（材料学专业论文）壳聚糖及其衍生物对脂蛋白作用的研究.pdf

摘要本文制备了不同种类( o 羧甲基壳聚糖、- 亚磷酸壳聚糖、n - 1 6 ，1 8 烷基叔胺壳聚糖及口油酰化壳聚糖) ，多种相对分子质量( 6 1 0 3 、1 x 1 0 4 、3 1 0 、5 1 0 4 、1 1 0 5 及1 5 x 1 0 5 ) 的壳聚糖衍生物，考察了取代基团对其溶解性和电性的影响。采用聚丙烯酰胺电泳、血液吸附实验和圆二色谱，测试壳聚糖及其衍生物对总胆固醇( t c ) 、高密度脂蛋白( h d l ) 、低密度脂蛋白( l d l ) 和甘油三酯( t g )的影响作用。用异硫氰酸荧光素( f i t c ) 标记的水溶性壳聚糖进行了大鼠药物动力学试验，通过检测荧光强度的变化及分布，研究了壳聚糖在各组织器官中的分布以及在动物血液、粪便中的含量变化。结果表明，较低相对分子质量( 6 1 0 3 以下) 的壳聚糖可以显著吸附高脂血中l d l 和t g ，而h d l 的含量基本不变；相对分子质量小于1 1 0 4 的d 油酰化壳聚糖对l d l 有很好的选择吸附性；衍生物水溶性的改善有利于提高壳聚糖对血脂的吸附作用，t c h d l 和l d l h d l 两项指标都显著降低，并且经改性后的较大的相对分子质量( 1 1 0 5 以下) 水溶性衍生物也具备对脂蛋白的吸附作用。圆二色谱分析显示水溶性壳聚糖衍生物，特别是n - c 1 6 , 1 8 q c s ，对h d l 中表面亲水性的a 一螺旋结构的影响显著( 降低4 0 8 ) ，而油溶性d 油酰化壳聚糖则影响l d l 中伸展的伊折叠。f i t c 荧光标记壳聚糖在雄性大鼠体内的代谢缓慢，达峰时间t 咖。为1 2 h ，半衰期t1 2 为4 8 h ，相对分子质量较小的壳聚糖可以进入血液和组织器官中发挥作用，而相对分子质量较大的壳聚糖与机体的作用很可能大部分发生在胃肠道中，并最终随粪便排出。关键词：壳聚糖；衍生物；高密度脂蛋白：低密度脂蛋白；吸附a b s t r a c ti nt h i sp a p e ls e v e r a lk i n d so fc h i t o s a nd e r i v a t i v e s ( o c m c s ，n - m p c s ，c 1 6 ，1 8 q c sa n do - c l s o a c s ) w i t hd i f f e r e n tm o l e c u l a rw e i g h t s ( 6 x 1 0 3 ，1 1 0 4 ，3 1 0 4 ，5 x 1 0 4 ，1 x 1 0 5 a n d1 5 x 1 0 5 ) w e r es y n t h e s i z e da n de f f e c to f a c t i v eg r o u p so fc h i t o s a nd e r i v a t i v e so ns o l u b i l i t ya n de l e c t r i cc h a r g ec h a r a c t e r sw e r ed i s c u s s e d s d s p a g e ，b l o o da d s o r p t i o na n dc i r c u l a rd i c h r o i s m ( c d ) s p e c t r u mw e r eu s e dt oa n a l y s et h ee f f e c t so fc h i t o s a na n di t sd e r i v a t i v e so nt o t a lc h o l e s t e r o l ( t c ) h i g hd e n s i t yl i p o p r o t e i n ( h d l ) ，l o wd e n s i t yl i p o p r o t e i n ( l d l ) a n dt r i g l y c e r i d e ( t g ) 。w a t e r - s o l u b l ec h i t o s a nw i t hl 10 4m o l e c u l a rw e i g h t ( m ) ，m a r k e db yf l u o r e s c e i ni s o t h i o c y a n a t e ( f i t c ) ，w a su s e df o rp h a r m c o k i n e t i c s ( p k ) s t u d y t h eb l o o da n dd u n gp ko fs dm o u s e ，f e e d i n gb yf i t c c sc o m p l e x e ss o l u t i o n ，w e r er e s e a r c h e dt h r o u g hd e t e c t i n gt h ec h a n g eo ff l u o r e s c e n c ei n t e n s i t y f i t c - c si nm a n yv i s c e r a sw e r ea l s od e t e