（细胞生物学专业论文）盐芥耐盐相关基因的克隆及功能分析.pdf

山东大学博士学位论文 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论 文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本 文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。 本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名： 萄鳝 e t 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意 学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允 许论文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部 或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他 复制手段保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：裤导师签名：雒日期：卫哟 山东大学博士学位论文 盐芥耐盐相关基因的克隆和功能分析 中文摘要 盐胁迫是自然界中主要的非生物胁迫之一，土壤中高浓度的n a + 对许多高 等植物的生长和发育造成很大的伤害。盐胁迫对植物的伤害主要由两方面的因 素引起：一是离子胁迫，大量的n a * 进入到植物体内，不但打破了体内原有的 离子平衡，而且影响了细胞的代谢和细胞的k + z n a + 比率，造成m d a 积累及膜 脂和膜蛋白损伤；二是渗透胁迫，盐分使土壤中的水势降低，从而引起植物体 的水分缺乏目前，植物中用来消除n a 毒害的策略主要包括：减少外界n r 的吸收，n a + 的外摔和n a * 的区隔化。目前虽然已知脚能是通过根的一些k + 通道进入到植物细胞，但是具体的分子机制仍待于进一步研究。根系细胞n r 外排主要是通过定位于细胞质膜的n a * i - ga n t i p o r t e r 转运蛋白来完成的n a + 区 隔化是植物细胞利用旷浓度梯度通过定位于液泡膜的n 埘a n t i p o r t e r 转运蛋 白将细胞质中的n a + 转运到液泡中，一方面降低了细胞质中n a + 的浓度，减少过 量n a + 对植物细胞的损害，另一方面可以维持植物细胞的膨压，增加植物细胞 吸水和保水的能力 随着植物分子生物学的发展，人们通过对拟南芥的研究，在植物耐盐和耐 旱方面取得重大的研究成果，特别是对植物在胁迫条件下的信号转导、转录水 平的调控、胁迫条件下离子的渗透平衡、细胞的抗氧化作用、渗透保护物质的 合成等诸多方面都有了较为深入的了解。但是拟南芥是一种典型的非盐生植物， 作为耐盐和耐旱机制研究的模式植物有一定的局限性盐芥( t h e l l u n g i e u a s a l s u g i n e ao rt h e l l u n g i e l l ah a l o p h i l a ) 是拟南芥的近缘物种，是一种高度耐盐耐旱 的盐生植物该种植物在盐胁迫的前后既不产生盐腺也没有形态上的明显变化， 表明其耐盐性在很大程度上取决于该物种的基本生理及其生化机制。而且盐芥 具有e d n a 序列与拟南芥相似程度高、基因组小等优点，近几年来逐渐成为人 们研究植物非生物胁迫的模式植物。本研究以盐芥作为实验材料，分别构建了 盐芥的小片段基因组文库以及盐胁迫处理的e d n a 文库。分别克隆了盐芥盐胁 迫诱导基因西p 于和n a * p i 转运体基因及其启动子序列，并对这两个基因的功能 及表达模式进行了研究 山东大学博士学位论文 盐芥 r s v p 基因的克隆和功能分析 利用拟南芥中氢离子焦磷酸酶基因的序列信息，从盐生植物盐芥e d n a 文库 中克隆了氢离子焦磷酸酶( h * - t r a m l o c a t i n gi n o r g a n i cp y r o p h o s p h a t a s e ，i - i * - p p a s e ) 候选基因西瞪。该c d n a 序列全长2 7 5 9 b p ( a c c e s s i o n1 1 0 a y 4 3 6 5 5 3 ) ，包含1 0 0 b p 的5 非翻译区( 5 u t r ) 和3 4 4 b p 的3 非翻译区( 3 u t r ) 以及一个2 3 1 6 b p 的开放 读码框( o p e nr e a d i n gf r d m eo r f ) 该读码框编码了7 7 1 个氨基酸，含有1 4 个跨 膜结构域和w - e p a s e 基因所特有的5 个保守结构域 将盐芥盈阡基因在酵母盐敏感突变体( e n a l ) 中迸行异源表达，可以提高 酵母盐敏感突变体的耐盐性，这表明该基因是一个有功能的i - i + p p a s e 。在烟草 中过表达殆冲基因可以提高烟草植株的耐盐性和耐旱性。正常条件下，五阡基 因转录水平及h + - p p a s e 活性较高的两个转基因烟草株系维持了较低的溶质渗透 势；在盐胁迫条件下，转基因烟草的时盘和原生质体都表现出了较高的盐耐性， 虽然这些转基因烟草植株的叶片中积累了较多的n a * ，但是这些转基因植株有较 高的生物量，其m d a 含量和细胞膜损伤程度都显著低于野生型对照植株。这说 明在烟草中过表达h + - p p a s e 基因，可以增强植物细胞n 矿区隔化能力，从而减少 过量n a + 对植物细胞的伤害；在干旱条件下，过表达t s v p 基因降低了转基因烟草 的溶质渗透势，从而使转基因植株保持了较高的相对水含量，提高了转基因烟 草在干旱条件下的生存能力。 