（细胞生物学专业论文）组蛋白乙酰化修饰调控果蝇热休克基因表达和寿命的分子机制研究.pdf

摘要 衰老是一个普遍的生物学现象，衰老控制着生物寿命的长短，主要受遗传因子和 环境因素所影响。了解衰老的分子机制，对于延缓衰老、保持生命活力具有重要的意 义。 热休克蛋白( h s p ) 作为高度保守的“分子伴侣”，在细胞内广泛地参与许多复 杂的功能活动，可以抵制衰老过程中一些有害蛋白的发生。其基因的表达调控是一种 特殊的真核基因表达模式，包括基础水平和诱导水平的表达。 由组蛋白乙酰转移酶( h a t ) 和组蛋白去乙酰化酶( h d a c ) 催化的乙酰化反应 在真核基因的表达调控中起着重要作用，这两种酶通过对核心组蛋白进行可逆修饰来 调节核心组蛋白的乙酰化水平，从而调控转录的起始与延伸。组蛋白去乙酰化酶抑制 剂( h d i ) 可以通过抑制h d a c 活性提高组蛋白乙酰化水平，是研究乙酰化修饰在真 核基因表达调控中的作用的有用工具。 本论文一方面采用h d it r i c h o s t a t i na ( m o p s ：称取l o 3 9m o p s 溶于5 0 m l 的4 0 0 m mn a a c 中，用2 mn a o h 调 p h 至7 0 ，然后加5 m l 的0 5 me d t a ( p h8 0 ) ，用d e p c - - 水定容至5 0 0 m l ，室 温闭光保存。 1 0 x l o a d i n gb u f f e r ：称0 1 2 5 9 溴酚兰溶于2 5 m l 甘油和1 0 0 9 le d t a 中，双蒸 水定容至5 0 m l ，加o 2 d e p c ，次日高压。 2 0 m l1 2 的变性琼脂糖凝胶：称取0 2 4 9 琼脂糖溶于1 2 6 m ld e p c - - t k ， 加热使其彻底熔化，然后加入3 4 m l 甲醛和4 m l5 m o p s ，混匀，铺胶板。 r n a 样品电泳前处理 r n a 4 5 9 l 5 x m o p s2 l 甲醛 3 5 9 l 甲酰氨l o u l 4n 6 5 。c 加热1 5m i n ，冰上冷却，高速离心5s e c 后加2 1 a ll o a d i n g b u f f e r 上样电泳。 6 逆转录p c r ( r t - p c r ) 逆转录反应是用p r o m e g a 公司的r e v e r s et r a n s c r i p t i o ns y s t e m 试剂盒在p c r 仪进 行的，具体操作如下： 6 1 逆转录反应( r e v e r s et r a n s c r i p t i o n ，l i t ) 加总r n a 至e p p e n d o r f 管中，7 0 | 。c 1 0 分钟，高速离心5 秒后置于冰上，目的是 打开r n a 的二级结构； 按下列顺序在一新管中加入以下药品( 2 0 9 l 体系) m g c l 2 ，2 5 m m4 肛 r e v e r s et r a n s c r i p t i o nl o x b u f f e r2 9 l d n t p m i x t u r e ，1 0 m m2 皿 r e c o m b i n a n tr n a s i nr i b o n u c l e a s ei n h i b i t o r o 5 9 l a m vr e v e r s e t r a n s c r i p t a s e2 5 u g l l5 u ( o 6 l ) o l i g o ( d t ) 1 5 或r a n d o mp r i m e r s ( o 5 1 x g g l )0 5 肛g ( 1 l ) 崽眦 z 9 9 b l 用无核酶的水j 2 0 i _ t l a 、当用o l i g o ( d t ) 1 5 作为逆转录引物时，4 2 * ( 2 孵育1 5 m i n ( 为了获得更长或更充 分的转录本，4 2 孵育可延长至l h ) ： b 、当用随机引物作为逆转录引物时，2 5 放置1 0 m i n 后再进行4 2 。c 逆转录反应。 2 5 。c 的目的是允许引物延伸，这样当温度升高至4 2 。c 时，它们仍保持杂交状态； 9 5 。c ，5m i n 后0 - 5 5m i n ，使逆转录酶失活，防止它与c d n a 结合； 将逆转录所得c d n a 稀释5 倍( 加双蒸水至1 0 0 t l ) 以用作p c r 反应模板。 