其n p = i o 。再加入1 0ul 已过滤除菌的上述所得的壳聚糖纳米粒悬液，漩涡 振荡后室温静置1 0 m i n ，即形成d n a 一壳聚糖纳米粒悬液。另吸取1 0 0u1 质粒 d n a ( 含5 0 垤d n a ) 加入到1 0p1 的上述p e i p b s 溶液中，使其n p - i o 。再 加入3 5i ll 已过滤除菌的上述所得的壳聚糖纳米粒悬液，漩涡振荡后室温静置 1 0 m i n ，将所得d n a 壳聚糖纳米粒平均分成5 份，分别加入5ul ，1 0ul ，1 5l l 1 ，2 0i l1 ，2 5ulm s s - p e g 水溶液，再漩涡振荡1m i n 后，室温静置1 0m i n ，即 4 硕士学位论文第一章d n a 一壳聚糖纳米粒的制备 可形成经m s s p e g 表面修饰的d n a 一壳聚糖纳米粒，其中壳聚糖与m s s p e g 的 质量比分别为4 ：l ，2 ：1 ，1 ：1 ，1 ：2 ，1 ：4 。 1 1 2 4d n a 一壳聚糖纳米粒的表征分析 用扫描电镜和原子力显微镜观察d n a 一壳聚糖纳米粒的形态特征，激光粒度 分析仪测定d n a 一壳聚糖纳米粒的粒度分布以及壳聚糖空载纳米粒和d n a 一壳聚 糖纳米粒的表面电位( z e t a 电位) 。 1 1 3 统计学处理 采用s p s s i o 0 统计学软件进行统计分析，数据用均数标准差表示，各组 间差异用t 检验或方差分析，检验标准以p o 0 5 为差异有显著性。 1 2 结果 1 2 1d n a 一壳聚糖纳米粒的形态特征 经扫描电子显微镜和原子力显微镜测得d n a 一壳聚糖纳米粒的形态特征如图 1 、2 。图1 为扫描电镜下的d n a 一壳聚糖纳米粒，其中，( a ) 为未经m s s - p e g 修饰 的d n a 一壳聚糖纳米；( b ) 为经m s s p e g 修饰后的d n a 一壳聚糖纳米粒( 壳聚糖与 m s s p e g 的质量比为：1 ：1 ) ；粒径分别约为9 8 1 6n m ，9 9 6 5n m 。图2 为原子力 显微镜下的经m s s - p e 6 修饰后的d n a 一壳聚糖纳米粒( 壳聚糖与m s s p e g 的质量比 为l ：1 ) ，粒径为9 6 1 4 6n m 。 镰澳 图1 豢魏，黪黪裂斋 簿 一豢 鬻辔糕缯 譬一 硕十学位论文第一+ 章d n a 一壳聚糖纳米粒的制备 图2 1 2 2d n a 一壳聚糖纳米粒的形态特征和粒径分布 通过激光粒度分析仪检测d n a 一壳聚糖纳米粒的粒径分布状态( 如图3 ) 及纳 米粒的分散状态，图3 所示激光粒度分析仪测得d n a 一壳聚糖纳米粒的粒径分布范 围，其中，( a ) 为未经m s s - p e g 修饰的d n a 一壳聚糖纳米粒；( b ) 为经m s s - p e g 修饰后的d n a 一壳聚糖纳米粒( 壳聚糖与m s s - p e g 的质量比为1 ：1 ) 。由图可知未 经m s s p e g 修饰的d n a 一壳聚糖纳米粒的聚合指数为0 5 5 3 ，而经m s s p e g 修饰后的 d n a 一壳聚糖纳米粒( 壳聚糖与m s s p e g 的质量比为：l ：1 ) 的聚合指数为0 1 4 9 ， 说明后者的分散状况较前者有明显改善。随着m s s p e g 量的增大，纳米粒的聚合 指数也逐渐降低，差异有显著性( p o 0 1 ) 。具体变化见表1 ，图4 。