盐芥和拟南芥i - i + p p a s e 在氨基酸序列上有9 6 的相似性，为了比较盐芥和 拟南芥来源的i - i + - p p a s e 基因的功能，分别将这两个基因在酵母盐敏感突变体和 烟草中进行异源表达，进而分析这两个基因对转基因酵母和转基因烟草耐盐性 的影响，结果表明，乃纡和a v p l 都可以提高转基因酵母和转基因烟草的耐盐性， 而且二者提高酵母或烟草盐耐性的程度也没有明显差异。这表明来自盐芥和拟 南芥的n p p a g e 基因在生化功能上没有明显的差异然而，在盐胁迫条件下， 盐芥和拟南芥h p p a 基因的表达模式存在显著不同，盐芥两阡基因表达受到 盐胁迫诱导，而拟南芥4 v p l 基因在盐胁迫条件下基因的表达水平没有显著的变 化为了进一步研究拟南芥和盐芥h p p a s e 基因在盐胁迫条件下的表达调控机 理，我们通过筛选盐芥基因组文库的方法克隆了盐芥五即基因的启动子序列， 2 山东大学博士学位论文 以盐芥和拟南芥基因组中h * - p p a s e 基因与其上游连锁基因的基因间隔区作为 珏阡基因和彳p 于j 基因的启动子区域，通过n s i t e - p l 程序对这两个启动子序列进 行生物信息学分析，发现盐芥和拟南芥i - f - p p a s e 基因的启动子序列在顺式作用 元件的种类和数量上都存在极大的差别盐芥t s v p 基因启动子序列含有1 8 个不 同的顺式作用元件，拟南芥爿v p l 启动子序列含有2 7 个( 可以和2 5 个不同调控因 子相互作用) 顺式作用元件在这些预测的顺式作用元件中，其中只有6 个顺式 作用元件( i 瑙p 0 0 0 7 9 、r s p 0 0 3 7 7 、r s p 0 0 4 2 0 、r s p 0 0 6 3 5 、r s p 0 0 6 4 4 、r s p 0 0 6 5 3 ) 为两个启动子序列所共有。而且在盐芥西即基因启动子序列中发现了多个在拟 南芥4 v p l 基因启动子序列中不存在的胁迫相关的顺式作用元件，如g b o x 顺式 作用元件：r s p 0 0 0 4 9 ，提示该基因的表达可能受到盐或干旱胁迫的诱导。这部 分解释了造成t s v p 基因和4 阡j 基因表达模式差异的原因。 盐贫：n a + p i 转运体基因克隆和功能研究 使用r a c e 等方法，克隆了盐芥n a + p i 转运体基因。该基因e d n a 序列全长 l s 9 s b p ( a c c e s s i o nn o e f 0 5 3 0 5 7 ) ，包含7 8 b p 的5 非翻译区( 5 u t r ) 和2 s t b p 的3 非翻译区( y u t r ) 以及一个1 5 3 3 b p 的开放读码框( o p e nr e a d i n gf l a m eo r f ) 该读码框编码了5 1 0 个氨基酸，含有1 0 个跨膜结构域。将该基因与拟南芥磷转运 体基因进行聚类分析，该蛋白与拟南芥磷转运体基因家族p h t l 有较近的亲缘关 系通过生物信息学分析和g f p 融合蛋白亚细胞定位分析，将该蛋白定位于植 物细胞的叶绿体上。该基因主要在盐芥的叶中进行表达，而且受到盐胁迫和a b a 的调控为了进一步研究该基因在盐芥中的表达模式，通过筛选盐芥基因组文 库的方法克隆了盐芥n a + p i 转运体基因上游2 9 0 0 b p 的启动子区域，通过 n s l t e - p l 程序对该启动子区域进行生物信息学分析，发现该启动予序列可能含 有2 8 个顺式作用元件，其中包括多个胁迫相关的顺式作用元件( r s p o 0 0 5 5 ：a b r e a 、r s p 0 0 0 5 6 ：a b r eb d 、r s p 0 0 0 6 5 ：e m l a 、r s p o 0 0 6 6 ：e m l b 、r s p 0 0 0 6 7 ：a b r e ) 。 将删除n 端6 6 个氨基酸残基的盐芥n a + p i 转运体基因的编码序列( c d n a 序 列) 在酵母突变体p a m 2 中进行异源表达，可以抑制该酵母突变体在低磷培养条 件下的酸性磷酸酶活性，而且大大促进该酵母突变体在低磷培养基上的生长速 率以完整的酵母细胞进行p i 转运实验，该基因的编码产物可以进行无机磷酸 山东大学博士学位论文 盐转运。而且低浓度的n a + ( 5 0 0 “m ) 就可以激活该转运体的转运活性；当n a * 浓度升高至2 5n l m 时，就可以充分激活该转运蛋白的转运活性( 9 0 ) 虽然 l i + 和k + 在一定程度也可以刺激该转运体表现出p i 转运活性，但n a ? 是该转运蛋白 的最佳一价阳离子激活剂在酸性条件下( p h 4 5 - p h 7 o ) ，该转运体蛋白最适 p h = 6 0 ，碱性条件下( p h 7 0 - p h 9 5 ) 该转运体蛋白最适p h = 7 5 ，而且p h 音7 5 时的转运速率几乎是p h = 6 0 时的1 5 倍。在这两个p h 条件下进行该转运体蛋白的 p i 转运动力学研究，结果表明该基因编码的转运体蛋白是一种高亲和p i 转运体， 其k m 分别为7 4t i m ( p h = 6 o ) 和k m = 8 7 “m ( p h = 7 5 ) 根据以上结果可以得出，拟南芥和盐芥直向同源基因a v p l 和t s v p 的c d n a 序列相似性很高，在分别转入酵母和烟草后，对转基因生物的耐盐性提高程度 相近，即t s v p 基因和a v p l 基因的生化功能相同，但在盐胁迫条件下，盐芥和拟 南芥h + - v p a s e 基因的表达模式存在显著不同，盐芥乃阡基因的表达在受到盐胁 迫后大幅度上升，而拟南芥4 v p i 基因在盐胁迫处理下表达水平无显著变化，这 提示乃即基因在盐芥耐盐机制中起重要作用比较分析阡j 和乃印基因的启动 子序列，发现它们所包含的顺式作用元件数目和种类差异较大，在盐芥办即基 因启动子序列中发现了多个在拟南芥4 v p l 基因启动子序列中不存在的胁迫相 关顺式作用元件，这不仅支持了乃阡基因在盐芥耐盐机制中起重要作用的假说， 而且提示我们盐芥和拟南芥耐盐性的差异可能不是由它们直向同源基因的功能 不同引起的，而更可能是基因表达调控网络差异造成的当然我们也不能捧除 在植物的长期进化过程中，胁迫相关特化基因在非生物胁迫中的作用。 