6 2 p c r 反应 根据果蝇h s p t o 、h s p 2 2 、h s p 2 6 和r p 4 9 基因，使用p r i m e r5 0 设计如下引物： h s p 7 0 ：s e n s e # m e n5 a g c c g t g e c a g g t t t g 5 a n t i - s e n s ep r i m e r ：5 c g t t c g c c c t c a t a c a3 h s p 2 2 ：s e n s ep r i m e r ：5 e t t t c a c g c e t t c t t c c3 a n t i - s e n s ep n m e r ：5 7 g c g g t t t t g t c t t t t g g3 h s p 2 6 ： s e n s ep r i m e r 5 c a g g t t t t g g c t t t g e g3 a n t i s e n s ep r i m e r ：5 c c t t g c c g t t g g g t g c t3 r p 4 9 ： s e n s ep r i m e r ：5 a g c a c t t c a t c c g c c a c c3 a n t i s e n s ep r i m e r ：5 a t c t c g c c g c a g t a a a e g3 41 按以下顺序在无菌的p c r 管中添加试剂，进行p c r 反应( 2 5p l 体系) 1 0g m p r i m e r1 ( 劝 1 0j a m p r i m e r 2 ( h s p ) 1 0j a m p r i m e r1 ( r p 4 9 ) 1 0b t m p r i m e r 2 ( r p 4 9 ) c d n a p r e m i x t a q 酶 h 2 0 1l l l 1 u l 0 5 9 l 0 5l l l 5 u l 1 2 5 i t 1 4 5 u l 2 5 9 l p c r 条件：9 4 l m i n 一9 4 3 0 s 一5 0 1 m i n 一7 2 1 m i n 一7 2 5 m i n 一4 ，从第二步至第四步2 4 个循环。 7 。定量r e a l t i m e p c r r e a lt i m ep c r 一般有两种检测系统：荧光探针检测系统和荧光染料掺入检测系 统。本实验所使用的是荧光染料掺入检测系统。 7 1r e a l t i m ep c r 反应 使用以上p c r ( 6 2p c r 反应) 反应所用引物和模板，在a b ip r i s i v l 国7 0 0 0 荧 光定量p c r 仪上进行r e a lt i m ep c r ，对h s p 基因的m r n a 表达水平精确定量。按 以下顺序在透光性强的9 6 孔板( 购自a b i 公司) 中添加试剂( 5 0 9 l 体系) 1 0g m p r i m e r1 1 u l 1 0g m p r i m e r 2 1 p l 1 0 s y b r g r e e n p c r b u f f e r 5 9 l 2 5 m m m g c l 26 9 l d n t p ( 2 5 m md a t p , d c t e , d g t p , 5 0 m mdutp、4pl a m p l it a qg o l d ( 5 u p 1 ) o 2 5 9 l a m p e r a s eu n g ( 1 u 9 1 ) 0 5 9 l e d n a d d h 2 0f 3 2 2 5 t t l 5 0 9 l p c r 条件：5 0 。c2 m i n 一9 5 。c1 0 m i n 一9 5 v1 5 s e e 一6 0 。c l m i n 第三步至 第四步进行4 0 个循环。 7 2 数据分析 在p c r 反应中，每一扩增循环的产物作为下一个循环的底物从而使产物呈指数 42 增长。但随着循环数的增加，由于模板数的增加，引物量的降低以及t a q 酶活性的 下降等原因，扩增效率下降出现平台效应，因此只有线性范围内的循环数才能真实 反应模板量的多少。根据荧光信号反映出来的p c r 扩增曲线，在线性增长范围内界 定个域值( t h r e s h o l d ) ，此域值与扩增曲线的交点所对应的循环数称为c t 值。我们 采用2 。c 方法3 0 6 】来分析数据，此方法是一种方便的分析基因相对表达量的方法。 a c t = c t 目i 目一c t $ a a c t = a c t # * - - a c t 目 例如，在本实验中，h s p 作为目的基因，核糖体蛋白4 9 ( 果蝇内的一种持家基因r p 4 9 ) 作为内部参照。无任何处理的样品为对照，h d i 处理和或热激诱导的样品为样品。 h s p t o r e a l t i m e 扩增c t 值对照为2 0 ，热激后为1 6 ：r p 4 9 r e a l t i m e 扩增c t 值对 照为】7 ，热激后为1 7 。则 a c t # = 1 6 1 7 = 一1 ： c tw 月= 2 0 一1 7 = 4 a a c t = 1 4 = 一5 2 蛐= 2 5 = 3 2 说明果蝇热激诱导后其h s p 7 0 的表达量升高了3 2 倍。 