c t e da f t e re x p e r i m e n t t h er e s u l t ss h o wt h a tl o wm o l e c u l a rw e i g h t ( m 6 xl0 3 ) c h i t s a nc a na d s o r bl d la n dt r i g l y c e r i d e ( t g ) o b v i o u s l y , b u ta l m o s tc a n ta d s o r bh d l o - c 1 8 0 a c s ( 肘 1xl0 4 、h a st h es a m el d ls e l e c t i v i t y w a t e r - s o l u b l ec h i t o s a nd e r i v a t i v e sh a v em o r el i p o p r o t e i na d s o r p t i o n ，a st c h d la n dl d l h d la r er e d u c e da n dh i g h e rm o l e c u l a rw e i g h t ( m 1 10 ) w a t e r - s o l u b l ec h i t o s a nd e r i v a t i v e sm a yo b t a i nt h es e l e c t i v ea d s o r p t i o n t h ew a t e r - s o l u b l ec h i t o s a n se s p e c i a l l yn - c 1 6 ，is q c s ，e f f e c tt h ea h e l i xo fh d lw i t hh y d r o p h i l i cs u r f a c e ( 4 0 8 d e c l i n e ) ，b u to i l s o l u b l ec h i t o s a no - c j s o a c se f f e c t st h e , b - s h e e to f l d lo b v i o u s l y p h a r m c o k i n e t i c s ( p k ) r e s u l ts h o w st 1 1 a tt h em a r k e dc h i t o s a n ( m 3 0 。从能量角度考虑，肥胖的发生是因为能量摄入大于能量消耗导致脂肪在人体内的堆积，即所谓的营养过剩是肥胖发生的原因，相应的在肥胖治疗上都是着重于限制饮食的摄入、饮食行为矫正和身体锻炼方面。从分子基因角度考虑，脂肪细胞起着内分泌器官作用，它的数目如脂肪贮存水平通常保持恒定，但其团簇大小却与营养多少相关，该细胞尺度会对下丘脑中心发出信号控制摄取食物，从而保持脂肪组织于一定重量。这样，如果能控制脂肪细胞的合成与分泌，以l e p t i n ，a d i p s i n ，a d i p o n e d l i n ，r e s i s t i n 等物质作为信号分子，即可以控制食物摄入及能量代谢，进而解决肥胖问题。目前，科学家们正从细胞水平和分子水平探索肥胖机理，研制了一些具有代表性的新型减肥药物，利用其靶向作用寻求减肥的有效途径。减肥药物旨在减少和保持负能量平衡状态达到期望的体重。它们通常分成四类：( 1 ) 通过其对脑的作用抑制能量( 食物) 摄取降低饥饿感；( 2 ) 通过脂肪末梢、胃肠作用机理抑制脂肪吸收，减低能量摄入；( 3 ) 经末梢机理增大能量消耗；( 4 ) 刺激脂肪末梢代谢作用，降低脂肪质量或减少甘油三酯合成。目前市场上比较有代表性的是西布曲明( s i b u t r a m i n e ) 、奥利司他( o r l i s t a t )和一些苯丙胺类的交感神经兴奋剂。西布曲明可以抑制5 羟色胺和去甲肾上腺素的摄取而致厌食，在与低热量饮食、行为调节和体力活动结合时，具有较好的减肥效果；奥利司他可阻断胰腺脂酶的作用而抑制脂肪的吸收。但是国际上6第一章绪论的许多学者都对此类的药物治疗提出质疑，例如：停止治疗后，体重又会增加，长时问用药治疗的效果不够稳定，当大量使用药物时常出现严重不良反应等等。加之这类药物或存在大量毒副作用，或缺乏足够的安全性，所以其大多数已开始被美国f d a 取缔或限制使用。壳聚糖的减肥功效已被大量研究所证实，并且由于它的自身的天然性、安全性和独特的生物活性，近几年逐渐被人们认识并应用在肥胖治疗领域中。1 3 2 壳聚糖在肥胖治疗领域的应用1 3 2 i 纯壳聚糖的应用壳聚糖是自然界中迄今发现的唯一碱性多糖，已被证明对脂肪具有明显的吸附作用，并已被应用于最新的减肥产品中。在日本，壳聚糖减肥药品发展迅猛，已有成为减肥药主流的趋势。日本的几丁聚糖保健品“救多善”，1 9 9 6 年进入中国市场，一年就从中国拿走1 0 亿人民币，折合1 4 3 亿日元，是日本厚生省当年拨款的2 3 倍。1 9 9 9 年，健康产业新闻对全日本7 0 家食品店镝利药品店铺调查了主要畅销的减肥食品材料，在药店系统中位居第一的就是壳聚糖减肥药。