虽然拟南芥基因组中也存在有n a + p i 转运体基因序列，但其功能一直未得 到验证在本工作中，我们克隆了盐芥的n a + p i 转运体基因，进行了功能验证 和转运蛋白p i 转运活性的研究，并将该转运蛋白定位于叶绿体上该基因主要 在盐芥的叶中进行表达，而且受到盐胁迫和a b a 的调控。在其启动子序列中也 发现了多个胁迫相关顺式作用元件因此，该基因在盐芥中可能有重要的生物 学功能，有可能在盐生植物中n a + p i 转运体对细胞质和叶绿体间n a + 和p i 平衡 起重要作用，是细胞耐盐机制的重要组成部分由于采用r n a i 技术检测n a + p i 转运体生物学功能的工作未完成，确切结论待定在高等植物中，盐芥n a + p i 转运体基因是克隆并进行了功能鉴定的第一个依赖于n a + 的p i 转运基因，这对 山东大学博士学位论文 转运体基因家族的进化研究提供了重要资料。 通过对盐芥h + - p p a s e 和n a + p i 转运体基因及其启动子序列的研究，加深了我 们对非盐生植物( 拟南芥) 和盐生植物( 盐芥) 耐盐机制的差异的认识，不仅 为我们采用基因工程技术提高作物耐盐性提供了具有自主知识产权的基因及启 动子，而且为拟订作物耐盐基因工程的实验方案提供了很有价值的资料，有望 为我国大面积的盐碱地开发利用做出贡献。 关键词：拟南芥启动子盐芥盐耐性h + - p p a s en a + p i 转运体 山东大学博士学位论文 t h ec l o n i n ga n df u n c t i o n a la n a l y s i so fs a i t t o l e r a n c er e l a t e d g e n e sf r o m 刀程配工【w g f e dz i 舭d p 酲陀。l a b s t r a e t s a l ts t r e s si so b eo ft h em a j o ra b i o t cs t r e s s e st ot h ep l a n t si nt h ew o r l d f i i 曲 c o n c e n l r a t i o no fs o d i u mi ns o i l si sd e l e t e r i o u st og r o w t ha n dd e v e l o p m e n to fh i g h e r p l a n t s t h ed e t r i m e n t a le f f e c t so fs a l to np l a n t sa r cac o n s e q u e n c eo fb o t hw a t e r d e f t e rt h a tr e s u l t sf r o mt h er e l a t i v e l yh i g hs o l u t ec o n c e n t r a t i o n si nt h es o i la n d e x c e s s i v en a + c o n c e n t r a t i o n si nt h ec y t o p l a s m e x c e s s i v en a + n o to n l ya l t e r si o n r a t i o sa n da f f e c t sc r i t i c a lb i o c h e m i c a lp r o c e s s e si nt h ec y t o p l a s m ，b u ta l s oi n c r e a s e s p l a s m am e m b r a n ei n j u r ya n dc a u s e sm a l o n d i a l d e h y d e ( m d a ) a c c u m u l a t i o n t h e s t r a t e g i e sf o rp l a n t se l i m i n a t i n gt h en a + t o x i c i t yi n c l u d e ：s u p p r e s s i n gn a + i n f l u x , i n c r e a s i n gn a + e f f l u xa n dc o m p a r t m e n t a l i z i n gn a + i nv a c u o l e s u pt od a t e ，i ti s k n o w nt h a tn a + c a nb et r a n s p o r t e di n t op l a n tc e l l sb yc r a n s p o r t e r s ，b u tt h ed e t a i l s i nm o l e c u l a rm e c h a n i s m sa b o u tn a + i n f l u xa r en o tc l e a re n o u 曲n a + h + a n t i p o r t e r s l o c a t e di np l a s m am e m b r a n ea n dv a c u o l a rm e m b r a n em e d i a t eu de f f l u xo r c o m p a r l m e n t a l i z a t i o n , w h i c ha r ed r i v e nb yt h ep r o t o ng r a d i e n te s t a b l i s h e db yt h e p l a s m am e m b r a n eh + - a