8 果蝇全蛋白及核蛋白的提取 8 1 全蛋白的提取 8 1 1 试剂的配制 e 1 a b u f f e r ( p h7 o ) 5 0 m l 2 5 0 m mn a c l 0 ，7 3 5 9 5 0 m m h e p e s0 5 9 5 8 9 0 1 n p - 4 0 5 0 1 1 1 5 0 m mn a f 0 ，1 0 5 9 5 m me d t a 0 5 m lo 5 me d t a 母液 细胞裂解液( c d l l y s i sb u f f e r , d h8 o )1 0 0 m l 1 0 m mt r i s c i l m l1 m 母液 5 0 r a m 亚硫酸钠 0 6 3 0 2 9 l t r i t o n x 一1 0 0 l m l 1 0 m m m g c l 2 0 2 0 3 3 9 86蔗糖869 8 1 2 实验操作 取2 0 0 m g 冻存的果蝇材料放入匀浆器，加入l m l e 1 a b u f f e r 、1 0 9 11 m p m s f 冰上匀浆； 尼龙网过滤，除去不能破碎的几丁质物质； 冰浴3 0 m i n ： 43 2 0 0 0 0g ，4 ，离心1 0 r a i n ，弃上清； 加入l o o p 1 细胞裂解液和1 1 1 m 的p m s f 重悬沉淀； 超声打破基因组d n a ，7 0 w3 0 s e c ，间隔冷却2 m i n 后重复一次( 整个过程样品 保持在冰水混合物上) ，冻存待用。 8 2 核蛋白的提取 8 2 1 试剂配制 e 1 a b u f f e r ( p h7 0 ) 同上 细胞裂解液( c e l ll y s i sb u f f e r , p h8 0 ) 同上 t r i s e d t a ( p h 7 。4 ) l o o m l 1o m mt r i s c 1l m l1 m t r i s 母液 13 r a me d t a2 6 m lo 5 me d t a 母液 核裂解液( p n8 8 ) 5 0 m mt r i s c l 3 0 0 m mn a c l 1 n p 一4 0 l m me d t a 1 r a m d i t h i o t h r e i t o l 巾t r ) 1g g m l l e u p e p t i n 2 9 9 m la n t i p a i n 2 9 9 m la p r o t i n i n l m mp m s f 8 2 2 实验操作 一步同以上全蛋白的提取 加l m l l y s i sb u f f e r 重悬沉淀，5 0 0 0 r p m4 c ，离心5m i n ，弃上清； 用l m l l y s i sb u f f e r 加o 2 n p 一4 0 重悬沉淀，5 0 0 0 r p m4 c ，离心5r a i n ，弃上清； 重复步骤两次； 用l m l t r i s e d t a 重悬沉淀，5 0 0 0 r p m4 v ，离心5m i n ，弃上清； 加4 0 0 r 1 核裂解液重悬沉淀，冰上放置4 0r a i n 以上 超声打破基因组d n a ，7 0 w 3 0 s e c ，间隔冷却2 m i n 后重复一次( 整个过程样品 保持在冰水混合物上) ，冻存待用。 9 s d s - p a g e 电泳和w e s t e r n b l o t t i n g 分析 9 1s d s p a g e 电泳 9 1 1 试剂配制 分离胶缓冲液：t 5 mn i s - h c l ( d h 8 8 ) 浓缩胶缓冲液：o 5 m t r i s h c i ( p h 6 8 ) l o ( w v ) s d s 44 1 0 ( w v ) 过硫酸铵 3 0 丙烯酰胺溶液 四甲基乙二氨( t e m e d ) 电极缓冲液：1 8 8 克甘氨酸，3 0 2 克t r i s ，1 0 m l1 0 s d s ，定容至1 0 0 0 m l 脱色液：1 0 m l 冰乙酸，4 5 m l 甲醇，4 5 m ld h 2 0 染色液：0 2 5 9 考马斯亮蓝r 2 5 0 溶于1 0 0 m e 脱色液 2 x 样品缓冲液 9 1 2 实验步骤 取1 s p a 样品，加1 5 9 1 2 x 上样缓冲液，混合均匀，沸水煮1 2 m i r a 2 0 0 0 0 9 ，离心3 0 m i n i 取2 0 z l 上清上样； 使用b i o r a d 稳压稳流多功能电泳仪，电压：浓缩胶8 0 v ，分离胶1 0 0 v ； 电泳结束后，切除浓缩胶，分离胶用于转膜。 