美国f d a 对于壳聚糖作为减肥商品的评价是：壳聚糖可吸收其自身重量4 5倍的脂肪，与摄入其他天然纤维，如：木棉花、胶质、瓜尔豆、纤维素、甲壳素、角叉菜、海藻酸钠、槐豆、魔芋、刺梧桐树胶、琼脂等相比，摄入壳聚糖可以使肌体排出5 1 0 倍的脂肪。壳聚糖是一种不被消化的食用纤维，可以吸收脂肪和促进食用脂肪和胆固醇的排出 2 2 o 但并没有明确表示壳聚糖可用于有关人的减肥药品中。从胃到肠，随着p h 值的增加，壳聚糖的吸附絮凝物( 包含壳聚糖、胆汁酸和吸附的脂肪、胆固醇等) 不会进入血液中，不能被消化从而被正常排出体外。这些特点都决定了壳聚糖自身很适合人体内的减肥应用。但是，壳聚糖作为聚阳离子化合物，一般不能与中性油发生吸附反应，对脂肪物质在胃中会分解的胆固醇、甾醇、甘油三酸酯等中性油吸附能力不强；而且由于壳聚糖与脂肪不能互溶，极大地限制了壳聚糖与脂肪及脂肪酸的相互作用；再者由于壳聚糖在肠道环境中为不溶解状态，降低了对脂肪酸的吸附效率；最后单纯使用壳聚糖会引起便秘等副作用。1 3 2 2 壳聚糖复合物的应用单纯服用壳聚糖会对脂肪酸的吸附效率不高，而且容易引起便秘等副作用，因此人们开始将壳聚糖与其它具有减肥或可抑制其副作用的物质共同使用而提7第一章绪论高其对油脂的吸附能力。例如与具有特殊功效的天然产物( 芦荟、盐酸甜菜碱、维生素、烟酸等) 复合作减肥药物。我国在此方面研究较多的主要是壳聚糖与中药的复合，如与大黄、决明子、左旋肉碱、魔芋、首乌、丹参等复合来改善其减肥功效和防止并发症的能力。芦荟中包含的芦荟皂角苷可起轻度腹泻可以弥补壳聚糖导致的便秘影响【2 3 】：加入盐酸甜菜碱可以增强抗脂肪肝活性，并提高胃液酸度来促进壳聚糖在胃中的分散；加入燕麦纤维或伊葡萄糖可通过增加胆汁酸分泌来降低血清蛋白( 2 4 1 ；维生素c 与壳聚糖抑制脂肪的消化吸收有协同作用【2 5 1 ，如果在给予s d 大鼠高脂饮食的同时持续大量给予壳聚糖和维生素c 钠盐，在脂肪消化吸收受到抑制的同时，矿物质如钙离子以及脂溶性维生素e 吸收受到了抑制，其效率要比单独的壳聚糖高的多。烟酸是一种强力抗脂解药物，具有降低甘油三酯及游离脂肪酸的作用。利用壳聚糖与烟酸反应并加入一些维牛素酸如：维生素c 、叶酸、泛酸和维牛素h 等，制备减肥药，可以通过口服来降低血清中胆固醇和高密度脂蛋白的含量1 2 6 - 2 8 】。红葡萄提取物具有很高的抗氧化活性，洋蓟提取物可有效地抑制因脂肪肝引起的肝肥大及功能损伤【2 9 l 。欧蒲公英提取物可有效地激活肝、肾功能。最近日本相关专利1 3 0 j 以脱乙酰壳聚糖、红葡萄提取物、洋蓟提取物和欧蒲公英提取物在亲水性溶剂中混匀来制备减肥药，用于强化降低血胆固醇、过氧化脂质和甘油三酯，减轻体重、脂肪组织重量、应激和反弹。我国在壳聚糖减肥方面研究较多的主要是壳聚糖与中药的复合：运用壳核糖作为大黄的粘结剂与稳定剂，制成的大黄壳聚糖片能使传统中药大黄的致泻副作用大大减弱。防胖和减肥试验中明确显示大黄壳聚糖片能减轻大鼠体重，明显减少脂肪重量和脂体比，显示出良好的减肥作用【3 1 1 。决明子是一种药食两用的中药，具有降脂，改善胃肠功能的作用。将水溶性的羧甲基壳聚糖与决明子复合制成复方壳聚糖【3 2 3 3 1 ，对于内源性高胆固醇血症和由于外因胆固醇的迅速吸收或加速肝脏中胆固醇的合成所致的血清胆固醇升高均有明显抑制效果，且对高密度脂蛋白胆固醇具有显著升高作用，这对防治高脂血症和心血管病有重要意义。左旋肉碱化学名为l p 羟基一三甲基铵丁酸，是控制脂肪酸代谢的重要因子，若消耗脂肪比作燃料，那么l 肉碱则是氧气。魔芋中含有6 0 左右的葡萄甘露聚糖，为可溶性膳食纤维，具有促进肠蠕动、降压、降血糖、降低胆固醇、通便等多种生理功能。将壳聚糖、l 肉碱和魔芋三者有机配合服用，他们可以不同方式协同作用，进而达到减肥之功效，其效果比长时间服用大剂量的单一组分效果要好 3 3 】。此外，也有将亚麻油与壳聚糖复合用于减肥的报道【3 4 j 。8第一章绪论1 3 2 - 3 壳聚糖衍生物的应用国外的研究表明，还可以通过对壳聚糖进行改性，使用其衍生物来提高吸附油脂的效率。交联的d 羧甲基壳聚糖可以从乳清中吸附甘油三脂；壳聚糖能绑定一定量的脂肪酸来合成复合盐，这种壳聚糖脂肪酸复合物在被哺乳动物摄入后，将绑定多余的脂肪并排出体外。目前，壳聚糖减肥商品中销量最高的产品c h i t o s o l 就属于此类型的以壳聚糖为原料进行改性的专利产品，其公司宣称此产品受美国专利保护且已售出一百万瓶。交联的，o 羧甲基壳聚糖可以从乳清中吸附甘油- - h 旨e 35 1 。壳聚糖经戊二醛交联后再用苯丙氨酸修饰，这种吸附剂在体外对胆固醇的饱和吸附量达到5 4 7 5 m g g ：用色氨酸修饰的交联壳聚糖，当血清胆固醇总浓度为9 5 4 m m o l l 时，在3 7 下吸附1 小时，血清脂蛋白的去除率为4 6 1 ；苯丙氨酸修饰的交联壳聚糖吸附4 4 6 ，这种壳聚糖树脂可用于体外血清灌流【3 6 】。f u r d a c 3 7 j 发现壳聚糖能结合一定量的脂肪酸来合成复合盐。并称这种结合是由于壳聚糖中的自由氨基形成离子键从而获得了比通常吸附要强得多的结合效应。这种壳聚糖脂肪酸复合物在被哺乳动物摄入后，将结合多余的脂肪，这些脂肪包括甘油三酸酯、脂肪酸、胆汁酸、胆固醇和其他的固醇，而这些被结合的脂肪将被哺乳动物排出体外1 3 8 t 。