t p a s eo rt o n o p l a s th + - a t p a s ea n dv 句p eh + - p p a s e n a + c o m p a r t m e n t a l i z a t i o nc a nn o to n l ya v e r tt h et o x i ce f f e c t so f n d i nt h ec y t o r i l a s mb u t a l s om a i n t a i nc e l lt u r g o ta n da l l 鼬c ct h ec a p a c i t yo f w a t e ru p t a k e a st h ed e v e l o p m e n ti np l a n tm o l e c u l a rb i o l o g ya b o u ts a l ta n dd r o u g h tt o l e r a n c e ， g r e a tp r o g r e s s e sh a v eb e e na c h i e v e di ns i g n a lt r a n s d u c t i o n , r e g u l a t i o n so f t r a n s c r i p t ， i o nh o m e o s t s s i s r o s s c a v e n g i n gs y s t e m s a n d c o m p a t i b l es o l u t e ss y n t h e s i s m e c h a n i s m si np h n te s p e c i a l l yf o ra r a b i d o p s i s h o w e v e r , a r a b i d o p s i si sa t y p i c a l g l y c o p h y t e ；i tc a n tr e v e a la l l s a l tt o l e r a n c em e c h a n i s m s ，e s p e c i a l l yf o rs o m e s p e c i a l i z e dm e c h a n i s m s i n h a l o p h y t e s s a l tc r e s s ( t h e l l u n g i e l l ah a l o p h i l a ； 6 山东大学博士学位论文 s y n o n y m o u st ot h e l l u n g i e l l as a l s u g i n e a ) ，ar e l a t i v es p e c i e so ft h ea r a b i d o p s i s ，i sa t y p i c a lh a l o p h y t ew i t hh i g hs a l tt o l e r a n c e zh a l o p h i t ap r o d u c e sn e i t h e rs a l tg l a n d s n o ro t h e rc o m p l e xm o r p h o l o g i c a la l t e r a t i o n se i t h e rb e f o r eo ra f t e rs a l ta d a p t a t i o n i t a p p e a r st h a tt h es a l t - t o l e r a n c ec o m e sf r o mi t sb a s i cb i o c h e m i c a la n dp h y s i o l o g i c a l m e c h a n i s m s ，a n ds a l tg r e s sh a sd e s i r a b l eg e n e t i ct r a i t s ：c d n as e q u e n c eh i g h l y s i m i l a rt oc d n as e q u e n c eo f a r a b i d o p s i s ，s m a l lg c n o m ea n de a s yt r a n s f o r m a t i o n , s o i tb e c o m e st h ep r o s p e c t i v es a l i n i t yt o l e r a n c em o d e lp l a n ti no u rp r e s e n tr e s e a r c h s a l t - s t r e s s e dl e a fa n dr o o te d n al i b r a r i e sa n dg e n o m i cl i b r a r yw e r ec o n s 仃u c t e d u s i n gt h a l o p h i l a a st h er e s e a r c hm a t e r i a l t w os a l t - i n d u c e dg e n e sa n d 也e i r p r o m o t e rs e q u e n c e s w c r ec l o n e df r o m t h a l o p h i l a ，a n d t h e i rf u n c t i o n sa n d e x p r e s s i o nm o d e l sw e r ef u r t h e rs t u d i e d t h ec l o n i n ga n df u n c t i o n a la n a l y s i so ft s v pg e n e a c c o r d i n gt ot h eg e n es e q u e n