9 2w e s t e r nb l o t t i n g 分析 9 2 1 试剂配制 转移b u f f e r ( 1 0 0 0 m l ) ：3 0 2 8 9t r i s ，1 5 0 1 4 9g l y ，2 0 0 m l 甲醇 1 0 x t b s ( p h 7 6 ) 5 0 0 m l ：1 2 1 9 i r i s ，4 0 9 n a c l t b s t ：1 0 t b s ( p h 7 6 ) 稀释1 0 倍后，加入1 1 0 0 0 体积的t w e e n 一2 0 b l o c k i n g b u f f e r ( 1 0 m l ) ：o 5 9 脱脂奶粉，l m l1 0 x t b s ，1 0 9 lt w e e n 一2 0 抗体稀释液( 1 0 m l ) ：o 5 9 b s a ，l m l1 0 t b s ，1 0 1 a lt w e e n 一2 0 底物溶液：4 r a g a e c ，o 5 m l 二甲基甲酰胺，1 0 r a l o 0 5 m n a a c ，2 5 p l3 0 h 2 0 2 新鲜现配 丽春红染液：p o n c e a u s0 5 9 ，1 0 水杨酸，d h 2 0 定容至1 0 0 m l 9 2 2 实验步骤 蛋白质从s d s p a g e 凝胶转移至硝纤膜，常规配置转移b u f f e r ，冰浴下1 0 0 v 转 移4 h ( 胶冲阴极，膜冲阳极) ； 用丽春红染液对转印后的硝纤膜进行可逆染色。将膜放入丽春红s 染液中瞬间， 流水脱色，如转膜成功，可见蛋白带出现； 转移成功的硝纤膜置于t b st b u f f e r 中冲洗2 3 次，转入b l o c k i n g b u f f e r3 7 轻 摇l h 或4 。c 过夜； 加入抗体稀释液稀释至工作浓度的一抗溶液，3 7 轻摇l h ，t b s t 沈三次，5 1 0 m i n 次； 加入抗体稀释液稀释至工作浓度的二抗溶液，3 7 。c 轻摇l h ，t b s t 洗三次，5 1 0 i n j i l 次： 将膜放入底物溶液中l o t 5 r a i n 可见印迹信号： 用d h 2 0 洗膜，终止反应。 45 二、结果与分析 ( 一) 实验条件的确定 1 r t - p c r 反应中模板浓度的确定 r t - p c r 的半定量特征与模板浓度有关，模板浓度在一个合适的范围内，才能使 得到的终产物正确反应出r t 时所加的r n a 数量。为了确保本实验中p c r 扩增得到 的终产物正确反应基因表达的m r n a 量。我们利用h s p 7 0 基因在3 7 。c 热激诱导的情 况下可以迅速大量表达的特征，设定对照和热激诱导两组样品，分别用2 0 l a g 、1 0 p g 和1 l a g 的总r n a 量进行逆转录反应，然后用h s p 7 0 和内参r p 4 9 的引物进行p c r 反 应，确定出可以正确反应m r n a 表达量的起始总r n a ，结果显示只有在总r n a 为1 嵋 的条件下，我们可以检测到h s p 7 0 明显的热诱导现象( 图2 1 ) ，而过量的总r n a 可 能干涉了p c r 反应，增加了一些非特异性表达，使其不能正确反映模板与产物问的 正向关系。 图2 1 不同模板浓度下的r t - p c r 产物 1 、2 0 u gr n a 模板无热激2 、2 0 i j t gr n a 模板3 7 。c 热激3 0 m i n 3 、1 0 9 t g r n a 模板无热激4 、1 0 1 t g r n a 模扳3 7 。c 热激3 0 m i n 5 、1 t g r n a 模板无热激6 、l g g r n a 模板 3 7 。c 热激3 0 r a i n 2 r t - p c r 反应循环数的确定 r t - p c r 的半定量特征也与p c r 反应的循环数有关。在p c r 反应中，每一个扩 增循环的产物作为下一个循环的底物，从而使产物呈指数增长。但实际上经过一定数 量的循环，由于模板数的增加，t a q 酶活性的降低等原因，扩增效率会随着循环数的 增加而下降，出现平台效应。所以，找到c d n a 量与终产物呈线性关系的循环数是决 定r t - p c r 敏感性的关键。 为了确保在本实验中，m r n a 的表达量与得到的p c r 产物之间呈线性关系，我 们在同一模板条件下，以每三个循环为间隔，设立了不同循环数( 1 5 、1 8 、2 1 、2 4 、 2 7 、3 0 ) 的r t - p c r 反应来确定使m r n a 表达量与得到的p c r 产物呈线性关系的循 环数。图2 2 是在同一模板浓度( 5 “1 ) 下进行的不同循环数的r t - p c r 反应结果。从 中我们可以看出在此浓度下，不同的目的基因( h s p 2 2 、h s p 2 6 、h s p 7 0 ) 到达平台期 46 的循环数不同， 印羽到达平台期最晚，在3 0 个循环以内p c r 产物量与模板量之间 均呈线性关系； 印2 6 和a 印7 d 到达平台期较快，它们在2 7 个循环数以内p c r 产物 量与模板量之间均呈线性关系。这可能与果蝇体内 印羽的表达量相对较低相关。因 此，在以下的实验中，我们将采用2 4 个循环作为合适的循环数。 