许加超等人3 9 1 将定量的壳聚糖与定量的油酸，在一定的温度条件下，经高速搅拌器均化而成的高质量的壳聚糖油酸酯乳液，进行了人体试验，观察了7 8 名肥胖症患者应用壳聚糖油酸酯前后体重和血脂的变化。结果表明：- 应用了6 0 天降低体重总有效率为9 7 4 ，平均降低3 8 k g ，胆固醇、甘油三酯明显降低。另外还可以通过改变壳聚糖的形态来提高其减肥效果。例如，球状壳聚糖对血浆低密度脂蛋白及极低密度脂蛋白有较好的吸附性，可用于高质血症患者的血液灌流；珠状壳聚糖对胆固醇，甘油三脂均有明显的吸附作用，且随脱乙酰度的提高而吸附率增大【3 引。1 3 3 壳聚糖对肥胖并发症的预防治疗作用1 3 3 。1 壳聚糖对高血脂症的预防治疗作用高血脂症临床表现为总胆固醇( t c ) 、甘油三酯( t o ) 和低密度脂蛋自胆固醇( l d l c ) 升高，高密度脂蛋白胆固醇( h d l c ) 降低。壳聚糖能够降血脂的原因可能与其带正电性有关，正电性的壳聚糠和负电性的胆汁酸相结合而排出体外。实验证明壳聚糖能阻止实验性高胆固醇血症的发生【4 0 1 。壳聚糖衍生物可以通过增强生物相容性等方法使其效应有所提高。9第一章绪论壳聚糖亚油酸络盐作为动物性食物纤维，能够吸附t c 和f f a 从而能降低血清中胆固醇和甘油三酯的水平。通过药物降低t c 和油脂的方法能够有效地降低一1 1 , 脏血管疾病的发病率和死亡率1 4 1 ，有文献报道t c 每降低1 ，冠状动脉疾病发病率约降低2 t 4 2 1 。b a b i s h t 4 3 j 所制备的壳聚糖衍生物在胃肠道里吸附t g 和脂肪，壳聚糖能降低血脂尤其是降低低密度脂蛋白胆固醇。y a oh t l 删等通过对喂食含有壳聚糖的浓缩胆固醇的雄性大鼠的观察，发现其总胆固醇、低密度脂蛋白和极低密度脂蛋白胆固醇都有所降低，有良好的调血脂活性，而对低密度脂蛋白胆固醇选择性吸附的研究还需进步探讨。1 3 3 2 壳聚糖对脂肪肝的预防治疗作用脂肪肝是一种发病机理至今尚未完全明确的脂肪代谢障碍疾病，脂肪肝的形成与患者合并混合性高脂血症和高甘油三酯( t g ) 血症有关，近年来发现游离脂肪酸( f f a ) 可导致肝实质脂肪变性、肝细胞浸润、坏死凋亡及纤维化的发生。t a e1 1j e o n l 4 5 1 等采用对大鼠c c h 腹腔内注射，并予以高脂饮食复制大鼠脂肪肝动物模型，同时给予壳聚糖灌胃，证明了壳聚糖对脂肪肝的形成有一定的抵制作用。壳聚糖复合中药对脂肪肝的预防和治疗有协同作用，可通过大鼠实验研究肝组织t g 和t c 等值的变化情况来考察。何首乌等中药具有抑制肝细胞中脂肪滴沉淀，促进脂肪代谢作用。蒋莉【4 州等研究了壳聚糖加首乌、丹参和牛膝的协同效果：肝组织t g 和t c 值显著降低，其改善程度随用药剂量的增加而增加；张昭萍【4 7 】等研究表明壳聚糖添加中药治疗组，大鼠肝脏t g 、t c 、f f a 含量显著降低，肝细胞脂变程度明显减轻，降低了肝脂肪含量，对脂肪肝有明显的治疗作用。表l 一2大鼠肝体比与肝脏脂肪含最情况( x 士s )t a b l e t1 - 2r a t i oo fl i v e ra n db o d yw e i g h ta n dl i p i dc o n t e n to fl i v e r事与c o n t r o l 组相比p 0 0 5 ，与c o n t r o l 组相比p o o l1 0第一章绪论本课题组考察了所研制壳聚糖衍生物对营养性肥胖大鼠肝脏的影响：随着两种壳聚糖衍牛物添加剂量的增加，动物的肝体比同时明显下降，各剂量组肝脏胆固醇和脂肪含量均明显低于喂饲基础饲料的对照组( p 0 0 5 ) ，肝脏胆固醇含量下降4 0 - 6 0 ，肝脏脂肪含量下降3 0 - - 4 0 ( 参见表1 2 ) ；肥胖对照组大鼠肝细胞呈严重的脂肪变性，肝细胞浆内见多量大小不等的脂肪空泡，许多小的脂肪空泡融合形成大的脂滴，而壳聚糖衍生物添加组大鼠肝细胞水变性减轻，肝窦狭窄不明显，部分胞浆内仍可见脂肪空泡形成，其中高剂量添加组肝细胞未见水变性，肝窦恢复正常，细胞浆内仅见少许脂滴，脂肪变性程度明显减轻 4 8 1 。1 3 3 3 壳聚糖对糖尿病的预防治疗作用糖尿病是一种具有遗传倾向的常见的内分泌代谢疾病，高血糖状态是引起糖尿病慢性并发症的主要原因，目前还没有能完全治愈的药物。很多研究表明，壳聚糖及其衍生物具有抗氧化、降血糖、抑制脂类吸收等生物活性，从而它能够通过多种途径抑制血糖的升高，具有明显的降血糖效果，且安全性高，不产牛毒副作用，为治疗糖尿病开辟了又一途径f 4 9 1 。l o uw t 5 0 j 等制备了海藻酸壳聚糖聚乙烯乙二醇微囊化大鼠胰岛素，用来移植治疗小鼠糖尿病，发现小鼠血糖明显降低。d o u g l a sj 【5 1 】等通过喂养缺乏阿朴脂蛋白e 的小白鼠作测试，这种高胆固醇的动物在没有食物和外界干涉的情况下发展成动脉硬化，然后给高胆固醇和动脉硬化的小白鼠提供壳聚糖食品，喂养含5 壳聚糖的食品2 0 周后，小白鼠血胆固醇水平显著降低。胰岛素( i n s ) 是一种广泛用于糖尿病治疗的药物。壳聚糖生物粘附性、正电荷性和亲水性使其对i n s 具有良好促吸收作用，提高胰岛素的相对生物利用率，壳聚糖包覆脂质体能够降低胰蛋白酶对胰岛素的消化力，增强胰岛素的肠吸收【5 2 1 。