c eo fa v p l ，af u l l l e n g t hc d n as e q u e n c ef o r z h a l o p h i l av - t y p ei - i * - p p a s e ( t s v p ) w a sc l o n e df r o mz h a l o p h i l ae d n al i b r a r y t h i se d n as e q u e n c ei n c l u d e s2 7 5 9 b p ( a c c e s s i o nn o a y 4 3 6 5 5 3i ng e n b a n k ) c o n t a i n i n ga no p 吼r e a d i n gf l a m e ( o r f ) o f 2 3 1 6b p ，a57 u n t r a n s l a t e dr e g i o nc o t r ) o f1 0 0b pa n da3 u n t r a n s l a t e dr e g i o no f3 4 4b p t h ed e d u c e da m i n oa c i ds e q u e n c e w a s7 7 1a m i n oa c i d si nl e n g t h , c o n t a i n i n g1 4t r a n s m e m b r a n ed o m a i n sa n df i v e c o n s e r v e dd o m a i n s t h eh c t c r o l o g o u se x p r e s s i o no ft s f pg e n ei ny e a s tm u t a n e m js u p p r e s s e dn a + h y p e r s e m i t i v i t y a n dd e m o n s t r a t e dt h ef u n c t i o no ft s v pa sa nh + - p p a s e o v e r e x p r e s s i o no f 乃阡g c n ei nt o b a c c or e s u l t e di ne n h a n c e ds a l ta n dd r o u g h t t o l e r a n c e u n d e rn o - s a l ts i 托s sc o n d i t i o n s ，t h e s et r a n s g e n i ct o b a c c o sw i t hh i g h e r 殂阡e x p r e s s i o nl e v e la n dh + - p p a s eh y d r o l y s i sa c t i v i t ym a i n t a i n e dl o w e rs o l u t e p o t e n t i a l u n d e rs a l ts t r e s sc o n d i t i o n s ，l e a fd i s c sa n dt o b a c c om e s o p h y l lp r o t o p l a s t s f r o mt h e s et r a n s g e n i ct o b a c c o sp r e s e n t e dh i g h e rs a l tt o l e r a n c et h a nt h a tf r o mw t t o b a c c o s a l t h o u g ht h e s et r a n s g e n i ct o b a c c o sa c c u m u l a t e dm o r en a + i nl e a v e s ，t h e y p r e s e n t e dm o r eb i o m a s s ，l e s sm d a c o n t e n ta n dc e l lm e m b r a n ed a m a g et h a nt h o s eo f w i l dt y p e p r e s u m a b l y ，c o m p a r t m e n t a l i z a t i o no fn a + i nv a c u o l e sr e d u c e si t st o x i c e f f e c t so np l a n tc e l l s ，u n d e rd r o u g h ts t r e s s ，o v e r e x p r e s s i o no ft s v pi nt r a n s g e n i c 7 山东大学博士学位论文 t o b a c c or e s u l t e di na c c u m u l a t i o no fm o r ec o m p a t i b l es o l u t e ss u c ha ss o l u b l es u g a r a n dl o w e rs o l u t e sp o t e n t i a li nl e a v e s t h i sm a k e st r a n s g e n i ct o b a c c om a i n t a i nh i g h e r r e l a t i v ew a t e rc o n t e n t ( r w c ) a n db e t t e rc a p a c i t yo f s u r v i v i n gu n d e rd r o u g h ts t r e s s t h eh + - p p a s e sf r o mt h a l o p h i l aa n da r a b i d o p s i sh a v eh i 曲s i m i