图2 2 同一模板浓度不同循环数下的r t - p c r 产物 a ：却扣基因的r t - p c r 产物b ：如口6 基因的r t - p c r 产物c ： 印7 0 基因的r t - p c r 产物 】、3 0 个循环的r t - p c r 产物2 、2 7 个循环的r t - p c r 产物3 、2 4 个循环的r t - p c r 产物 4 、2 1 个循环的r t - p c r 产物5 、1 8 个循环的r t - p c r 产物6 、1 5 个循环的r t - p c r 产物 3 果蝇温和热激诱导温度的确定 果蝇一般在室温( 2 0 2 5 ) 下生长状态较好，温度过高或过低都严重影响了果 蝇的生长和发育，甚至导致不育。高温可诱导h s p 的表达，而上述文献已经表明h s p 的表达在果蝇衰老过程中起着积极的作用。因此，寻找可以诱导h s p 表达，同时又 尽可能的降低高温对果蝇的损伤的温度条件是我们进行温和热激诱导的关键。果蝇在 2 5 条件下正常生长，其寿命可达7 0 8 0 天，而在2 9 条件也可存活，但寿命只有 3 0 天左右，并且导致严重不育。可是在2 9 条件下是否可诱导h s p 的表达还不明确， 所以，我们设定了温度梯度( 2 5 、2 9 、3 1 、3 3 、3 5 、3 7 ) ，将羽化6 天 的果蝇成虫在相应温度下热激1h 后提取总r n a ，通过r t - p c r 反应检测船p 基因在 不同温度下的诱导情况，确定既可明显诱导h s p 表达又最低限度的减少了对果蝇损 伤的温度条件。 结果如图2 3 所示，2 9 w 条# y 砖p 不能被诱导，3 l 条件下，h s p 2 2 和 印2 6 可被明显诱导，而矗甲7 d 诱导表达不明显，在3 3 条件下可被明显诱导。因此，在 47 以下的实验中，我们将采用3 2 作为温和热激诱导的温度条件，诱导时间为l h ， 研究重复性温和热激诱导对2 5 条件下生长的果蝇寿命的影响，以及相应的h s p 的 表达情况。 图2 3 果蝇不同诱导温度条件下h s p 基因的表达情况 a ：h s p 2 2 不同温度下的诱导表达情况 1 、2 5 。c 对照2 、d l 2 0 0 0 d n a 分子m a k e r3 - 6 、分别为2 9 。c 、3 l 、3 3 、3 5 和3 7 。c 诱导 b ：h s p 2 6 不同温度下的诱导表达情况 1 、2 5 对照2 、d l 2 0 0 0d n a 分子m a k e r 3 - 6 、分别为2 9 、3 l 、3 3 、3 5 和3 7 诱导 c ：h s p 7 0 不同温度下的诱导表达情况 1 、2 5 对照2 5 、分别为2 9 、3 l 、3 3 、3 5 。c u3 7 诱导6 、d l 2 0 0 0 d n a 分子m a k e r ( 二) 果蝇长寿品系和短寿品系的筛选 果蝇寿命的长短主要受遗传因子和环境因素两个方面所影响，而来自于同一雌蝇 的后代组成的果蝇品系称为单雌系，其遗传背景相同。即使是同一物种，其个体寿命 也不尽相同，因此我们使用单雌系来研究h d i 以及热激处理对寿命的影响，可以避 免个体问遗传背景的不同造成的实验误差。根据个体间遗传背景的不同，建立寿命不 同的果蝇单雌系，统计它们的寿命，从中筛选出寿命最长的品系i s 0 2 作为长寿品系， 寿命最短的品系i s 0 4 作为短寿品系。绘制寿命生长曲线，统计它们的最大寿命和平 均寿命，计算寿命差异，结果如图2 4 所示。长寿果蝇在正常生活条件( 2 5 ) 下最 大寿命为7 3 天，平均寿命为4 5 5 3 天，短寿果蝇在正常生活条件下晟大寿命为6 2 天， 平均寿命为3 8 4 7 天。两个品系之间的寿命差异显著( p 0 0 1 ) 。 48 1 2 0 1 0 0 訾8 0 彗6 0 囊霹。 小 翔 0 母辩泽诤巾d a y s 图2 42 5 条件下果蝇的存活曲线图 i s 0 2 ：长寿品系，其最大寿命为7 3 天，平均寿命4 5 5 3 天 i s 0 4 ：短寿品系，其晟大寿命为6 2 天，平均寿命3 8 4 7 大。 数据显示的是4 次实验的平均值标准差。 横坐标代表了果蝇的存活天数，纵坐标代表的是果蝇存活率 ( 三) 热休克蛋白的表达与果蝇寿命的关系 1 不同寿命的果蝇衰老过程中h s p 基因基础表达的差异 我们采用r t - p c r 和定量r e a l t i m e p c r 在长寿品系和短寿品系的果蝇中分析了 果蝇衰老过程中h s p 基因的表达水平。图2 5 a 显示的是h s p 2 2 和h s p 7 0 的r t - p c r 琼 脂糖凝胶电泳图，对其进行光密度分析，绘制直方图显示如图2 5 b 。从中我们不难 看出，在衰老过程中，随着果蝇年龄的增长，其体内h s p 2 2 和h s p 7 0 的基础表达量呈 下降的趋势，并且这种下降的趋势在长寿果蝇中比在短寿果蝇中明显。比较h s p 2 2 和 h s p 7 0 基因在长短寿果蝇品系间表达的差异，我们可以发现，长寿的果蝇体内h s p 2 2 和h s p 7 0 的表达量高于短寿果蝇体内h s p 的表达量，并且这种差异在年轻果蝇中比较 明显( 图2 5 ) 。 