x i a n f a n gz e n g 5 3 等将琥珀酰基壳聚糖膜和聚丁二烯酸( p a b ) 共混成膜，这种共混壳聚糖膜能够通过很好的吸附效应粗制胰岛素而得到净化产品。z e n g s h u a nm a 5 4 等通过离子凝胶法精制壳聚糖一胰岛素微球，一定剂量下其能够有效的降低链脲霉素诱导糖尿病大鼠的血清葡萄糖水平，研究口服壳聚糖一胰岛素微球药理学活性，共焦显微镜照片表明，在3 h 后治疗大鼠的肠内上皮细胞和壳聚糖微球问有强交互作用。现已发现，游离脂肪酸( f f a ) 的代谢水平在具有胰岛素抵抗和高胰岛素血症的疾病发病过程中起到非常重要的作用，f f a 水平增高既可增加胰岛素抵抗，又可引起高胰岛素血症和型糖尿病，通过降低f f a 水平来改善糖代谢的降糖药物的研究尚不多。壳聚糖可通过氨基的静电桥联作用吸附f f a ，t a it s 等 5 5 1 发发现壳聚糖通过对血浆脂蛋白的作用而对胰岛素非依赖型糖尿病产生影响。第一章绪论综上所述，血液中胆固醇浓度是预测心脏病，高血压，动脉硬化和脑血栓的临床诊断其症状的基本参数 5 们，而壳聚糖具有降低血胆固醇的功效，因而其对心脑血管疾病有积极的影响；并可降低t c 水平而明显改善心血管疾病患者的死亡率。壳聚糖在心脑血管疾病方面应用还有待进一步研究。1 4 用于肥胖治疗壳聚糖衍生物的研究进展单纯使用壳聚糖作为药物虽然在肥胖及其相关领域的取得了有效的成果，但是也存在着不少缺点，如壳聚糖作为聚阳离子化合物，对脂肪物质在胃中会分解的胆固醇、甾醇、甘油三酸酯等中性脂质吸附能力不强：壳聚糖在肠道环境中为不溶解状态，降低了其对脂肪酸的吸附效率【57 i 。通过对壳聚瓣进行改性，利用其衍生物来减肥和相关疾病方面的治疗的尝试，具有很积极的意义。衍生化的目的在于改善壳聚糖溶解性，同时不削弱其聚阳离子性能，提高其与脂肪、脂肪酸( 包括油酸、亚油酸、棕榈油、硬脂酸等) 、其他脂质以及胆汁酸( 胆酸、脱氧胆酸、石胆酸) 的结合能力，可以通过以下三个衍牛化方向得以实现。1 4 1 水溶性壳聚糖衍生物壳聚糖分子结构规整，存在分子内、分子间氢键，易于结晶，导致水溶性差。如果破坏这种规整度，削弱了氢键，使其结晶度下降，便具有一定的溶解性。实验证明可以通过接枝亲水性基团的方法来提高其水溶性。其分子链上有大量的活泼基团n i l 2 和o h ，从而可通过- 酰基化、- 烷基化、羧基化、d - 羟基化、d烃基化、硫酸酯化、季铵化等多种化学改性反应增强其水溶性应用性能。 5 8 1 也可以通过超声波、化学、辐射、酶催化等方法降解得到水溶性良好的低聚糖。水溶性壳聚糖具有良好的亲水性、生物适应性、生物降解性和生物粘附性，能延长药物在吸收部位的滞留时间而提高生物利用度，它还能通过与带负电的细胞膜相互作用而增加亲水性大分子细胞旁路的通透性，促进亲水性大分子药物的吸收。吴雁等f 5 9 】通过壳聚糖烷基化反应合成了二乙胺乙基壳聚糖，二甲铵乙基壳聚糖及二乙基甲基铵乙基壳聚糖，在体外测定了水溶性壳聚糖及其衍牛物对胆酸盐( 牛磺胆酸钠和甘氨胆酸钠) 的结合能力及其影响因素。结果表明，水溶性壳聚糖结合胆酸盐的能力主要取决于其阳离子化程度，修饰后的壳聚糖结合胆酸盐的能力增强，说明引入更多的氨基或铵基有利于对胆酸盐的结合；方波【6 0 】等通过制备研究磺化羟丙基壳聚糖凝胶对脂蛋白的吸附性能，发现磺化羟丙基壳聚糖凝胶具1 2第一章绪论有良好的选择吸附性能，是一种新型低密度脂蛋白吸附剂。可使血浆总胆固醇下降3 5 - - 一6 0 ，低密度脂蛋白和极低密度脂蛋白下降6 0 - - - 9 0 ，而高密度脂蛋白无显著变化。研究发现相对分子质量低于1 万的壳聚糖其功能性质和生理活性更有其独特之处。在抑制肿瘤细胞生长，降低血压、血糖、血脂，吸附胆固醇等方面有较好的功效【6 1 1 。s u g a n o 报道相对分子质量在2 0 0 0 以上有降血脂作用，相对分子质量为5 0 0 0 时降胆固醇能力很强【6 2 1 。1 4 2 油溶性壳聚糖衍生物油溶性壳聚糖衍生物溶于有机溶剂，可与人体内的油脂发生作用，增进其减肥功用，并吸收胆固醇与脂肪酸，更有利于达到降低体内血胆脂醇过多、降低高血压得功效。对于壳聚糖难溶于有机溶剂的原因较为普遍的看法是乙酰氨基或( - 乙酰) d 。葡萄糖残基中的主氨基与羟基通过分子间和分子内氢键形成强硬的结晶结构。所以大多数对于壳聚糖的改性丰要是针对氨基，通过移除其上的两个氢原子，引入一些憎水性基团或在羟基上引入长链分子或大基团来破坏内部结晶结构，如：将壳聚糖氨基上的氢用较长侧链和柔性单元取代目u 可破坏壳聚糠紧密的结晶结构，从而增加其油溶性。z o n g ，z 等通过将壳聚糖与己酰氯、癸酰氯、月桂酰的氯化物反应制得一系列酰化壳聚糖衍生物【6 引。这些酰化壳聚糖在氯仿、苯、嘧啶、t h f ( i 四氢呋喃) 等有机溶液中均有很好的溶解性。对不周长度的酰化基团壳聚糖衍生物的结构研究表明：每个单糖单元中的n h 2 和o h 都可进行酰( 酯)化反应；在油溶性增加的同时，壳聚糖的热稳定性由于氢键的破坏而有所降低。h i r a n o ，s h i g e h i r o 等也制备了乙酰化、丙酰化直到硬脂酸酰化各种碳链长度的壳聚糖衍生物【5 1 。