l a r i t yu pt o 9 6 i na m i l l oa c i dl e v e l f o rc o m p a r a t i v es t u d yo ft h e g e n e d ce f f e c t so fs a l t t o l e r a n c eb e t w e e n 珏叨f r o mt h a l o p h i l aa n da v p lf r o ma r a b i d o p s i s , 西纾a n d a v p lw e r eh e t e r o l o g o u s l ye x p r e s s e di ny e a s tm u t a n te n a la n d t o b a c c o ，r e s p e c t i v e l y c o m p a r i n gt h es a l tt o l e m u c eo f 始即o ra v p ly e a s tt r a n s f o r m a n t sa n dt 翔3 s g e n j c t o b a c c o ，h e t e r o l o g o u se x p r e s s i o no f t s 阡o r a w li m p r o v e ds a l tt o l e r a n c et oa l m o s t t h es a m el e v e l i ti sc o n c l u d e dt h a tt s v pa n da v p ih a v es i m i l a rb i o c h e m i c a l f u n c t i o n , h o w e v e rt h ee x p r e s s i o nm o d e l sb e t w e e n 孙纾i nz h a l o p h i l aa n da v p li n a r a b i d o p s i sa r ev e r yd i f f e r e n tu n d e rs a l ts t i - e s s e x p r e s s i o no ft s v pg e n ew a s i n d u c e db ys a l t , b u tt h e r ew e r en o td i s t i n c tc h a n g e si nt h ee x p r e s s i o nm o d e o f 4 v p l u n d e rs a l ts t r e s s t of u r t h e rs t u d yr e g u l a t i o nm e c h a n i s m so fh + - p p a s eg e n eu n d e r s a l tt o l e r a n c e t h e 如阡p r o m o t e rs e q u e n c ew a sc l o n e df r o mt h a l o p h i l ag e n o m i c l i b r a r y t h eg e n e si n t e r v a lr e g i o n sb e t w e e n 心一p p a s eg e n ea n du p s t r e a ml i n k a g e g e n e 伦t e d e f i n e d 私p r o m o t e rs e q u e n c e s o f t s p t a n d a v p lr e s p e c t i v e l y t h e s e t w o p r o m o t e rs e q u e n c e sw e r ea n a l y z e db yn s i t e - p lp r o g r a m t h en u m b e ra n dk i n do f p u t a t i v ec s - e l e m e n t sa r cv e r yd i f f e r e n tb e t w e e nt h e s et w op r o m o t e rs e q u e n c e s t h e r ea 北1 8d i f f e r e n tp u t a t i v ec s - c l e m e n t si nt h e 乃阡p r o m o t e rs e q u e n c e 。w h i l e t h e r ea r e2 7p u t a t i v ec s - e l e m e n t si na f p lp r o m o t e r , w h i c hc a ni n t e r a c tw i t h2 5 d i f f e r e n tt r a n s c r i p tf a c t o r s a m o n gt h e s ep u t a t i v ec i s - e l e m c n t s t h e r e 撒o n l ys i x o n e sp r e s e n t e di nb o t hp r o m o t e rs e q u e n c e s , w h i c hi n c l u d e sr s p 0 0 0 7 9 , r s p 0 0 3 7 7 , r s p 0 0 4 2 0 ，r s p 0 0 6 3 5 ，r s p 0 0 6 4 4a n dr s p 0 0 6 5 3 i ti sn o t i c e a b l et h a tt h e r ea 弛 s e v e r a ls t r e s sr e l a t e dc 括- e l 伽响i c se x i s t e di nn p ? p r o m o t e rb u tn o ti na v t 1 p r o m o t e r , s u c h a sr s p 0 0 0 4 9 。