另一方面，我们比较不同的h s p 基因在两种品系的表达差异发现，h s p 2 2 在不同 寿命的果蝇品系间的表达差异比较明显，h s p 7 0 次之，而h s p 2 6 在两个品系间几乎没 有差异( 图2 6 ) ，并且从图2 6 我们还可以看出h s p 2 6 在果蝇衰老过程的基础表达量 是几乎不变的，进而说明了不同的h s p 与寿命调控的密切关系不尽相同，h s p 2 2 最为 重要，h s p 7 0 次之，而h s p 2 6 的表达与寿命调控几乎无关。 49 l 。s o ) 麓 毫 l 豁0 。5 a 毒 0 i s 0 2 i 8 0 4i s 0 2l & 0 4 h 举 妇 姆 图2 5 果蝇衰老过程中| i 印基因在长短寿品系间基础表达的差异 a ：h s p 2 2 和h 。p t or t - p c r 产物凝胶电泳图b ：凝胶电泳后光密度分析结果直方图 a 图中左侧箭头显示了h s p 2 2 ， 印7 d 和r p 4 9r t - - p c r 产物电泳带，6 和3 0 表示的 是果蝇取材时的年龄天数。b 图中横坐标表示果蝇品系和h s p 基因种类，i s 0 2 为长寿 果蝇，i s 0 4 为短寿果蝇。纵坐标表示h s p 基因与r p 4 9m r n a 表达量的比值。数值显 示的是三次独立实验室的平均值。 为了进一步证实h s p 2 2 和h s p 7 0 基因在果蝇衰老过程中的相关作用，我们以上面 r t p c r 所用的e d n a 为模板，采用s y b r g r e e n 荧光染料在a b i7 0 0 0 荧光定量p c r 仪上进行了实时定量p c r ( r e a l t i m eq u a n t i t a t i v e p c r ) ，结果显示在图2 7 。从图中我 们可以看出，r e a l t i m e r t p c r 结果与r t p c r 结果是完全一致的，妒2 2 和h s p 7 0 确实在果蝇衰老过程中呈下降趋势，并且在长寿品系中的表达量高于短寿品系。 b 1 5口6d a y s 一3 0d a y s 卜_ i 舢 簪1,2蜢r0 i s 0 2 图2 7 果蝇衰老过程中j l 印基因基础表达差异的r e a lt i m ep c r 结果 a ：h s p 2 2r e a lt i m ep e r 结果图b ：h s p 7 0 r e a lt i m ep c r 结果图 数据显示的是3 次独立实验的平均值标准差 2 不同寿命的果蝇h s p 基因热诱导反应灵敏度和诱导强度的差异 果蝇个体之间寿命存在着差异，前面的实验已经证实h s p 基因在不同寿命的果蝇 中基础表达不同。我们推测h s p 与寿命的关系一方面表现在它的基础表达水平，另 一方面还可能与它们对热胁迫反应的灵敏度和诱导强度有关，因此，我们将长短寿分 51 别3 7 。c 热激诱导不同时间，利用r t - p c r 技术检测不同的h s p 基因( h s p 2 2 、h s p 2 6 、 h s p 7 0 ) 对热胁迫反应灵敏度和诱导强度的不同。结果如图2 _ 8 和图2 9 所示，h s p 2 2 和h s p 7 0 基因的热反应灵敏度和热诱导强度在果蝇寿命间存在着差异，而h s p 2 6 基因 的诱导表达几乎与寿命的长短无关。长寿果蝇对热胁迫反应比较敏感，热激2 分钟时， h s p 2 2 和h s p 7 0 的表达可迅速升高，而短寿果蝇热激5 分钟时才可检测到明显的热诱 导( 图2 8 ) ；但就热激的诱导强度而言，短寿果蝇中h s p 基因的诱导强度较大，在 3 7 热激4 0 分钟时，长寿果蝇中h s p 2 2 的诱导倍数为5 9 倍，而短寿果蝇中h s p 2 2 的诱导倍数可达1 0 1 倍。 图2 8h s p 基因在果蝇不同品系中热激诱导的差异 a ：h s p 2 2 和h s p 7 0r t - p c r 产物凝胶电泳图b ：凝胶电泳后光密度分析结果直方图 a 图中左侧箭头显示了h s p 2 2 ，h 印7 d 和r p 4 9 r t - - p c r 产物电泳带；泳道1 6 分别代 表了3 7 。c 热激诱导0 分钟、2 分钟、5 分钟、1 0 分钟、2 0 分钟和4 0 分钟后的r t - - p c r 电泳结果。b 图中横坐标表示果蝇品系l ua p 基因讨类，纵坐标表示砖p 基囡与r p 4 9 m r n a 表达量的比值；数值显示的是三次独立实验室的平均值标准差，$ 表示相对 于对照，h s p 2 2 在3 7 。c 热激诱导4 0 分钟时具有5 , 9 倍的诱导，# 表示相对于对照，h , w 2 2 在3 7 热激诱导4 0 分钟时具有1 0 ，1 倍的诱导。 同时，比较矗印基因在不同寿命的果蝇中的诱导表达的灵敏度可以发现，h s p 2 2 的诱导表达差异比较明显，h s p 7 0 次之，而h s p 2 6 几乎没有差异( 图2 9 ) ；并且只有 52 h s p 2 2 基因在不同寿命的果蝇品系中其诱导表达的强度存在差异( 图2 8 ；图2 9 ) 。 