测得壳聚糖 空载纳米粒的z e t a 电位为+ 1 2 8m v ，d n a 一壳聚糖纳米粒的z e t a 电位为+ 3 6 m y ， 经m s s p e g 修饰后，随壳聚糖与m s s p e g 的质量比的变化，d n a 一壳聚糖纳米粒的 z e t a 电位的变化趋势如表2 ，图5 ，差异亦具有显著性( p o 0 1 ) 。 硕士学位论文第一章d n a 一壳聚糖纳米粒的制备 日f 驴ce 口“沾_ i jp 。r m - o “i h j 口td t l t 旺d q ：- 写i 】c ： 乎 扎1 t t j 0 , o , t e 【f n 奇j j 日t l 五1 9 c c 叮把二6 地；n ”p 叶n 如c “口i “ j ：td 笙吨吐o f ：i l f 上i 三i ； ： ： i ；i ； ；：；：i 一三l 卫，j ： umi w5 u 口i w 口 d f 舯1 刚ri r n ，； q2 5 o 2 a 工5 o 1 0 5 0 图3 n r l h ? ju jujl _ 9 o 0】0 l ： 0 ，0】0 s ：jn j n1 0 i ：i i t 1 f l1r l ，。jn juj0 e u) uj0 = ：) !：0 】c !j ，? lx8 n i vqj ? q 4 f ? 玮 u ：一j 、- 、 坼f1n 30】0 ? 1 1n 1n1n 5 4jj0j 1 1 、二f j0ju儿 * ：2二o) 0) c 【 - 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d - 葡萄糖，英 文名为c h i t o s a n ，它无毒，无味，无刺激性，有很好的生物相容性，且其分解产 物对人体健康无害，是一种新型天然医用生物材料。这种阳离子型多糖不溶于普 通的有机溶剂，在碱性中稳定，可溶于弱酸，具有良好的生物相容性和生物黏附 性，以及抗菌消炎，免疫调节，抗肿瘤等药理作用一3 。由于它的这些优点，使 其成为目前基因载体领域的研究热点汹1 。 本实验用聚合物分散法制备壳聚糖纳米粒后，壳聚糖分子链上的游离氨基在 酸性条件下质子化而带正电( 如图6 ) ，可与带负电的质粒d n a 间发生电性结合形 成纳米粒( 如图7 ) ，利用此原理我们将d n a 分子吸附在壳聚糖纳米粒表面，形成 稳定的d n a 一壳聚糖纳米颗粒；此后又加入不同浓度的m s s - - p e g 对载基因纳米粒 进行表面修饰，并通过扫描电镜、原子力显微镜、激光粒度分析仪的测定结果比 较修饰前后载基因纳米粒各种物理性质的变化侧。 从扫描电镜和原子力显微镜的结果( 图1 、2 ) 可知经m s s - - p e g 修饰前，d n a 一壳聚糖纳米粒有较多聚合，图片中可看到成片存在的纳米粒聚合团；而修饰后 的纳米粒聚合现象明显减少，成球形的纳米粒分散在视野中。经激光粒度分析仪 测定后可得以下结论：修饰前后纳米粒的粒径分布范围变化不显著，均小于 l o o n m ，能够穿过细胞膜进入细胞内部( 1 0 0 1 5 0n m ) 口；聚合指数变化较大， 9 硕士学位论文 第一章d n a 一壳聚糖纳米粒的制备 修饰后纳米粒的聚合度较修饰前明显降低，并且随着m s s p e g 反应量的增加，聚 合指数也逐渐减小，具体变化趋势见表1 ，图4 ：z e t a 电位的结果显示壳聚糖空载 纳米粒表面存在大量的正电荷，与d n a 结合后，正电荷数目减少，电位值也降低， 经m s s p e g 修饰后，由于纳米粒的分散度增大，d n a 与纳米粒的接触面积增大， 使较修饰前多的d n a 分子与纳米粒表面暴露出的正电荷结合，由于随m s s - - p e g 反 应量的增加，纳米粒在悬液中越分散，就会有越多的d n a 分子吸附在其表面，故 测得的电位值也相应地减小，但当m s s p e g 的量大于壳聚糖的量时，反而出现较 多未与壳聚糖纳米粒结合游离的d n a 分子，此时z e t a 电位呈现负值，( 如表2 ，图 5 )。 