甲基磷酸壳聚糖【6 6 】在d m f 和嘧啶中可形成高粘度溶胶，在丙酮、乙醇中可形成低粘度溶胶，但不溶于d m s 0 。除油溶性的提高外，磷酸基团的引入也为壳聚糖增添了许多新的特性，如二磷酸对钙离子有很强的亲和作用可用于调节钙的新陈代谢，此衍生物可望在生物医学方面有特殊应用。而且此反应虽然将磷酸基团接在了氨基上，影响了氨基对重金属离子进行螯合，但由于磷酸基团以p 0 3 二的形式存在，衍生物同样具有强的金属离子螯合性。1 4 3 两亲性壳聚糖衍生物壳聚糖上可同时接枝上具有亲水性和疏水性的基团，从而具有水油两亲性第一亭绪论质，可以降低溶液的表面张力，并在溶液中形成胶束，起到降低表面张力、增稠、乳化和增溶等作用。g a m z a z a d e ，a i 。| 6 7 - 6 8 等人制备了壳聚糖盐酸盐和硫酸右旋糖酐钠的聚电解质复合物，此两种多糖分子都为半刚性链，但它们的电荷相反。研究表明此聚合电解质复合物在尿素存在的条件下有很强的静电性，复合物溶液的浊度和稳定性对p h 值和加入的低分子量盐的性质有明显的依赖性。此聚合电解质复合物可溶解于水、脲的水溶液，和水油混合物中。m a n s u ry a l p a n i 】等在室温用含有羰基的糖对壳聚糖进行还原性烷基化( 如：醛、酮、脂类糖) ( 每个氨基己醣残基对应1 1 1 6 7 m o l 糖) ，使壳聚糖与亲水性残基( 乳糖) 和憎水性残基反应，制成的壳聚糖衍生物在水中和有机介质中均可溶解。这一过程也可应用于非糖残基，如：脂肪族、芳香醛和酮类与壳聚糖的反应，他们也制备了环己酮和多种邻羟基苯醛类衍牛物。将乳糖和丙醛以l ：1 3 的比例混合制备还原性烷基壳聚精衍生物，获得了水溶性衍生物，且此衍牛物与几种有机溶剂完全相溶，包括：丙酮、醚、乙醇和氯仿。这种方法的优点是简单，且其溶解性可以调节，如通过改变取代基中疏水性基团的种类或疏水性基团与亲水性基团的比例都可调节其在水中或有机溶剂中的溶解性。1 5 论文工作的提出及研究意义本课题组承担国家自然科学基金项目“天然多糖与肥胖相关生物因子的相互作用研究，5 0 6 7 3 0 7 4 ”，旨在选用安全性好的脂肪族官能化合物对天然产物壳聚糖进行结构修饰，同时保留其吡喃糖环上的胺基，合成系列o 壳聚糖衍生物，即采用保护氨基脱保护氨基的壳聚糖定位化学反应技术，对壳聚糖c 6 位o h 基进行改性制备水溶性、油溶性和水、油两溶性壳聚糖衍生物；通过对溶解性的改进，不同程度地增强壳聚糖对脂肪、胆固醇和脂蛋白等的吸附能力。此衍生物的制备方法已申请国家发明专利3 项，授权2 项( z l 2 0 0 4 1 0 0 1 9 9 5 9 6 和2 0 0 4 1 0 0 1 9 9 6 0 9 ) 。水溶性使壳聚糖更容易和胆汁酸结合并全部排出体外，为了保持胆汁酸正常含量就必须在肝脏中将胆固醇转化胆汁酸，其结果是血液中的胆固醇含量必然下降，从而使其具有显著地减肥功能；油溶性使壳聚糖对油脂不是简单的吸附，而是使其溶解于壳聚糖衍生物之中，即可极大程度的提高壳聚糖对于油脂的吸收效率。而且，水或油溶性地提高，使壳聚糖吡哺糖环上的氨基对多种疾病的治疗作用在人体内更易得以充分发挥，势必会带动壳聚糖类药物研究的深入发展，对充1 4第一章绪论分发挥天然药物的优势、从天然产物中筛选先导化合物进行结构修饰、简化与合成的研究有一定的指导作用。本课题组将以上衍牛物用于大鼠的肥胖治疗与预防试验结果显示：实验6 周后大鼠体重明显降低，比对照组下降1 8 - 4 0 ，体脂含量下降4 0 8 0 ：动物的肝体比同时明显下降，肝脏胆固醇含量下将4 0 6 0 ，肝脏脂肪含量下降3 0 - 4 0 ；营养性肥胖大鼠粪便中脂肪含量明显增加，高剂量组大鼠粪脂含量与对照相比增加2 0 4 0 ；肥胖对照组大鼠肝细胞呈严重的脂肪变性，而壳聚糖衍生物高剂量添加组大鼠肝细胞未见水变性，肝窦恢复正常，细胞浆内仅见少许脂滴，脂肪变性程度明显减轻。壳聚稀衍生物具有降低血糖、升高血清胰岛素水平的作用，与高脂饲料组相比较，壳聚糖衍生物能够降低体内瘦素的水平。但这些壳聚糖衍生物如何吸附脂肪和胆固醇，如何抑帛1 。m 。肪的积累和胆固醇的吸收? 如何与体内胆汁酸结合并排出体外，而促使肝脏中胆固醇转化胆汁酸，进而达到降低胆固醇的目的? 如何吸附血液中脂蛋白而降低血脂水平? 这些深入的减肥机制研究还十分缺乏。另外，进入体内的壳聚糖及其衍生物在组织、器官中吸收和分布情况如何?不同种类、分子量的壳聚糖及其衍牛物是否有不同的分布和作用? 对脂肪、血液、肝、肾等组织器官中细胞活力有无影响? 对这些问题的研究可以更深入地了解壳聚糖应用于肥胖治疗的机制。鉴于此，本论文拟深入研究壳聚糖及其衍生物与脂蛋白的作用关系研究，观察其在组织、器官中的吸收和分布，初步探讨其治疗肥胖的作用机制，为设计出更具针对性的、更具减肥功效的壳聚糖及其衍生物提供理论支持；这种针对性的设计还要结合高选择活性来考虑，要求壳聚糖衍生物在发挥降血脂功能时，就必须具备多吸附低密度脂蛋白、少吸附高密度脂蛋白的选择活性。为此确定研究内容如下：( 1 ) 制备不同相对分子质量( 6 1 0 3 、l 1 0 4 、3 x 1 0 4 、5 x 1 0 4 、1 1 0 5 及1 5 1 0 ) 、不同取代基团( o c m c s 、n - m p c s 、n - c 1 6 ，1 8 q c s 、o - c 9 q a c s ) 的壳聚糖衍生物，评价它们的各种理化性能。