这一结论与h s p 基因在果蝇衰老过程中基础表达的差异是一致的，进一步说明了不同 的热休克蛋白与寿命的相关度不同，h s p 2 2 的表达与寿命联系密切，h s p 7 0 次之，h s p 2 6 的表达几乎与寿命长短无关。 i s 0 2is 0 4 图2 9 h s p 2 6 在果蝇不同品系中的热激诱导 a ：h s p 2 6 r t - p c r 产物凝胶电泳图b ：凝胶电泳后光密度分析结果直方图 a 图中左侧箭头显示了h s p 2 6 和r p 4 9 r t - - p c r 产物电泳带；泳道0 、2 、8 、 1 5 和3 0 分别代表了3 7 c 热激诱导0 分钟、2 分钟、8 分钟、1 5 分钟、和3 0 分钟后的r t - - p c r 电泳结果。b 图中横坐标表示果蝇品系，纵坐标表示h s p 2 6 与r p 4 9m r n a 表达量的比值；数值显示的是三次独立实验室的平均值标 准差。 同样，为了进一步证实h s p 2 2 和h s p 7 0 基因在果蝇不同品系热诱导反应的灵敏度 和诱导强度的差异，我们采用s y b rg r e e n 荧光染料在a b i7 0 0 0 荧光定量p c r 仪上 进行了r e a lt i m eq u a n t i t a t i v ep c r 。结果如图2 1 0 所示，h s p 2 2 和h s p 7 0 确实在长寿果 蝇中对热诱导反应灵敏，但热诱导强度较低，与r t p c r 结果相一致，只有h s p 2 2 基因在热激4 0 分钟时的诱导倍数差异显著( 图2 1 0 ) 。 m 。m ，m 毗眦孙坫 2 5 l 5 0 1 0 b at星。n盆墨 a 1 l 1 0 0 藿 鼋 轴 n 0 毋毋蒂带爷 爷蒂爷梦爷爹 图2 1 0h s p 基因在不同寿命的果蝇品系中热诱导的差异 a ：h s p 2 2r e a lt i m ep c r 结果图b ：h s p 7 0 r e a lt i m ep c r 结果图 数据显示的是3 次独立实验的平均值标准差；$ 表示相对于对照，诱导倍数 为8 0 倍，# 表示相对于对照，诱导倍数为1 3 0 倍；”表示相对于对照，诱导 表达差异显著( p o 0 1 ) 。 3 不同寿命的果蝇耐热能力的差异 以上结果显示在不同寿命的果蝇品系中，其热休克基因的基础表达和诱导表达均 不相同，说明h s p 在果蝇的衰老过程中具有重要作用。然后我们进一步检测了不同 寿命的果蝇其耐高温能力的差异，将羽化6 天的年轻果蝇置于3 7 。c 下，统计果蝇在 高温条件的死亡率，绘制死亡曲线。如图2 1 1 所示，长寿果蝇耐热能力较强强，3 7 。c 高温条件下l 小时以后习出现快速死亡现象，而短寿品系的果蝇，在3 7 。c 条件下3 0 分钟之内的死亡率就比较高( 图2 1 1 ) 。 0s 06 0l z 0m l n 图2 1 1 果蝇在”高温条件下的死亡率 横坐标0 、3 0 、6 0 和1 2 0 分别表示了果蝇置于3 7 。c 高温条件下的时 间点0 分钟、3 0 分钟、6 0 分钟和1 2 0 分钟；纵坐标代表了果蝇死亡 率。实验独立进行3 次，每次统计果蝇数1 0 0 只。 54 悝旧馐矗懂旧咀缸喝温 瓣姒 憎圳 。 梅n ，。，。l 狮 瑚瑚 钔 o b d 基耋巷量搴p 。n 轷工j辅嚯馐咀 温萎n 血 篓 叫 ： 副 抛 的 柏 即 o 舀g 惜摹 ( 四) 组蛋白乙酰化修饰以及热激诱导与果蝇寿命的关系 在这部分实验中，我们主要采用了组蛋白去乙酰化酶抑制剂( h d i ) t s a 和b u a 喂食果蝇，并辅以热激诱导，检测了不同的处理方式对果蝇体内组蛋白乙酰化水平的 影响以及组蛋白乙酰化水平的改变对果蝇寿命的影响。为了比较全面的了解h d i 抑 制剂处理和热激诱导对乙酰化水平的改变和寿命的影响，我们设计了不同组合的处理 方式，包括h d i 一次性处理( o t s a 和o b u a ) ，h d i 连续性处理( c t s a 和c b u a ) ， 3 7 一次性高温诱导( h s ) ，3 2 重复性温和热激诱导( r m h s ) 以及连续性h d i 和 热激诱导共同处理( t s a r m h s 和b u a r m h s ) 。 1 h i ) i 处理和热激诱导对果蝇体内组蛋白乙酰化水平的影响 t s a 和b u a 是两种常见的h d i ，它们在哺乳动物细胞中可以通过竞争性或非竞 争性地抑制去乙酰化酶活性而导致核心组蛋白h 3 和h 4 的高乙酰化状态1 8 酣。它 们在果蝇体内对核心组蛋白乙酰化水平的影响还未见报道。我们在h d i 喂食和热激 诱导处理后，提取果蝇核蛋白，利用抗乙酰化组蛋白h 3 、h 4 的抗体进行w e s t e r n b l o t t i n g 检测组蛋白h 3 、h 4 乙酰化水平的变化。结果如图2 1 2 所示，乙酰化组蛋白 h 3 的阳性带被检测到( 图2 ，1 2 a 和图2 1 2 b ) ，对其进行光密度分析，分析结果显示 在图2 1 2 c 。 