图6 壳聚糖纳米粒表面的游离氨基质子图7 通过正负电荷吸引形成的d n a 一壳聚糖纳米粒 1 4 结论 本实验用聚合物分散法制备壳聚糖纳米粒，并将d n a 分子吸附在壳聚糖纳 米粒表面，形成了稳定的d n a - - 壳聚糖纳米颗粒，在用m s s - - p e g 对载基因纳米 粒表面进行修饰后，有效地改善了纳米粒的聚合现象，使其稳定地分散在悬液 中。相关研究结果提示，为适应不同治疗、不同靶细胞、不同目的基因的需要， 应进行表面修饰配基的筛选，如针对聚乙二醇( p e g ) 、聚乙烯醇( p v a ) 等及其 衍生物的筛选，这将成为对基因递送纳米粒进行深入研究的重要切入点之一。 l o 硕士学位论文第二章壳聚糖载基因纳米颗粒相关特性的研究 第二章壳聚糖载基因纳米颗粒相关特性的研究 在本章中，我们使用m t t 试验研究壳聚糖纳米基因载体对h e p g 2 和c o s 7 的细胞毒作用，d n a s ei 保护实验研究d n a 一壳聚糖纳米颗粒对所携带基因的 保护作用，用体外基因转染实验定性评价纳米粒的转染活性，用倒置荧光显微镜 观察和流式细胞仪测定转染结果。通过考察递送不同剂量的基因，寻找本递送系 统较好的转染条件。 2 1 材料与方法 2 1 1 材料 h e p g 2 细胞( 人肝癌细胞) ，c o s 一7 细胞( 猴肾细胞，由本试验室提供) ， 1 6 4 0 完全培养基( g i b c o ，u s a ) ，1 6 4 0 无血清培养基( 由本实验室配制) ，d m s o ( 二甲基亚砜，常州汇和化工有限公司) ，d n a s ei ，d n a s ei 的反应终止剂( 均 由p r o m a g e 公司提供) ，壳聚糖酶( c h i t o s a n a s e ，s i g m a 公司提供) ，p b s 缓冲 液( 本实验室配制) ，二氯甲烷( 分析纯) ，琼脂糖粉末，溴乙锭溶液，双蒸水。 细菌培养箱( m j x - 1 5 0 ，湘仪离心机仪器有限公司) ，细胞培养箱( 长沙华曦电 子科技有限公司) ，扫描电子显微镜( 日本h i t a c h i 公司) ，倒置荧光显微镜( 上 海长方光学仪器厂) ，x w 一8 0 a 型漩涡混和器( 上海医科大学仪器厂) 。 2 1 2 方法 2 1 2 1 壳聚糖纳米粒细胞毒性实验 h e p g 2 和l 一0 2 两种细胞分别接种到9 6 孔板上2 4 h ，贴壁后分别加入壳聚糖 空载纳米粒悬液( 其中壳聚糖浓度为0 7 2 m g m 1 ) 1 0 ，2 0 ，4 0 ，6 0 ，8 0 ，1 0 0ul ， 每个浓度均设一个复孔。加药后与培养基的总体积为2 0 0ul ，4 8h 后加入m t t 溶 液2 0 ul ，孵育4h ，弃去上清液，加入d m s o1 5 0 ul ，震荡1 0m i n ，用e l x8 0 0 酶 标仪在4 9 0 n m 波长下测定吸光度。 2 1 2 2d n a - - 壳聚糖纳米粒的d n a 携带率的测定 纳米粒载体对基因的包载能力可用其d n a 的携带效率( a e ) 来衡量。