( 2 ) 通过壳聚糖及其各种衍生物与脂蛋白( h d l 、l d l 、t c 及t g ) 作用关系研究，评价其的作用效果，总结作用规律，探讨壳聚及其衍生物与脂蛋白作用的原理。( 3 ) 通过观察标记过的壳聚糖在动物血液代谢情况以及进入体内后在器官组织中的分吸收布情况，初步探讨壳聚糖在体内的代谢方式途径。第二章壳聚糖衍生物与脂蛋广1 的作用2 1 引言第二章壳聚糖衍生物与脂蛋白的作用本章采用多种蛋白质检测手段( 蛋白质电泳、血脂吸附实验、圆二色谱) ，从多角度( 定性、定量、定型) 深入地研究壳聚糖及其衍生物与重要肥胖因子( 脂蛋白) 的作用关系。在分子水平( 蛋白质水平) 上探讨了壳聚糖及其衍生物的与脂蛋白的作用机理。2 2 实验部分2 2 1 实验材料及仪器表2 1 主要壳聚糖原料n 出1 e2 2m a i nm a t e r i a l s1 6第章壳聚糖衍生物与脂蛋白的作用表2 2 主要实验仪器t a b l e2 1m a i ne x p e r i m e n ti n s t r u m e n t主要仪器厂家透析袋( 进口分装) ，截留分子量3 5 0 0 、1 4 0 0 0冷冻干燥机l g j 一1 0 旋转蒸发仪p h s - - 2 c 型精密酸度计z e t ap o t e n t i a l 分析仪d y c z - 2 4 d 型双垂直电泳槽u v - 2 0 0 0 紫外分光光度计h z q x 1 0 0 振荡培养箱t g l 一1 6 、t g l 1 6 g 犁高速台式离心机超速离心机j - 7 1 5 和j - 8 1 0 型圆二色谱仪上海绿鸟科技发展有限公司军事医学科学院实验仪器所上海申生科技有限公司上海雷磁仪器厂b r o o k h a v e ni n s t r u m e n t sc o r p o r a t i o n北京六一仪器厂尤尼柯( 上海) 仪器有限公司天津市医药净化设备厂上海医用分析仪器厂日立公司j a s c o 公司2 2 2 制备方法2 2 - 2 1d 羧甲基壳聚糖( o c m c s ) 的制备将1 0 9 壳聚糖与l o o m l 4 0 的n a o h 溶液加入5 0 0 m l 的四口烧瓶中冰水浴搅拌3 h 使壳聚糖粉末充分溶胀：取 0 92 一氯乙酸，溶解于1 0 m l 异丙醇，滴加到反应体系中。反应1 2 h 后，用l m o l l 浓h c l 调节反应物至p h = 7 ，过滤。透析三天、冷冻干燥得到o 一羧甲基壳聚糖。 ohn h 2c l c h 2 c o o ho 小 _ l 卜2 2 。2 。2n - 1 6 ，1 8 烷基二甲基叔胺壳聚糖( n - c 1 6 ，1 8 q c s ) 的制备n h 2( 1 ) 环氧丙基- 二甲基1 6 ，1 8 烷基氯化铵的制备以异丙醇一水( 体积比为1 ：1 ) 混合溶剂为反应介质，1 6 ，1 8 烷基二甲基叔胺与环氧氯丙烷( 投料摩尔l l l ：3 ) 在4 0 - 一4 5 c 下反应3h ，减压蒸去溶剂，用乙醚1 7第_ 章壳聚糖衍生物与脂蛋f ， 的作用洗涤除去未反应物，得环氧丙基一二甲基1 6 ，1 8 烷基氯化铵。反应过程如下：h ：一邺，+ h ：一旷辫旷犯h 2 ) i n c h 3( c h 2 ) m c h 3( 2 ) ( 2 一羟基一3 - 二甲基1 6 ，1 8 烷基铵基) 丙基壳聚糖( c 1 6 1 8 q c s ) 的制备在1 0 9 壳聚糖中加入4 0 的n a o h 溶液，搅拌均匀，而后加入1 5 m l 异丙醇，缓慢加入上述反应所得黄色蜡状固体，加热条件下反应一段时问。用盐酸调p h = 7 ，分别用乙醇过滤、洗涤，冷冻干燥。反应过程如下式：n ，、ohn h 2。一+ 邺一o c h c 垆c y 二h 3 c 邺i 一( c h 2 ) m c h 3i 卜，、n ，、oho - r 、nr 、h 坚彳旱。一hw 3一心沪h o r 洲2 雩洲3 a2 2 2 3 - 亚磷酸壳聚糖( n - m p c s ) 的制备h c h oo , n n x i 卜叭oi - 1 2 0h+hh。，酽电o hh 2 o 步p c 。h 。hh ：rn ho 小hohj f li 一一多一塑第_ 章壳聚糖衍生物与脂蛋门的作用壳聚糖以2 ( w v ) 比例溶解于1 ( v v ) 冰醋酸，室温下向其中持续l h 滴加定量的一定浓度亚磷酸水溶液；然后反应温度升到7 0 c ，滴加定量的含量为3 6 5 的甲醛溶液1 h ，回流反应2 4 h 。透析，浓缩，冷冻干燥。2 2 2 4o 一油酰化壳聚糖( o c 1 8 0 a c s ) 的制备1 ) 油酰氯的制备将1 5 0 m l 油酸加热至1 0 0 c ，保持0 5 h 进行预处理。在5 0 0 m l 三口烧瓶内加入处理好的油酸，加热至6 0 c 恒温，开动搅拌器控制转速( 0 0 0 r r a i n ) ，加入5 0 m l 三氯化磷，然后升温至6 5 左右，反应约2 h 。反应完毕后，冷却至窀温，得浅黄色液体及黄色胶状固体。倾出黄色液体注入棕色磨口瓶内用石蜡密封，置于干燥处备用。o。picioh 。