从图中我们可以看出t s a 和b u a 处理在长短寿果蝇中均提高了组蛋白h 3 的乙 酰化水平。一次性t s a 和b u a 处理( o t s a 和o + b u a ) 只是适量地提高了长短寿果 蝇中组蛋白h 3 的乙酰化水平( p o ，0 5 ) ，连续性t s a 处理( c t s a ) 可以显著的提高 长短寿果蝇中组蛋白h 3 乙酰化的水平( p 0 叭) ，而连续性b u a 处理( c + b u a ) 则显 著提高了短寿果蝇中组蛋白h 3 乙酰化的水平( p 0 0 1 ) ，适量提高了长寿果蝇中组蛋 白h 3 乙酰化的水平( p 0 0 5 ) 。同时，热激诱导也对组蛋白h 3 的乙酰化水平有所影 响，重复性温和热激( r m h s ) 显著提高了组蛋白h 3 的乙酰化水平。当h d i 和r m h s 协同处理时，它们对组蛋白h 3 乙酰化水平的提高程度有所升高( p o 0 1 ) 。然而这些 处理方式却不影响组蛋白h 4 的乙酰化水平( 数据未显示) 。 2 h d i 处理和热激诱导对果蝇寿命长短的影响 以上实验证实了h d i 喂食果蝇可以增强其体内组蛋白h 3 的乙酰化水平，接下来 我们继续研究了h d i 诱导的组蛋白h 3 乙酰化水平的变化对果蝇寿命的影响，同时也 探讨了热激诱导在果蝎衰老过程中的作用。 结果如图2 1 3 所示，重复性温和热激诱导( r m h s ) 延长了果蝇的平均寿命和最 大寿命，但在不同的果蝇品系中，其寿命延长的程度不尽相同( 图2 1 3a 和e ) 。对 长寿果蝇而言，其最大寿命只是稍微增加了5 6 ，平均寿命适当增加了1 0 3 ；而 对短寿果蝇而言，其最大寿命可以适当增加11 5 ，平均寿命显著增加2 5 8 。但 次性热激( h s ) 对于长短寿果蝇的寿命几乎都没有影响( 图2 1 3a 和e ) 。 s5 e2 鏊 0 5 0i 三西曲。矗。请曲曲，酋。 梦萝鬻梦嗲 图2 1 2h d i 处理和热激诱导引起组蛋白h 3 的超乙酰化 a ：长寿果蝇中组蛋白h 3 乙酰化( a c h 3 ) 的w e s t e r nb l o t s 分析图b ：短寿 果蝇中a c h 3 的w e s t e r nb l o t s 分析图 c ：a 和b 光密度分析结果直方图 a 和b 图中上面的条带是内参a c t i n 的印迹结果，下面的条带是a c h 3 的印迹 结果。数值显示3 次独立实验的平均值4 - 标准差。+ 表示差异显著( p 0 0 5 ) ， # 表示差异极显著( d o 0 1 ) c o n ，无任何处理的对照：h s ，3 7 c 一次性热激诱导；r m h s ，3 2 。c 重复性温 和热激诱导：o t s a ，一次性t s a 处理；c t s a ，连续性t s a 处理：t s a r m h s ， 连续性t s a 处理加温和热激诱导；o b u a ，一次性b u a 处理；c b u a ，连续 性b o a 处理；b o a - r m h s ，连续性b o a 处理加温和热激诱导： 56 从图2 1 3b 和f 可以看出，h d it s a 处理在不同品系的果蝇中可以不同程度地 延长寿命。在长寿果蝇中，一次性t s a 处理( o t s a ) 处理对其平均寿命和最大寿命 都没有没有明显的影响；连续性t s a 处理仅仅延长了平均寿命的1 5 6 ( 图2 1 3b ) 。 在短寿果蝇中，o t s a 处理即可延长平均寿命的5 ，c t s a 处理对平均寿命和最大 寿命都有所延长，分别达到2 4 4 和1 6 4 ( 图2 1 3f ) 。 图2 1 3 c 和g 的数据显示h d ib u a 处理仅影响短寿果蝇的寿命，一次性b u a 处 理可以延长其平均寿命2 5 8 ，最大寿命1 1 5 。当b u a 被连续喂食至寿命终结时， b u a 引起寿命延长变得不在明显，由图2 1 3g 中c b u a 的存活曲线可以看出b u a 处 理前期，与对照果蝇相比，死亡速率缓慢，寿命有一定的延长趋势，随着衰老的进行， 死亡速率有所增加，寿命具有缩短的趋势，总体来说，c b u a 处理不再影响果蝇的寿 命。 另外，当r m h s 和h d i 同时处理果蝇时，h d i 的作用变得不再明显，和单独的 r m h s 处理效果相似( 图2 1 3 d 和h ) 。 。母巾巾0 母0 巾o o 女d a y 。带母一母p 巾, 妒d a y s 1 2 0 1 0 0 一 皇8 0 6 0 摹4 0 2 0 0 乜母母母p 夸p 巾 d a y。母母p 牵p 巾# d a y 图2 1 3 r d i 处理和热激诱导对果蝇寿命的影响 蜘 0 一日al装 印 柏 加 0 1 1 0 0 罩8 0 6 0 誉4 0 2 0 0 1 1 0 0 高8 0 邑 童6 0 帕 摹4 0 2 0 0 1 2 0 1 0 0 鼍8 0 6 0 美4 0 2 0 0 q 母母母p 爪, d a yq 母巾伊p 母p , x q d a y 8 1 2 0 1 0 0 熏8 0 i 6 0 装4 0 2