分别取 2 0ul d n a 一壳聚糖纳米粒悬液以及不同壳聚糖与m s s - p e g 的质量比的经m s s - p e g 修饰后的壳聚糖载基因纳米粒悬液，计算其中d n a 的含量( a ) ；将这些纳米粒悬 硕士学位论文 第二章壳聚糖载基因纳米颗粒相关特性的研究 液在2 0 0 0 0 r p m 的条件下离- l , l d 、时后，取2ul 上清液，用双蒸水稀释7 5 倍后，再 用分光光度计测定其中游离的d n a 含量( b ) ；根据以下公式口柚3 即可计算d n a - - 壳 聚糖纳米粒的d n a 携带效率：a e = ( a b ) a * 1 0 0 。 2 1 2 3d n a 一壳聚糖纳米粒对d n a 的保护作用 取5ul 质粒d n a ( 相当于3 腿d n a ) 与3pl 的d n a s e 在3 7 c 的水浴条件下反应 2 m i n 。加入2ul 的s t o ps o l u t i o n 在6 5 c 的水浴条件下终止消化反应。取7 5 ul d n 卜壳聚糖纳米粒悬液和1 1 5l ai 经m s s - p e g 修饰后的d n a 一壳聚糖纳米粒悬 液，使其中的d n a 含量均为3 腿，再分别与3 | jl 的d n a s e 在3 7 。c 的水浴条件下反应 1 5 m i n 。再分别加入2i il 的s t o ps o l u t i o n 在6 5 的水浴条件下终止消化反应。此 后在两种纳米粒的消化物中加入壳聚糖酶( c h i t o s a n a s e ) 5u1 ，在3 7 。c 水浴条 件下继续消化4h 后进行后续实验。 分别吸取5ul 未经消化的d n a 一壳聚糖纳米粒悬液、经m s s - p e g 修饰的d n a 一 壳聚糖纳米粒悬液及各消化产物，在已经预铺好的0 8 琼脂糖凝胶上点样，采 用入h i n dm a k e r ，7 5 v 电压，电泳6 0 m i n 后，用凝胶成像系统观察电泳图谱。 2 1 2 4d n a 一壳聚糖纳米粒的体外转染实验 将c o s 7 细胞以2 1 0 5 个孔的细胞密度铺于2 4 孔细胞培养板中，加入5 0 0 i i1 1 6 4 0 完全培养基后，放入3 7 恒温细胞培养箱中培养2 4 h 后，发现细胞贴壁程 度约达至! l j 9 0 以上，即可进行体外细胞转染实验。脂质体- - d n a 复合物的制备：取 1 5u1 质粒d n a ( 约0 8 腿) 加入5 0i ll 无血清无抗体1 6 4 0 培养基中， l i p o f e c t a m i n e2pl ( 约2 腿) 亦加入5 0u1 无血清1 6 4 0 培养基中，轻轻振摇两管 3 0 秒，室温下静置5 m i n ，将二者混合再轻轻振摇3 0 秒，室温下静置2 0 m i n 。将培 养板每孔中的完全培养基吸出，加入无血清无抗体的1 6 4 0 培养基2 0 0ui 孔，在 阴性对照组中不加入任何物质；在裸质粒d n a 组中加入1 5 | ll ( 约o 8 腿) 的质 粒d n a ；阳性对照组中加入上述制备的脂质体- - d n a 复合物；实验组分为未经 m s s - p e g 修饰的d n a 一壳聚糖纳米粒组和经m s s - p e g 修饰的d n a 一壳聚糖纳米粒组， 每组又设3 个浓度梯度，未经m s s - p e g 修饰的d n a 一壳聚糖纳米粒组分别加入2i i 1 2 硕士学位论文 第二章壳聚糖载基因纳米颗粒相关特性的研究 1 ，4ul ，6ul 纳米粒悬液，经m s s p e g 修饰的d n a - - 壳聚糖纳米粒组选用壳聚糖与 h i s s - - p e g 质量比为1 ：1 的纳米粒悬液，分别取3 2ul ，6 4u1 ，9 6i j1 加入到相应 的细胞培养孔内，每个浓度设一个复孔，加样完毕后将培养板放入细胞培养箱培 养6 个小时后，弃去原液，换成5 0 0ul 孔的完全培养基，继续培养4 0 个小时后直 接用倒置荧光显微镜定性观察转染结果。