as t r e s sr e l a t e dc 妇l e m e n tp r e s e n ti nb a r l yl e a g e n e p r o m o t e rs e q u e n c e t h ed i f f e r e n c e b c t w e 它ut h e s et w op r o m o t e r sm i g h tp a r t l y i n t e r p r e tt h ed i f f e r e n c ei ne x p r e s s i o nm o d e lu n d e rs a l tt o l e r a n c e f u n c t i o n a la n a l y s bo ft h a l o p h i l an a + p it r a n s p o r t e rg e n e a c c o r d i n gt ot h eg e n es e q u e n c eo fa t 2 9 2 9 6 5 0 ( ap u t a t i v en a + p it r a n s p o r t e ri n 8 山东大学博士学位论文 a x a b i d o p s i s ) af u l l l e n g t he d n as e q u e n c ef o rt h a l o p h i l an a 十p it r a n s p o r t e rg e n e a n di t sp r o m o t e rs e q u e n c ew e r ec l o n e df r o mt h a l o p h i l ae d n a t h i se d n a s e q u e n c ei n c l u d e s18 9 8 b p ( e f 0 5 3 0 5 7i ng e n b a n k ) w h i c hc o n t a i n sa l lo p e nr e a d i n g f l a m e ( o r f ) o f1 5 3 3b p ，a5 u n t r a n s l a t e dr e g i o n ( u t r ) o f7 8b pa n da 3 u n t r a n s l a t e dr e g i o no f2 8 7b p t h ed e d u c e da m i n oa c i ds e q u e n c ew a s5 1 0a m i n o a c i d si nl e n g t h , c o n t a i n i n g1 0t r a n s m e m b r a n ed o m a i n s t h ep r o t e i ns e q u e n c ew a s c l o s e l yr e l a t e dt oa r a b i d o p s i sp h o s p h a t et r a n s p o r t e rf a m i l yp h t lb yb i o i n f o r m a t i c s a n a l y s i s ，l o c a t e di nc h l o r o p l a s tb ye x p r e s s i n gnt e r m i n u sg f pf u s i o np r o t e i ni n t o b a c c oc e l l s t h i sg e n ew a sm a i n l ye x p r e s s e di nl e a v e sa n di n d u c e db ys a l ta n d a b a i t sp r o m o t e rs e q u e n c ec o n t a i n ss e v e r a la b ar e l a t e dc i s - e l e m e n t s 嬲p r e d i c t e d b yn s i t e p lc i s - e l e m e n t sp r e d i c t i o np r o g r a m t of u r t h e rs t u d yt h ee x p r e s s i o n m o d e lo fn a + p i t r a n s p o r t e rg a n e i nt h a l o p h i l a ，t h en a + p it r a n s p o r t e rg e n e u p s t r e a mp r o m o t e rs e q u e n c ei n2 9 0 0 b pl e n g t hw a sc l o n e df r o mt h a l o p h i l ag e n o m i c l i b r a r y t h ep r o m o t e rs e q u e n c e sw e r ea n a l y z e db yn s i t e - p lp r o g r a m t h e r ea r e2 8 d i f f e r e n tp u t a t i v ec s e l e m e n t s ，w h i c hi n c l u d e ss e v e r a ls t r e s sr e l a t e dc s e l e m e n t s ， s u c ha sr s p 0 0 0 5 5 ( a b r ea ) ，r s p 0 0 0 5 6 ( a b r eb d ) ，r s p 0 0 0 6 5f e r a l a ) ， r s p 0 0 0 6 6 ( e m l b ) a n dr s p 0 0 0 6 7 ( a b r e