一些一( c h 2 ) 7 一舀= c h 一( c h 2 ) 7 一c h 3 j l c i c i i 一( c h 2 ) 7 一c = h ( c h 2 ) 7 一c h 32 ) 油酰化壳聚糖衍生物( d c 1 8 0 a c s ) 的制备n h 2c h 3 s o a ho o x r o v - | oi ihc i c o 一( c h 2 ) 7 c = c 。( c h 2 ) ，一cn h 3 f 1 2 0卜，、，、 oho1 9n h 2。( c h 2 ) - ：1 c h ab 一舀= h ：) ，一c h 。o o v v 、-第二章壳聚糖衍生物与脂蛋门的作用在三口烧瓶中加入l o g 壳聚糖和一定量的甲磺酸，在搅拌3 0 m i n ，使壳聚糖充分溶解，然后加入5 9 油酰氯，在0 冰浴中继续反应一定时间，反应完成后，将三口瓶在0 * c 以下静置过夜。取出加人大量丙酮使接枝产物沉淀出来，向体系中加入氨水进行多次中和并抽滤，将滤饼甲醇，乙醇洗多次再抽虑，放人真空烘箱进行干燥后粉碎，得到接枝产物。2 2 3 表征与性能测试2 2 3 1 红外光谱测试采用固体样品k b r 压片法，用b i o r a df t s1 3 5 傅立叶红外光谱仪测定上述所制备的壳聚糖衍生物的红外光谱。2 ，2 3 。2 溶解性测试( 1 ) 水溶性分别称取壳聚糖及其衍生物各0 2 9 于5 0 m l 烧杯中，在室温下分次加入定量蒸馏水，搅拌后观察其溶解情况。( 2 ) 有机溶剂溶解性测试精确称取1 0 m ld m s o 、c c h 、c h c l 3 、t h f 、d m f 、d m a c 、花生油、芝麻油、油酸等分别置于2 5 m l 锥形瓶中，恒温3 79 c ，逐次加入壳聚糖及其衍生物各0 0 5 9 ，置于振荡培养箱中振荡溶解，并观察记录溶液状态。2 2 3 3z e t a 电位和p h 值用b r o o k h a ve ni n s t r u m e n t sc o r p o r a t i o ni 拘z e t ap o t e n t i a l 分析仪对壳聚糖及其水溶性衍生物溶液的电荷进行了测定。使电极浸入所取的5 - 6 m l1 样品溶液中，测试其z e t a 电位，三次取平均值。2 2 4 壳聚糖及其衍生物与脂蛋白作用电泳实验2 2 4 1 电泳用试剂的配制( 见附录1 )2 2 4 2 聚丙烯酰胺电泳( s d s p a g e )装好电泳装置，按表2 3 中所列体积灌制分离胶和积层胶。在2 0 m l 烧杯中按表中顺序依次加入并混匀，迅速加入胶板问，水封，因为加完t e m e d 后聚合反应立即开始，待分离胶凝固后，约3 0 m i n 倒去上部双蒸水，按表中顺序配好积层胶灌注至胶板问，插入干净的t e f l o n 梳子，确保无气泡，约3 0 r a i n 凝固待用。第= 章壳聚糖衍生物与脂蛋臼的作用表2 - 3 聚丙烯酰胺凝胶配制t a b l e2 - 3p r e p a r e t i o no fs d s - p a g e待测样品与s d s 凝胶加样缓冲液以i ：1 比例混合，1 0 0 煮沸3 m i n ，使蛋白质充分变性。取出梳子，向电泳槽中加入砀卜甘氨酸电泳缓冲液，用微量加样器从加样孔底部加入1 5 u j 上样样品，撕去胶条，接通电源，开始电泳，积层胶部分使用6 0 m a 电流，分离胶部分使用8 5 m a 电流。约2 h 后样品所示蓝色移动到分离胶底部，切断电源，取下玻璃板，将电泳后的胶放入2 考马斯亮蓝染色液中置于脱色摇床上室温染色4 h ，然后换成脱色液在脱色摇床上脱色4 8 小时，其问换脱色液三四次，脱色后水中保存，成像并分析实验结果。2 2 5 壳聚糖及其衍生物对血清脂蛋白吸附实验2 2 5 1 血浆脂蛋白的分离与纯化1 ) 血浆的预处理在3 7 水浴中3 0 r a i n 将正常人新鲜冷冻血浆解冻后，加入o ，5 的e d t a n a 2 抗凝，再加入l m m o l l 的n a n 3 ：4 ，1 2 0 0 0 r m i n 离心3 0 r a i n ，去除上层乳糜微粒( c m ) 后备用。2 ) 调整血浆密度及配制密度梯度液用固体溴化钠( n a b r ) 调整血浆密度至1 4 0 0 9 m l ；用含0 0 1 e d t a n a 2的双蒸水和溴化钠配成1 2 0 0 9 m l 的梯度液；用含0 ，0 1 e d t a - n a 2 的双蒸水和氯化钠配成1 0 0 6 9 m l 的梯度液。在电子天平上校正密度。3 ) 分离纯化脂蛋白( 1 ) 一次性超速离心提纯脂蛋白4 个离心管分别加入1 0 m l 密度为1 4 0 0 9 m l 的血浆，上面覆盖5 m l 密度1 2 0 0 9 m l 的n a b r 梯度液，再铺上1 7 4 m l 氯化钠配成1 0 0 6 9 m l 的梯度液。离心条件为4 c ，4 8 0 0 0 r m i n ，5 5 h 。为避免搅动梯度界面，采用慢加速程序启动，2 l第一二章壳聚糖衍生物与脂蛋f j 的作用慢减速程序停机。离心结束后，从每管上部明黄色带取富集的l d l 溶液2 m l ，从管中部取浅黄色带h d l 约3