再用胰蛋白酶将转染后的各组细胞消化 成细胞悬液，在流式细胞仪下定量分析转染效率。 2 1 3 统计学处理 采用s p s s i o 0 统计学软件进行统计分析，数据用均数标准差表示，各组 间差异用t 检验或方差分析，检验标准以p o 0 5 为差异有显著性。 2 2 结果 2 2 1 壳聚糖纳米粒的细胞毒性 壳聚糖纳米粒对h e p g 2 和l 0 2 细胞的细胞毒性影响见表3 ，图8 。可见，随着 壳聚糖使用量的增加，细胞的吸光度明显增加，对细胞的毒性愈小，结果差异具 有显著性( p o 0 1 ) 。 表3 壳聚糖空载纳米颗粒对l 一0 2 细胞$ 1 h e p g 2 细胞的影响 1 2 0 鬈 参1 0 0 x 一 名8 0 x 君6 0 誓 = 4 0 鼻 ! ；2 0 冀 0 一 一， 1 j r 、i lrr tr l j ， 、卜， 夺帝夺萨巾 。毋。冷夺。 c o a te r t to fc h i to s 孤( u g ) + h e p g 2 c e l l s l 0 2c e l h 硕士学位论文第二章壳聚糖载基因纳米颗粒相关特性的研究 图8 壳聚糖空载纳米颗粒对l - - 0 2 细胞署 1 l t e p g 2 细胞生存能力的影响 2 2 2 提取质粒d n a 的浓度以及d n a 一壳聚糖纳米粒的d n a 携带率 经紫外分光光度测得提取质粒d n a 的浓度为5 5 4 6 n g l al ，根据质粒d n a 的浓 度。计算得到2 0u1d n a 一壳聚糖纳米粒中含d n a 量a - - 8 “g ，离心后，取2u1 上清液， 用双蒸水稀释7 5 倍，用分光光度计测得游离d n a 的量b = 1 2 6 ，套用公式a e = ( a - - b ) a 丰1 0 0 = 8 4 2 5 。同理，计算各种经不同量m s s p e g 修饰的d n a - 壳聚糖 纳米粒的d n a 携带率，结果如表4 、图7 。 台 墨 一 ： 罄 _ u 曼 勺 g _ 盏 口 表4m s s - - p e g 修饰纳米粒的d n a 装载率 拿8 亭6 乳 9 2 b 矗 b l b 2 5 0 7 3 7 五 h 、寸枣 c s ：m s s - p e g ( 、w ) c s 。d n a 。p e ；n p s c s d n an p l 图7 m s s - - p e g 修饰纳米粒的d n a 装载率的变化趋势 2 2 。3d n a 一壳聚糖纳米粒对d n a 的保护作用 消化产物的电泳结果如图9 1 4 硕士学位论文第二章壳聚糖载基冈纳米颗粒相关特性的研究 图9 通过d n a s e 消化实验的电泳结果 带1 为未经消化处理的d n a 一壳聚糖纳米粒：带2 为裸质粒：带3 为 c h i t o s a n d n a 纳米粒：带4 为c h i t o s a n d n a p e g 纳米粒( c h i t o s a n 和m s s - p e g 质量 比为1 ：1 ) ：带5 为粒纳米粒经d n a s ei 消化：带6 为c h it o s a n - d n a 纳米粒经d n a s e 消 化：带7 为c h i t o s a n d n a p e 纳米粒经d n a s e 消化：带8 为c h i t o s a n - d n a - p e g 纳